結(jié)核分枝桿菌Erp蛋白PGLTS的4基序突變體的構(gòu)建

郝秀靜　馬超　李敏

摘要：以結(jié)核分枝桿菌H37Ra DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增，獲得靶基因erp片段。采用重疊延伸PCR的方法得到erp基因PGLTS的4基序的突變體，依次刪除突變體的C-末端、N-末端和C/N-端，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-C4、pET28a-N4、pET28a-CN4，轉(zhuǎn)化BL21（DE3）pLysS。對(duì)重組菌株IPTG誘導(dǎo)后的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Tricine SDS-PAGE，得到大小分別約為11.2、15.4、4.8 ku的目的蛋白。Western blotting分析結(jié)果表明，目的蛋白表達(dá)特異。

關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌；重復(fù)輸出蛋白；重疊延伸PCR；PGLTS；原核表達(dá)

中圖分類號(hào)：S855.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0031-03

牛結(jié)核病是影響?zhàn)B牛業(yè)最為嚴(yán)重的疫病之一，且該病為人畜共患傳染病，既造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失還嚴(yán)重威脅著人類健康，其主要致病菌為牛結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）[1]。重復(fù)輸出蛋白（exported repeated protein，ERP）是牛結(jié)核分枝桿菌上的一個(gè)重要毒力因子[2]，別稱P36、Pirg或Rv3810，它是一種分泌蛋白，存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體所有成員（結(jié)核分枝桿菌、牛型結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌、卡介苗和田鼠分枝桿菌）中[3]，而在其他細(xì)菌種內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)同族體，使得Erp成為結(jié)核分枝桿菌家族的一個(gè)特異信號(hào)分子。ERP蛋白全長(zhǎng)為284個(gè)氨基酸，由3個(gè)不同區(qū)域組成，其中1～22個(gè)氨基酸是信號(hào)肽序列，中心是基于PGLTS基序的12個(gè)重復(fù)區(qū)[4]，N-末端結(jié)構(gòu)域（氨基酸1～80）和C-末端結(jié)構(gòu)域（氨基酸176～284）高度保守。N-末端含有運(yùn)送Erp通過質(zhì)膜的信號(hào)肽序列，由22個(gè)氨基酸組成，帶正電荷的堿性氨基酸（尤其是精氨酸和賴氨酸）含量較為豐富，對(duì)于蛋白質(zhì)定位和導(dǎo)肽序列識(shí)別有一定作用[5-6]。C-末端富含疏水性氨基酸，可能與膜骨架網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞質(zhì)膜之間的連接有關(guān)，Kocincova等證實(shí)Erp蛋白疏水性 C-末端的作用——將Erp錨定在細(xì)菌表面[7]。中間是PGLTS重復(fù)區(qū)，它的重復(fù)區(qū)具有一定的可變性，如麻風(fēng)分枝桿菌的PGLTS 重復(fù)區(qū)是4基序、牛結(jié)核分枝桿菌是12基序、而恥垢分枝桿菌是21基序[5]。為研究 Erp 的 PGLTS 區(qū)基序變化以及C-端、N-端與功能的關(guān)系，本研究通過查詢GeneBank中erp基因序列，以結(jié)核分枝桿菌H37Ra DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增，獲得靶基因erp片段。采用重疊延伸PCR的策略，得到含4基序的PGLTS突變體及基序 C-端、N-端和 C/N-端缺失突變體并構(gòu)建到原核表達(dá)載體中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，為以后進(jìn)一步深入研究其基序變化以及C端、N端功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

結(jié)核分枝桿菌H37Ra、大腸桿菌DH（5α）和質(zhì)粒pET28a（+）由西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，MD18-T Vector、BL21（DE3）pLysSp購自Transgene公司。

1.2 試劑與儀器

限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ、KpnⅠ、XhoⅠ，T4 DNA連接酶和Wizard PCR preps DNA Purification System為Promerga公司產(chǎn)品；Taq PCR MasterMix試劑盒、Pfu PCR MasterMix試劑盒、HRP-DAB底物顯色試劑盒、D2000等DNA marker、100 ku 等預(yù)染蛋白質(zhì)marker為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；IPTG、X-Gal、氯霉素、氨芐青霉素購自Sigma公司；胰化蛋白胨（tryptone）、酵母提取物（yeast extract）為OXOID產(chǎn)品；氨基乙酸（甘氨酸）、瓊脂粉等化學(xué)試劑為索萊寶公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計(jì)

利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)的引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，主要包括：

其中，小寫字母表示保護(hù)性堿基，下劃線表示酶切位點(diǎn)，長(zhǎng)引物PN1表示在5′端加上Erp信號(hào)肽序列。

1.4 野生型erp序列擴(kuò)增

以結(jié)核分枝桿菌H37Ra基因組DNA為模板，引物EP1、EP2擴(kuò)增erp。50.0 μL反應(yīng)體系包括20 ng/μL DNA 1.0 μL、10 mol/L上游引物2.0 μL、10 mol/L下游引物 2.0 μL、2×Taq PCR MasterMix 25.0 μL、ddH2O 20.0 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性1 min，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min 20 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 7 min。反應(yīng)產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 ERP 4基序突變體的構(gòu)建

1.5.1 ERP 6基序突變體的構(gòu)建 利用重疊延伸技術(shù)，以EP1、EP3和EP2、EP4為引物，以重組質(zhì)粒pMD18-T-E為模板，依次經(jīng)過第1、第2輪PCR擴(kuò)增得到erp 6個(gè)基序的突變體片段，連接到pMD18-T載體上，命名為pMD18-T-6。

1.5.2 ERP 4基序全長(zhǎng)突變體的構(gòu)建 利用重疊延伸技術(shù)，以EP1、EP5和EP2、EP6為引物，以重組質(zhì)粒pMD18-T-6為模板，依次經(jīng)過第1輪、第2輪PCR擴(kuò)增得到erp 4基序的序列片段。

1.6 4 基序缺失突變體的表達(dá)載體構(gòu)建 以EP7、PN1、PN2、PC、EP8為引物，以pMD18-T-4為模板，擴(kuò)增erp 4基序 C-端、N-端和C/N-端缺失基因片段。缺失基因擴(kuò)增產(chǎn)物和表達(dá)載體pET28a（+）連接，構(gòu)建4基序?yàn)镻GLTS突變體C-端、N-端和C/N-端缺失的原核表達(dá)載體，并命名為pET28a-C4、pET28a-N4、pET28a-CN4。

1.7 核苷酸序列測(cè)定

利用ABI PRISM 3730 核苷酸序列分析儀，對(duì)質(zhì)粒pET28a-C4、pET28a-N4、pET28a-CN4進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，以獲得erp（4基序）的突變序列，具體工作由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1.8 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白并檢測(cè)

接種環(huán)劃線BL21（DE3）plsys（pET28a-C4、pET28a-N4、pET28a-CN4），過夜培養(yǎng)12 h，挑取單個(gè)菌落，接種于含30 μg/mL Kan的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min下培養(yǎng) 12～16 h。將該菌液以1%接種量接種于含30 μg/mL Kan LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于37 ℃、180 r/min下?lián)u瓶3 h，加入 IPTG 使終濃度達(dá)到1 mmol/L，于32 ℃、180 r/min下過夜誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.9 重組表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE及Western blotting分析

將挑取的陽性菌落進(jìn)行培養(yǎng)，加入IPTG，于32 ℃下過夜誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體，提取蛋白后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)及Western blotting分析，檢測(cè)時(shí)陽性血清為1 ∶ 200 倍稀釋的兔陽性血清，二抗為1 ∶ 800 倍稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生型erp序列擴(kuò)增

利用PCR技術(shù)從結(jié)核分枝桿菌H37Ra基因組DNA中擴(kuò)增出大小約為855 bp的基因片段（圖1），連接到pMD18-T載體中。

2.2 ERP 4基序突變體的構(gòu)建

2.2.1 ERP 6基序突變體的構(gòu)建 利用重疊延伸技術(shù)，以EP1、EP3和EP2、EP4為引物，以重組質(zhì)粒pMD18-T-E為模板，依次經(jīng)過第1輪（圖2）、第2輪（圖3）PCR擴(kuò)增得到erp 6個(gè)基序的突變體片段，連接到pMD18-T載體中。將含有目的基因的重組質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切鑒定和序列測(cè)定，與預(yù)期結(jié)果一致，將重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-6。

2.2.2 ERP 4基序全長(zhǎng)突變體的構(gòu)建 利用重疊延伸技術(shù)，以EP1、EP5和EP2、EP6為引物，以重組質(zhì)粒pMD18-T-6為模板，依次經(jīng)過第1輪（圖4）、第2輪（圖5）PCR擴(kuò)增得到erp 4基序的序列片段。

2.3 4基序缺失突變體及其表達(dá)載體的構(gòu)建

利用PCR技術(shù)，以EP9、PN1、PN2、PC、EP10為引物，以pMD18-T-4為模板，擴(kuò)增erp 4基序 C-端、N-端和C/N-端缺失基因片段，分別為405、495、231 bp的產(chǎn)物（圖6）。

缺失基因擴(kuò)增產(chǎn)物和表達(dá)載體pET28a（+）經(jīng)過HindⅢ和XhoⅠ雙酶切，經(jīng)Wizard PCR preps DNA Purification System試劑盒純化回收后用T4 DNA Lingase進(jìn)行連接，4 ℃過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）pLysS 中，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定（圖7），將篩選得到的陽性重組子分別命名為pET28a-C4、

pET28a-N4、pET28a-CN4。對(duì)其進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，結(jié)果表明其基因序列和閱讀框架正確。

2.4 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白及SDS-PAGE分析

將用于毒性蛋白表達(dá)的BL21（DE3）pLysS菌株作為pET28a-C4、pET28a-N4、pET28a-CN4融合基因的表達(dá)宿主菌，經(jīng)轉(zhuǎn)化挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)，IPTG過夜誘導(dǎo)，菌體處理后，用Tricine SDS-PAGE分析，結(jié)果表明菌體中含有目的蛋白（圖8），分子量大小分別約為11.2、15.4、4.8 ku，與理論值相符，表明融合基因可在BL21（DE3）pLysS中實(shí)現(xiàn)表達(dá)。

2.5 表達(dá)產(chǎn)物的 Western blotting分析

BL21（DE3）pLysS（pET28a-C4）、BL21（DE3）pLysS（pET28a-N4）和BL21（DE3）pLysS（pET28a-CN4）表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blotting試驗(yàn)分析，結(jié)果表明，重組蛋白可以被His-Tag特異性抗體識(shí)別，在約11.2、15.4、4.8 ku處出現(xiàn)識(shí)別條帶，而陰性對(duì)照在相同的位置沒有條帶（圖9），表明毒性蛋白在宿主菌中特異表達(dá)。

3 結(jié)論與討論

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種人畜共患病，它嚴(yán)重威脅人類健康，大約每年導(dǎo)致180萬人死亡[8] 。erp基因是結(jié)核分枝桿菌中一個(gè)重要的毒力基因，Christine等研究發(fā)現(xiàn)Erp 蛋白在分枝桿菌的細(xì)菌壁滲透性屏障形成中起重要作用，Erp缺陷可造成細(xì)菌壁通透性的缺陷，使之可以透過一些親脂性物質(zhì)，致使細(xì)菌對(duì)宿主的防御反應(yīng)敏感，如活性氧、活性氮和防御素等可以透過細(xì)菌壁而對(duì)細(xì)菌起到殺傷作用[9]。Erp不僅僅是一種毒力因子，在麻風(fēng)結(jié)核桿菌中還是一種免疫優(yōu)勢(shì)抗原，可以誘發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫。早期研究空洞和非空洞結(jié)核病患者時(shí)發(fā)現(xiàn)，Erp蛋白僅可以刺激空洞性結(jié)核病患者機(jī)體產(chǎn)生抗體，而在結(jié)核病潛伏感染者體內(nèi)很少甚至沒有抗體產(chǎn)生[10]。

Kyte-Doolittle分析Erp蛋白時(shí)顯示，C-末端富含疏水性氨基酸可能與膜骨架網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞質(zhì)膜之間的連接有關(guān)。Kocincova等對(duì)恥垢結(jié)核分枝桿菌Erp進(jìn)行突變，闡釋該蛋白疏水性C-末端將Erp錨定在細(xì)菌表面。ERP蛋白的N-端，PGLTS 重復(fù)區(qū)序列的不同對(duì)該蛋白質(zhì)的致病性和輸出運(yùn)輸具有較大的影響，但是目前在ERP基序變化以及C、N端功能方面的研究還不是很清楚。

本試驗(yàn)成功克隆了結(jié)核分枝桿菌erp，對(duì)erp進(jìn)行一系列突變，得到4個(gè)基序的突變體，以pET28a（+）為載體構(gòu)建大腸桿菌融合表達(dá)系統(tǒng)——BL21（DE3）pLysS（pET28a-C4）、BL21（DE3）pLysS（pET28a-N4）和BL21（DE3）pLysS（pET28a-CN4），經(jīng)Tricine SDS-PAGE檢測(cè)，目的蛋白大小為11.2、15.4、4.8 ku。Western blotting結(jié)果顯示，目的蛋白能被特異性抗體識(shí)別，本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究Erp的功能奠定了基礎(chǔ)。

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