李佳橋，余修亮，曾林暉，鄧澤元，李紅艷*（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌　330047）

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響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助提取蓮房原花青素工藝

李佳橋，余修亮，曾林暉，鄧澤元，李紅艷*
（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌330047）

摘 要：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗(yàn)研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲波功率和超聲時(shí)間對(duì)蓮房原花青素得率的影響，通過建立超聲波輔助提取蓮房原花青素的多元回歸模型，優(yōu)化蓮房原花青素的提取工藝參數(shù)。結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蓮房原花青素得率的影響最大，其次是液料比和超聲波功率，超聲時(shí)間對(duì)得率的影響相對(duì)較小。在乙醇體積分?jǐn)?shù)45%、液料比21∶1（mL/g）、超聲波功率700 W、超聲時(shí)間15 min時(shí)，蓮房原花青素得率最大，為6.81%，與模型理論預(yù)測(cè)值相近，說明該模型回歸性良好，試驗(yàn)的擬合程度高，可以用于蓮房原花青素得率的預(yù)測(cè)，為蓮房原花青素作為天然抗氧化劑的應(yīng)用提供一定的科學(xué)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：蓮房；原花青素；提取工藝；超聲波；響應(yīng)面

引文格式：

李佳橋, 余修亮, 曾林暉, 等. 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助提取蓮房原花青素工藝[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(12): 40-45.

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蓮房為睡蓮科植物蓮的成熟花托，在我國(guó)主要產(chǎn)自江西、湖南、福建、江蘇、浙江等省，呈倒圓錐狀或漏斗狀，直徑5.0～8.0 cm，高4.5～6.0 cm，鮮品為石綠色，干品表面灰棕色至紫棕色，質(zhì)地疏松，破碎面呈海綿樣[1]。據(jù)李時(shí)珍在《百草綱目》中記載，蓮房有消瘀散血之效。蓮在加工時(shí)，大量蓮房作為垃圾而丟棄，這不僅造成資源浪費(fèi)，還會(huì)污染環(huán)境。

原花青素是一種分子結(jié)構(gòu)特殊的生物類黃酮，由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素縮合而成，在抗氧化方面有著無可比擬的優(yōu)勢(shì)，是目前發(fā)現(xiàn)的效果最好的自由基清除劑之一[2]。蓮房原花青素不僅具有很高的體內(nèi)活性和抗衰老作用[3]，還有保護(hù)皮膚[4]、抗肝癌[5]、抗黑色素瘤[6]、預(yù)防口腔癌[7]、改善記憶[8-9]、保護(hù)心腦血管、增強(qiáng)免疫[10]、抑制糖化終產(chǎn)物的形成[11]等功能。同時(shí)還能提高機(jī)體抗輻射的能力[12]，其機(jī)制可能與其抗氧化活性、增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能、促進(jìn)骨髓造血功能有關(guān)[13]。

目前，國(guó)內(nèi)外開始對(duì)蓮房原花青素進(jìn)行研究，提取方法主要有雙酶輔助法[14-15]、脈沖超聲輔助丙酮提取法[16]、微波輔助丙酮提取法[17]、乙醇浸提法[18]等，但超聲波輔助乙醇提取法鮮有報(bào)道。超聲波輔助提取具有時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、原花青素得率高等優(yōu)點(diǎn)。賈寶珠等[19]以香蕉皮為原料，分別采用溶劑提取法和超聲波輔助提取法對(duì)原花色素的提取工藝進(jìn)行研究，研究表明超聲波輔助提取法的最佳提取時(shí)間僅為溶劑提取法的40%，得率和純度卻分別為溶劑提取法的1.5 倍和1.6 倍。本研究擬以乙醇為提取劑，采用超聲波輔助提取法提取蓮房原花青素，通過工藝參數(shù)的優(yōu)化，以期為蓮房原花青素的進(jìn)一步研究開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

蓮房南昌市江大南路天虹商場(chǎng)；兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水甲醇、無水乙醇、濃硫酸、香草醛均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

722G可見分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司；GA92-ⅡD超聲波粉碎機(jī)無錫市上佳生物技術(shù)有限公司；TDL-5-A飛鴿牌臺(tái)式離心機(jī)、FW80高速萬能粉碎機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；DGG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；AR323CN電子天平奧豪斯儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1蓮房粉的制備

將蓮蓬中的蓮子全部剝除，用蒸餾水快速?zèng)_洗蓮房部分，然后撕成莖部相連的條狀，在60 ℃條件下烘干（48 h以上）至質(zhì)量恒定，粉碎，過40 目篩，備用。

1.3.2蓮房原花青素的制備

準(zhǔn)確稱取蓮房粉末0.250 g，置于50 mL離心管中，并按一定液料比加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，搖勻。然后在室溫條件下，用一定功率的超聲波分別處理一定時(shí)間，取出后溶液立刻離心5 min（4 200 r/min），取上清液。殘?jiān)性偌尤?0 mL蒸餾水，充分搖勻，4 200 r/min離心5 min。上清液合并后置于25 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線。

1.3.3兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品配制0.5 mg/mL的兒茶素溶液，分別稀釋得到0.4、0.3、0.2、0.1 mg/mL兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液。按表1分別配制標(biāo)準(zhǔn)組、標(biāo)準(zhǔn)空白組和蒸餾水空白組[20]。將配制好的溶液搖勻，在室溫條件下密封避光反應(yīng)20 min，取出充分搖勻后在500 nm波長(zhǎng)條件下用1 cm的比色皿測(cè)吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=2.404 0x－0.019 8，R2=0.998 3。

表1　樣品組、樣品空白組和蒸餾水空白組的配制Table 1 Preparation of sample group, sample blank group and distilled water blank group

1.3.4原花青素含量的測(cè)定

取少量已制備好的蓮房原花青素溶液，將其稀釋2 倍，并按表1分別進(jìn)行樣品組、樣品空白組和蒸餾水空白組的配制。將配制好的溶液搖勻，在室溫條件下密封避光反應(yīng)20 min，取出充分搖勻后，在500 nm波長(zhǎng)條件下用1 cm的比色皿測(cè)定其吸光度，計(jì)算出溶液中蓮房原花青素的質(zhì)量濃度（mg/mL），由此作為計(jì)算蓮房原花青素得率的指標(biāo)。每組做3 個(gè)平行樣，每次實(shí)驗(yàn)做3 個(gè)蒸餾水空白。蓮房原花青素得率按下式計(jì)算[20]：

式中：V為提取液體積/mL；ρ為待測(cè)溶液中蓮房原花青素的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；n為提取液 的稀釋倍數(shù)；w為蓮房粉的質(zhì)量/g。

1.3.5單因素試驗(yàn)

各因素固定值分別為提取劑乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、液料比60∶1（mL/g）、超聲波功率600 W、超聲時(shí)間20.0 min，保持其他3 個(gè)因素不變，每次改變1 個(gè)因素，測(cè)定蓮房原花青素提取得率。

1.3.6響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲波功率、超聲時(shí)間4 個(gè)因素，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析方法，因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 2 Coded levels for the factors used in response surface analysis

1.4統(tǒng)計(jì)分析

單因素試驗(yàn)每次做3個(gè)平行樣，采用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)、顯著性分析、制作圖表，結(jié)果用±s表示；響應(yīng)面結(jié)果用Design-Expert 8.05b軟件進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化及方差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1超聲時(shí)間對(duì)蓮房原花青素得率的影響

圖1　超聲時(shí)間對(duì)蓮房原花青素得率的影響Fig. 1　Effect of ultrasonic treatment time on the extraction yield of LSP

由圖1可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，原花青素得率逐漸增大，且超聲波處理5 min與處理10 min，原花青素得率差異顯著（P＜0.05），處理10 min后，原花青素得率雖有增加，但差異不顯著（P＞0.05）。20 min后趨于平緩，這是因?yàn)?0 min時(shí)蓮房粉中原花青素可能已被基本提取，所以延長(zhǎng)提取時(shí)間，原花青素得率只有微小的變化。故適宜的超聲時(shí)間應(yīng)該為20 min。

2.1.2超聲波功率對(duì)蓮房原花青素得率的影響

圖2　超聲波功率對(duì)蓮房原花青素得率的影響Fig. 2　Effect of ultrasonic power on the extraction yield of LSP

由圖2可知，超聲波功率為300～600 W時(shí)，原花青素得率逐漸增大，并在600 W時(shí)達(dá)到最大，與300 W和400 W相比差異顯著（P＜0.05）。功率大于600 W時(shí)得率下降，這可能是由于超聲波功率較大時(shí)，有少量脂類或脂溶性蛋白從細(xì)胞中溶出，并與原花青素反應(yīng)，而降低原花青素得率；此外，功率過大時(shí)，超聲波熱效應(yīng)導(dǎo)致提取液溫度升高，原花青素有效成分被破壞，導(dǎo)致得率降低[21]。故選擇超聲波功率為600 W。

2.1.3乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蓮房原花青素得率的影響

圖3　乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蓮房原花青素得率的影響Fig. 3　Effect of ethanol concentration on the extraction yield of LSP

由圖3可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，原花青素得率先增大后減小，在體積分?jǐn)?shù)40%時(shí)達(dá)到最大值，與60% 和70%的乙醇體積分?jǐn)?shù)相比差異顯著（P＜0.05）。其原因可能為水相比例較大時(shí)，溶出的水溶性雜質(zhì)增多，原花青素相對(duì)減少；隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，脂溶性雜質(zhì)的成分溶出量增加，可與乙醇-水分子結(jié)合，為原花青素的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，導(dǎo)致原花青素得率降低[22]，故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%。

2.1.4液料比對(duì)蓮房原花青素得率的影響

圖4　液料比對(duì)蓮房原花青素得率的影響Fig. 4　Effect of liquid/solid ratio on the extraction yield of LSP

由圖4可知，隨著液料比的增大，原花青素得率逐漸升高，在25∶1（mL/g）時(shí)達(dá)到最大，再提高液料比時(shí)得率反而呈下降趨勢(shì)，液料比改變，原花青素得率的差異顯著（P＜0.05）。提高液料比不但會(huì)增大不必要的溶劑成本，還會(huì)給后續(xù)濃縮提純帶來不便[23-24]，因此，選擇液料比為25∶1（mL/g）。

2.2響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，根據(jù)Design-Expert 8.05b軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案，共有27 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中1～24號(hào)為析因點(diǎn)，其變量取值在各因素構(gòu)成的三維頂點(diǎn)；25～27號(hào)為零點(diǎn)，是區(qū)域的中心點(diǎn)，用來估計(jì)試驗(yàn)誤差。蓮房原花青素得率為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表3。

表3　超聲波提取蓮房原花青素響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 The experimental design and results for response surface analysis

2.2.2回歸方程擬合和方差分析

將表3中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，建立回歸模型，得到蓮房原花青素得率與乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲波功率、超聲時(shí)間四因素變量的二次多元回歸方程為：

由表4可知，該回歸方程模型的P＜0.000 1，模型極顯著，而失擬項(xiàng)不顯著（P=0.152＞0.05）；各因素對(duì)蓮房原花青素得率的影響大小順序?yàn)椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)＞液料比＞超聲波功率＞超聲時(shí)間。決定系數(shù)R2值為0.982 2，預(yù)測(cè)決定系數(shù)R2值為0.899 3，考察值與模擬預(yù)測(cè)值具有緊密聯(lián)系，表明該方程具有較好的模擬性，可用于優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析，以確定蓮房原花青素超聲波提取的最優(yōu)工藝條件。一次項(xiàng)X1、X2均達(dá)到了極顯著的水平（P＜0.01），X3達(dá)到了顯著水平（P＜0.05），而X4不顯著（P＞0.05），說明乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比對(duì)蓮房原花青素得率影響較大，超聲波功率次之，故要得良好的響應(yīng)值，必須嚴(yán)格控制乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比；而超聲時(shí)間對(duì)得率影響相對(duì)不顯著。

表4　回歸模型方差分析Table 4　Analysis of variance of regression model

除X2X4、X3X4因素之間的交互作用顯著外，其余因素之間的交互因素并不顯著，其P值遠(yuǎn)大于0.05，表明交互作用對(duì)得率的影響較小。方差分析結(jié)果還顯示，除因素X32外，其余各因素的二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)目標(biāo)值均有顯著影響。

2.2.3響應(yīng)面分析

圖5　各因素交互作用對(duì)蓮房原花青素提取得率的影響Fig. 5　Interactive effects of various factors on the extraction yield of LSP

由圖5可知，開始時(shí)蓮房原花青素得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和超聲時(shí)間水平的增大而增大，達(dá)到各因素中心值以后，得率隨各因素增大而逐漸減?。坏寐逝c超聲波功率呈正相關(guān)。對(duì)比各圖可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蓮房原花青素得率影響最大，表現(xiàn)為圖5a、b、c的曲面較陡，由此可見，控制好乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)取得良好的提取效果至關(guān)重要；其次是液料比，再次是超聲波功率。而超聲時(shí)間表現(xiàn)為響應(yīng)面相對(duì)較為平緩，說明此因素對(duì)得率影響較小。由圖5還可知，除超聲時(shí)間和液料比與超聲時(shí)間與超聲波功率的交互因素較強(qiáng)外，其余各因素間的交互作用不強(qiáng)，表現(xiàn)為圖5e和圖5f的等高線為橢圓形，其余各圖的等高線橢圓形狀不明顯，這與回歸方程的方差分析結(jié)果相一致，說明響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)可以較好地反映出乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲波功率和超聲時(shí)間4個(gè)因素對(duì)蓮房原花青素得率的影響。

通過Design-Expert 8.05b軟件分析計(jì)算可得到最佳提取工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)45.15%、液料比21.37∶1（mL/g）、超聲波功率700.00 W、超聲時(shí)間15.00 min，在此條件下，回歸模型預(yù)測(cè)的原花青素得率的理論值可達(dá)6.98%。汪志慧等[14]采用雙酶法提取蓮房原花青素，在最佳工藝參數(shù)下得率為5.20%，而乙醇浸提法的得率為3.84%，都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于本實(shí)驗(yàn)超聲波輔助提取法的得率，這可能是由于超聲波的空化作用能增強(qiáng)乙醇溶液對(duì)蓮房組織的滲透作用，破壞蓮房的細(xì)胞壁，促使原花青素的釋放，因此可在在短時(shí)低溫條件下將原花青素從蓮房中提取出來[24]。

2.2.4工藝條件的優(yōu)化和驗(yàn)證

為了檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性，結(jié)合實(shí)際實(shí)驗(yàn)條件需要，將最佳提取工藝參數(shù)優(yōu)化為：乙醇體積分?jǐn)?shù)45%、液料比21∶1（mL/g）、超聲波功率700 W、超聲時(shí)間15 min。在此條件下，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得蓮房原花青素的平均得率為6.81%，與理論預(yù)測(cè)值6.98%的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為2.44%，說明采用響應(yīng)面法得到的優(yōu)化工藝可行性強(qiáng)，優(yōu)化結(jié)果可靠。對(duì)比傳統(tǒng)的乙醇浸提法，在乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、液料比25∶1（mL/g）、提取溫度55 ℃和提取時(shí)間60 min條件下蓮房原花青素得率為6.68%[18]，進(jìn)一步表明超聲波輔助提取蓮房原花青素，具有提取溫度低、所需時(shí)間短和得率高等優(yōu)勢(shì)。

3　結(jié) 論

本研究?jī)?yōu)化了超聲波輔助提取蓮房原花青素的工藝參數(shù)，其中各因素對(duì)得率的影響大小順序?yàn)椋阂掖俭w積分?jǐn)?shù)＞液料比＞超聲波功率＞超聲時(shí)間。優(yōu)化后的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)45%、液料比21∶1（mL/g）、超聲波功率700 W、超聲時(shí)間15 min，在此條件下，蓮房原花青素得率達(dá)到最大值（6.81%），與理論預(yù)測(cè)值基本一致。本研究可為蓮房原花青素的超聲波工業(yè)提取利用，以及作為天然抗氧化劑的合理開發(fā)提供科學(xué)數(shù)據(jù)。至于蓮房原花青素的具體成分及抗氧化活性成分組成，有待進(jìn)一步研究。

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Response Surface Methodology for Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of Proanthocyanidins from Lotus Seed Pot

LI Jiaqiao, YU Xiuliang, ZENG Linhui, DENG Zeyuan, LI Hongyan*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang330047, China)

Abstract:One-factor-at-a-time method (OFAT) and response surface methodology (RSM) were adopted to study the effects of ethanol concentration, liquid/solid ratio, ultrasonic power and ultrasonic treatment time on the extraction yield of proanthocyanidin from lotus seed pot (LSP). A multiple regression model was established to optimize the parameters for ultrasonic-assisted extraction of LSP. The results indicated that ethanol concentration had the most significant impact on the extraction yield of LSP, followed by liquid/solid ratio and ultrasonic power, while the impact of ultrasonic treatment time was relatively low. When the extraction was carried out using 45% ethanol as the extractant at a liquid/solid ratio of 21:1 (mL/g) with ultrasonic treatment for 15 min at 700 W, the maximum yield of LSP of 6.81% was obtained, which was close to the model-predictive value. Our results indicated that the developed model had good regression performance and fitness, and could be applied in the prediction of the extraction yield of LSP. This study could provide scientific data for the application of LSP as a natural antioxidant.

Key words:lotus seed pot; proanthocyanidins; extraction process; ultrasonic; response surface methodology

收稿日期：2015-10-31

基金項(xiàng)目：江西省自然青年科學(xué)基金項(xiàng)目（20142BAB214003）

作者簡(jiǎn)介：李佳橋（1995—），女，本科生，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與功能。E-mail：ljqncu@163.com

*通信作者：李紅艷（1986—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)榭寡趸?、食品營(yíng)養(yǎng)、食品化學(xué)。E-mail：lihongyan@ncu.edu.cn

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612007 10.7506/spkx1002-6630-201612007. http://www.spkx.net.cn

中圖分類號(hào)：TS201.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2016）12-0040-06