任子利，趙彥玲，王建洲，李瑜鑫，商 鵬，強巴央宗

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維生素C對藏豬精液4℃保存及其精子全基因組DNA甲基化的影響

任子利，趙彥玲，王建洲，李瑜鑫，商 鵬，強巴央宗*

（西藏農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，林芝860000）

摘 要：旨在研究維生素C對藏豬精液4℃保存效果及其精子全基因組DNA甲基化的影響。用手握法采集健康藏豬精液，在改進的豬精液低溫稀釋液中添加不同濃度的維生素C（0.0、2.5、5.0、7.5、10.0g·L－1），4℃保存到第5天時，以藏豬精子活力、精子畸形率、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率為評價指標(biāo)，探討維生素C對藏豬精液4℃保存的效果；用甲基化熒光定量法檢測藏豬新鮮精液組、保存到第5天時未添加維生素C組、添加維生素C組（添加維生素C最佳效果組5.0g·L－1）精液DNA甲基化的水平，以探討維生素C對藏豬精液4℃保存所造成的精子全基因組DNA甲基化的影響。結(jié)果顯示：添加5.0g·L－1維生素C組其精子活力、畸形率、頂體完整率和質(zhì)膜完整率均顯著好于其它組（P＜0.05）；鮮精組、未添加維生素C組、添加維生素C組的DNA甲基化水平分別為（0.604 7±0.040 3）、（0.920 2±0.016 9）、（0.656 9±0.048 3）ng，鮮精組與添加組均顯著低于未添加組（P＜0.05），而鮮精組與添加組間差異不顯著（P＞0.05）。綜上表明，在改進的豬精液稀釋液中添加5.0g·L－1維生素C可以明顯改善藏豬精液4℃保存的效果，并且可以明顯降低4℃保存對藏豬精液精子全基因組DNA甲基化的影響，這將為藏豬精液低溫保存的生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：維生素C；藏豬精液；4℃保存；DNA甲基化

藏豬主要分布于雅魯藏布江流域中游河谷區(qū)和藏東三江流域中游高山深谷區(qū)，是中國特有的能適應(yīng)高海拔地區(qū)的一個重要品種［1］，有“高原之珍”的美譽。為促進藏豬產(chǎn)業(yè)的大發(fā)展，開展人工授精是不可或缺的環(huán)節(jié)，這就需要解決藏豬精液的妥善保存問題。冷凍能長期保存豬精液，但人工授精的受胎率低至1%［2］，常溫保存人工授精的效果好又方便經(jīng)濟，但受到保存時間的限制，且公豬精液18℃保存會引發(fā)脂質(zhì)過氧化，降低線粒體膜電位，提高等離子體膜透性［3］。低溫保存比如4℃從理論上講，因低溫下精子代謝活動水平更低，保存時間比常溫長，同時可應(yīng)用普通冰箱保存，經(jīng)濟方便。但是，在精液低溫保存過程中，豬精子對低溫的耐受能力比其他家畜差，容易發(fā)生冷休克，精子處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），對精子結(jié)構(gòu)及功能造成損傷，甚至誘發(fā)其凋亡［4－5］。精子的DNA甲基化異常能預(yù)示男性的生育能力及其胚胎質(zhì)量［6］。維生素C是一種廉價易得的抗氧化劑，如在藏豬精液4℃保存稀釋液中添加維生素C，就有可能對抗低溫對精子造成的活性氧及基因組甲基化水平異常，也就可能提高藏豬精液4℃保存的效果。李芳［7］認(rèn)為6mg·mL－1維生素C能有效提高豬精液冷凍質(zhì)量，陸媚等［8］認(rèn)為添加2.00mg·mL－1水蛭素能顯著提高豬精液低溫保存的效果。M.Benchaib等［9］研究輔助生殖技術(shù)中精子的DNA甲基化。F.J.Cisneros［10］研究DNA甲基化與男性不育的關(guān)系。但關(guān)于維生素C對藏豬精液4℃保存及其精子全基因組DNA甲基化的影響的研究目前未見相關(guān)報道。因此，本研究擬在改進的豬精液低溫稀釋液中添加不同質(zhì)量濃度的維生素C（0.0、2.5、5.0、7.5、10.0g·L－1），4℃保存到第5天時，以藏豬精子活力、精子畸形率、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率為評價指標(biāo)，探討維生素C對藏豬精液4℃保存的效果；用甲基化熒光定量法檢測藏豬新鮮精液組、保存到第5天時未添加維生素C組、添加維生素C組（添加維生素C最佳效果組5.0g·L－1）精子DNA甲基化的水平，以探討維生素C對藏豬精液4℃保存所造成的精子全基因組DNA甲基化的影響，為藏豬精液低溫保存的進一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

2015年5月－11月在西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院藏豬研究中心進行試驗。

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器設(shè)備 維生素C（西安利君制藥有限公司）、考馬斯亮藍（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）、Diff－Quik染液、亞衛(wèi)牌精液稀釋粉（丹麥）、瓊脂糖（西班牙）、溴化乙錠（EB）（Sigma公司）、MethylFlashTMMethylated DNA Quantification Kit（Epigentek公司）、新鮮藏豬精液由西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院實習(xí)基地提供。

倒置熒光顯微鏡（NI－KON TE2000，日本）、冰箱（青島海爾股份有限公司）、電熱恒溫水槽（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、NanoDrop?ND－1000紫外分光光度計（美國NanoDrop公司）、Eppendorf Centrifuge 5417R離心機（德國Eppendorf公司）、M200熒光酶標(biāo)儀（TECAN公司）。

1.1.2 改進的低溫稀釋液配制 參照孫時軍等［11］的試驗結(jié)果，使用亞衛(wèi)牌精液稀釋劑作為基礎(chǔ)稀釋劑，在稀釋后的精液中加入1%乙二醇作為低溫保護劑。

1.1.3 精液采集及處理 用手握法采集健康藏豬精液，采用兩次稀釋法將藏豬精液（精子活力0.8以上）做4倍稀釋，用數(shù)層紗布包裹后放入培養(yǎng)箱中，17℃平衡2h后，放入冰箱4℃保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 精子質(zhì)量評價 精子活力：用平板壓片法測出直線前進運動的精子占總精子的百分率。精子畸形率：用商品化Diff－Quik染液染色檢測畸形率。精子頂體完整率：考馬斯亮藍R250染色法。精子質(zhì)膜完整率：低滲腫脹試驗—HOST。具體方法參照文獻［4］。

1.2.2 精子基因組DNA甲基化檢測 用苯酚—氯仿抽提法提取藏豬新鮮精液組、保存到第5天時未添加維生素C組、添加維生素C組（添加5.0g·L－1維生素C最佳效果組）這3組精液其精子的基因組DNA，用NanoDrop?ND－1000紫外分光光度計檢測其濃度、純度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，當(dāng)其純度為1.8～2.0、檢測結(jié)果為未擴散的清晰、單一、整齊的條帶時，表明所提取的DNA質(zhì)檢合格，然后按照MethylFlashTMMethylated DNA Quantification Kit說明書提供的方法進行操作，再按照要求作出標(biāo)準(zhǔn)曲線后，計算樣品DNA中甲基化的DNA量。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 維生素C對藏豬精液4℃保存的影響試驗分5組，在改進的豬精液低溫稀釋液中添加不同質(zhì)量濃度的維生素C（0.0、2.5、5.0、7.5、10.0 g·L－1，分別對應(yīng)第1、2、3、4、5組），4℃保存到第5天時以藏豬精子活力、精子畸形率、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率為評價指標(biāo)，探討維生素C對藏豬精液4℃保存的效果。試驗重復(fù)3次。

1.3.2 維生素C對藏豬精液4℃保存所造成的精子全基因組DNA甲基化的影響 試驗分3組：藏豬新鮮精液組、保存到第5天時未添加維生素C組、添加維生素C組（添加維生素C 5.0g·L－1最佳效果組）。用甲基化熒光定量法檢測這3組精液DNA甲基化的水平，以探討維生素C對藏豬精液4℃保存所造成的精子全基因組DNA甲基化的影響。試驗重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所得試驗數(shù)據(jù)用Excel進行前期處理，再用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析，并進行多重比較，試驗結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，確定差異的顯著性，P＜0.05為差異顯著，柱狀圖使用Sigma－Plot 10.0軟件制作。

2 結(jié) 果

2.1 維生素C對藏豬精液4℃保存的影響

由表1可以看出，藏豬精液4℃保存到第5天時，第3組即添加5.0g·L－1維生素C組的精子活力、精子畸形率、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率：0.69、15.11%、64.58%、61.33%，這4個指標(biāo)均顯著好于其他組（P＜0.05）。

表1 維生素C對藏豬精液4℃保存的影響Table 1 Effect of vitamin C at 4℃on the preservation of Tibetan boar semen

2.2 DNA質(zhì)檢結(jié)果

經(jīng)NanoDrop?ND－1000紫外分光光度計檢測提取到的3組藏豬精液的精子全基因組DNA，其濃度為300～350ng·μL－1、純度為1.9～2.0、凝膠電泳圖結(jié)果如圖1所示，條帶未擴散且清晰、單一、整齊，表明所提取的DNA質(zhì)檢合格，把濃度均稀釋成100ng·μL－1，可用于后續(xù)試驗。

2.3 藏豬精子基因組DNA甲基化水平檢測結(jié)果

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線用的6個點的陽性對照（50%甲基化的DNA）的量分別為0.0、0.5、1.0、 2.0、5.0、10.0ng。如圖2所示，線性回歸分析取前4個點，擬合的曲線：y＝1 115.5x＋119.2，擬合度R2為0.990 4。根據(jù)該斜率計算5－mC含量及百分比。

根據(jù)前4個點擬合的曲線線性較好，結(jié)果可靠。

2.3.2 藏豬精子基因組DNA甲基化水平定量結(jié)果 如圖3所示，鮮精組、未添加維生素C組、添加維生素C組的DNA甲基化水平（（0.604 7± 0.040 3）、（0.920 2±0.016 9）、（0.656±0.048 3）ng）中，鮮精組與添加組均顯著低于未添加組（P＜0.05），而鮮精組與添加組間差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，添加質(zhì)量濃度5.0g·L－1維生素C可以明顯改善藏豬精液4℃保存的效果，并且可以明顯降低4℃保存對藏豬精子DNA甲基化的影響。

圖1 DNA電泳Fig.1 Electrophoresis results of genomic DNA

圖2 5－mC檢測得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of 5－mC quantity

圖3 100ng精子DNA中5－mC的量Fig.3 5－mC amount of every 100ng sperm DNA

3 討 論

3.1 維生素C對藏豬精液4℃保存的影響

李芳［7］認(rèn)為黃酮類、維生素C、多不飽和脂肪酸和維生素E這些抗氧化劑對豬冷凍精子均有保護作用，其中6mg·mL－1維生素C的適宜添加濃度為6mg·mL－1，而本研究中添加5.0g·L－1維生素C則可以明顯改善藏豬精液4℃保存的效果，二者結(jié)果基本一致，至于需要添加的維生素C濃度略有不同，這可能是4℃保存產(chǎn)生的活性氧比冷凍少些，所以需要的維生素C濃度也相對稍低。適宜濃度的L－精氨酸也可以明顯改善4℃豬精液的保存效果［12］?？梢姡圆刎i精子活力、精子畸形率、精子頂體完整率和質(zhì)膜完整率為評價指標(biāo)，這些抗氧化劑均能對豬精液4℃保存有較好的效果。

3.2 維生素C對藏豬精液4℃保存所造成的精子基因組DNA甲基化的影響

表觀遺傳修飾是精子的特征性標(biāo)志物，對保證精子的正常形態(tài)和機能至關(guān)重要，DNA甲基化、組蛋白修飾、RNAs以及精蛋白等異常會導(dǎo)致精子機能降低和胚胎發(fā)育失敗，甚至誘發(fā)后代表觀遺傳疾病的發(fā)生［13］。K.E.Waterhouse等［14］研究表明，冷凍程序改變了牛精子DNA的完整性。G.B.Boe－Hansen等［15］用精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析（SCSA）研究公豬精液液體保存后其精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性與生育力的關(guān)系，認(rèn)為SCSA技術(shù)可能能鑒定出個體的低繁殖力甚至（由這些個體輸精所導(dǎo)致的）低窩產(chǎn)仔數(shù)，而且將來能在成本效益分析后應(yīng)用于養(yǎng)豬業(yè)。全基因組DNA甲基化的分析揭示了一個正常的啟動子甲基化CpG島［16］。M.Benchaib等［17］通過免疫組化染色，用流式細(xì)胞儀定量分析表明：在正常的輔助生殖程序中，研究人類精子是否具有讓人受孕能力的一種新方法便是看精子全基因組DNA甲基化水平。全基因組DNA甲基化與水牛生育能力有關(guān)［18］。O.Tunc等［19］研究也有類似的結(jié)論，即人類精子DNA片段化同全基因組DNA甲基化間存在負(fù)相關(guān)，添加抗氧化劑可以減少DNA損傷并且使精子DNA甲基化狀態(tài)正常。這與本研究結(jié)果一致。然而，也有相反的結(jié)論，認(rèn)為冷凍保存對于人類精子DNA甲基化沒有影響［20］，這可能與物種及試驗條件等有關(guān)，若究其原因，尚需進一步研究。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，在改進的豬精液稀釋液中添加5.0g·L－1維生素C可以明顯改善藏豬精液4℃保存的效果，并且可以明顯降低4℃保存對藏豬精子基因組DNA甲基化的影響，這將為藏豬精液低溫保存的生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻（References）：

［1］ 強巴央宗，謝 莊，田發(fā)益.高原藏豬現(xiàn)狀與保種策略［J］.中國畜牧雜志，2001，37（6）：46－47.CHAMBA Y Z，XIE Z，TIAN F Y.Status and protective strategy of plateau Tibet pig［J］.Chinese Journal of Animal Science，2001，37（6）：46－47.（in Chinese）

［2］ YESTE M.Recent advances in boar sperm cryopreservation：state of the art and current perspectives ［J］.Reprod Domest Anim，2015，50（Suppl 2）：71－79.

［3］ KUMARESAN A，KADIRVEL G，BUJARBARUAH K M，et al.Preservation of boar semen at 18degrees C induces lipid peroxidation and apoptosis like changes in spermatozoa［J］.Anim Reprod Sci，2009，110 （1－2）：162－171.

［4］ 胡傳活，許春榮，陸 媚，等.黃芪多糖對豬精液低溫保存的影響［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2015，35（1）：150－154.HU C H，XU C R，LU M，et al.Effects of astragalan on low temperature preservation of boar semen［J］.Chinese Journal of Veterinary Science，2015，35（1）：150－154.（in Chinese）

［5］ JOHNSON L A，WEITZE K F，F(xiàn)ISER P，et al.Storage of boar semen［J］.Anim Reprod Sci，2000，62（1－3）：143－172.

［6］ ASTON K I，UREN P J，JENKINS T G，et al.Aberrant sperm DNA methylation predicts male fertility status and embryo quality［J］.Fertil Steril，2015，104 （6）：1388－1397.

［7］ 李 芳.四種抗氧化劑對豬精液冷凍保存效果的研究［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2012.LI F.Study on four antioxidants for crypreservation of boar spermatozoa［D］.Yangling：Northwest A ＆F University，2012.（in Chinese）

［8］ 陸 媚，許春榮，劉德玉，等.水蛭素對豬精液低溫保存的影響［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2014（17）：68－72.LU M，XU C R，LIU D Y，et al.Effects of hirudin on low temperature preservation of boar semen［J］.Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine，2014（17）：68－72.（in Chinese）

［9］ BENCHAIB M，AJINA M，BRAUN V，et al.DNA sperm methylation in assisted reproductive techniques ［J］.Gynecol Obstet Fertil，2006，34（9）：836－839.

［10］ CISNEROS F J.DNA methylation and male infertility ［J］.Front Biosci，2004，9：1189－1200.

［11］ 孫時軍，朱華鴻，陳曉峰，等.低溫保護劑對4℃保存豬精液活率的影響［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2012（4）：28－29.SUN S J，ZHU H H，CHEN X F，et al.Effects of sperm motility of cryoprotectant on 4℃temperature preservation of boar semen［J］.Shanghai Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，2012 （4）：28－29.（in Chinese）

［12］ 許春榮，陸 媚，劉德玉，等.L－精氨酸對豬精液低溫保存效果的影響［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，23（11）：12－16.XU C R，LU M，LIU D Y，et al.Effects of L－Arg on low temperature preservation of boar semen［J］.Acta Agriculturae Boreali－occidentalis Sinica，2014，23 （11）：12－16.（in Chinese）

［13］ 葛少欽，趙崢輝，張雪倩，等.精子表觀遺傳修飾及其在胚胎發(fā)育過程中的潛在作用［J］.遺傳，2014，36 （5）：439－446.GE S Q，ZHAO Z H，ZHANG X Q，et al.Epigenetic modifications in human spermatozoon and its potential role in embryonic development［J］.Hereditas，2014，36（5）：439－446.（in Chinese）

［14］ WATERHOUSE K E，GJELDNES A，TVERDAL A，et al.Alterations of sperm DNA integrity during cryopreservation procedure and in vitro incubation of bull semen［J］.Anim Reprod Sci，2010，117（1－2）：34－42.

［15］ BOE－HANSEN G B，CHRISTENSEN P，VIBJERG D，et al.Sperm chromatin structure integrity in liquid stored boar semen and its relationships with field fertility［J］.Theriogenology，2008，69（6）：728－736.

［16］ SHEN L，KONDO Y，GUO Y，et al.Genome－wide profiling of DNA methylation reveals a class of normally methylated CpG island promoters［J］.PLoS Genet，2007，3（10）：2023－2036.

［17］ BENCHAIB M，BRAUN V，RESSNIKOF D，et al.Influence of global sperm DNA methylation on IVF results［J］.Hum Reprod，2005，20（3）：768－773.

［18］ VERMA A，RAJPUT S，DE S，et al.Genome－wide profiling of sperm DNA methylation in relation to buffalo（Bubalus bubalis）bull fertility［J］.Theriogenology，2014，82（5）：750－759.

［19］ TUNC O，TREMELLEN K.Oxidative DNA damage impairs global sperm DNA methylation in infertile men［J］.J Assist Reprod Genet，2009，26（9－10）：537－544.

［20］ KL?VER R，BLEIZIFFER A，REDMANN K，et al.Routine cryopreservation of spermatozoa is safe－－evidence from the DNA methylation pattern of nine spermatozoa genes［J］.J Assist Reprod Genet，2012，29（9）：943－950.

（編輯 程金華）

Effect of Vitamin C on Tibetan Boar Semen Preserved at 4℃and Levels of the Sperm Global Genome DNA Methylation

REN Zi－li，ZHAO Yan－ling，WANG Jian－zhou，LI Yu－xin，SHANG Peng，CHAMBA Yangzom*
（Faculty of Animal Science，Tibet Agricultural and Animal Husbandry College，Linzhi 860000，China）

Abstract：This research was conducted to study the effect of vitamin C on Tibetan boar semen preserved at 4℃and the subsequent influence on global genome DNA methylation.The semen was collected from Tibetan boar and preserved at 4℃in modified medium supplemented with vitamin C at 0.0，2.5，5.0，7.5，10.0g·L－1.Sperm motility，abnormality，acrosome integrity and plasma membrane integrity were evaluated 5days after preservation.And the global methylation level of the fresh and preserved sperm was detected by using MethylFlashTM.The results showed that a significantly higher sperm motility and plasma membrane integrity，acrosome integrity and less abnormality was observed in group supplemented with 5.0g·L－1vitamin C（P＜0.05）.DNA methylation levels of fresh sperm（0.604 7±0.040 3）ng and sperm preserved with vitamin C（0.656 9±0.048 3）ng were significantly lower than those preserved without vitamin C （0.920 2±0.016 9）ng（P＜0.05），but no significant difference was found between fresh semenand sperm preserved with vitamin C（P＞0.05）.These results indicated that supplementation of vitamin C at 5.0g·L－1semen extender could improve quality of Tibetan boar semen preservation at 4℃and mitigate effect on DNA methylation of Tibetan boar sperm.The results in the current study would be helpful for further investigation of the freezing protocol for Tibetan boar semen.

Key words：vitamin C；Tibetan boar semen；preservation at 4℃；DNA methylation

中圖分類號：S828.8＋9.2；S814.8

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：0366－6964（2016）05－1057－05

doi：10.11843/j.issn.0366－6964.2016.05.025

收稿日期：2015－11－25

基金項目：2014年畜牧資源平臺建設(shè)；2013年畜牧體系研究團隊；科技部支撐項目（2012BAD03B03）；西藏自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項目（2015ZR－13－32）

作者簡介：任子利（1969－），男，河南衛(wèi)輝人，副教授，博士，主要從事動物繁殖研究，E－mail：zlren0925@163.com，Tel：0894－5822924

*通信作者：強巴央宗，教授，E－mail：qbyz628@126.com