林 杰，王旭榮，王 磊，張景艷，王學智，孟嘉仁，楊志強，李建喜

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荷斯坦奶牛乳腺組織凍存及乳腺上皮細胞原代培養(yǎng)技術改進

林 杰，王旭榮，王 磊，張景艷，王學智，孟嘉仁，楊志強*，李建喜*

（中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省中獸藥工程技術研究中心，蘭州730050）

摘 要：為了改進奶牛乳腺上皮細胞原代培養(yǎng)技術和探究乳腺組織凍存方法，選用24月齡無泌乳史荷斯坦奶牛，采用組織塊種植法，通過側置和倒置兩種方式，分別從新鮮和凍存（8個月）的乳腺組織中分離培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞。結果表明，側置處理能使乳腺細胞爬出時間縮短1～2d，并改善組織塊貼壁速度和效果；回收于前次培養(yǎng)后的乳腺組織塊再分離培養(yǎng)，貼壁第2天即有乳腺上皮細胞爬出；一步冷凍（－80℃）液氮保存較大奶牛乳腺組織塊，凍存液A（FBS∶DMSO∶DMEM/F12＝7∶2∶1）凍存的組織塊存活率為50%，凍存液B（FBS∶DMEM/F12∶DMSO∶HEPES/丙酮酸鈉貯存液＝10∶7∶2∶1）凍存的組織塊存活率為56%?？梢姡髡呓⒌膫戎锰幚矸ê徒M織塊回收法可以用于奶牛乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)，可以縮短組織塊種植法實驗周期，凍存液中加入緩沖液HEPES/丙酮酸鈉后有利于組織塊生物活性保持。

關鍵詞：乳腺上皮細胞；側置處理；組織凍存；原代培養(yǎng)；奶牛

體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞適宜建立細胞模型，是開展生理、病理、藥理等研究的重要實驗材料。國外已有成熟永生化奶牛乳腺上皮細胞系，如MAC－T、BME－UV1［1－2］。國內也有永生化奶牛乳腺細胞系研究的報道，如朱佳杰、李吉霞、上官陶、代瑞等通過轉染hTert、SV40T等獲得永生化乳腺上皮細胞［3－6］。但是，目前仍沒有成熟的商品化奶牛乳腺上皮細胞系，多數(shù)實驗室只能通過原代培養(yǎng)獲取奶牛乳腺上皮細胞。通常獲取原代奶牛乳腺上皮細胞的方法有以下4種：組織塊種植法、酶消化法、機械剪切法和乳汁分離法，其中以組織塊種植法和酶消化法最為常用。由于組織塊種植法培養(yǎng)周期較長，酶消化法和機械剪切法會對細胞產生一定損傷，乳汁分離法細胞得率較低，故需要不斷完善和改進奶牛乳腺上皮細胞原代培養(yǎng)技術。本研究對組織塊種植法分離乳腺上皮細胞的關鍵技術步驟進行改進，提出了側置處理法和組織塊回收培養(yǎng)法。該方法改善了組織塊種植法培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞過程中的組織塊貼壁效果，縮短了試驗周期。同時，為了解決用于細胞分離培養(yǎng)過程中奶牛乳腺組織獲取成本高的問題，筆者對奶牛乳腺組織塊凍存技術進行了探索，成功建立了凍存乳腺組織分離培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 24月齡健康荷斯坦奶牛，無泌乳史，購自甘肅省荷斯坦奶牛繁育中心，運送至蘭州海石灣屠宰場宰殺。

1.1.2 主要試劑 DMEM/F12（Gibco）、胎牛血清（FBS）（四季青）、青霉素鈉（160萬單位）（哈藥集團有限公司獸藥廠）、硫酸鏈霉素（100萬單位）（浙江金力制藥有限公司）、兩性霉素B（Biosharp）、鼠尾膠原蛋白（gibco）、DMSO（Vetec）、角蛋白18單克隆抗體（Abcom）、FITC標記的兔抗鼠IgG（Abcom）。

1.1.3 主要溶液 配制方法如下。

DMEM/F12培養(yǎng)液：pH為7.0～7.2，0.22 μm微孔濾膜過濾。完全培養(yǎng)液：DMEM/F12基礎培養(yǎng)液＋20%FBS＋500U·mL－1青霉素＋500 U·mL－1鏈霉素＋5μg·mL－1兩性霉素B。

D－Hank’s溶液：pH為7.0～7.2，0.22μm微孔濾膜過濾。應用液：D－Hank’s溶液＋500 U·mL－1青霉素＋500U·mL－1鏈霉素＋5 μg·mL－1兩性霉素B。

胰酶消化液：準確稱取20.0mg EDTA－2Na、250mg胰蛋白酶，D－Hank’s液溶解，定容至100 mL，0.22μm微孔濾膜過濾，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

凍存液A：按FBS∶DMSO∶DMEM/F12＝7∶2∶1比例配置（DMSO、DMEM/F12均用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌），現(xiàn)配現(xiàn)用。

凍存液B：FBS∶DMEM/F12∶DMSO∶HEPES/丙酮酸鈉貯存液＝10∶7∶2∶1比例配置（貯存液中HEPES 0.8mol·L－1、丙酮酸鈉0.02 mol·L－1，DMEM/F12、DMSO均用0.22μm微孔濾膜過濾除菌），現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.4 主要儀器 細胞培養(yǎng)箱（HERACELL 150i），倒置顯微鏡及相機（Nikon eclicse TS100－F；Nikon DS－U2；SAMSUNG WB150F），熒光顯微鏡（OLYMPUS IX71DP72），掃描電鏡（JEOL JSM－6510）。

1.2 方法

1.2.1 乳腺組織取樣 試驗奶牛屠宰后，乳房表面用清水充分沖洗，75%酒精消毒，高壓滅菌解剖刀剖離整個乳房，置于75%酒精處理過的采樣箱中，1 h內帶回實驗室，再用75%酒精消毒組織表面，避開脂肪組織、結締組織和血管，剪取約2.5cm3的乳腺實質，75%酒精浸泡3min后轉移入細胞間。

1.2.2 乳腺上皮細胞分離培養(yǎng)及純化 用DHank’s液浸洗組織4次以去除酒精，剔除外部泛白組織，將乳腺實質剪碎至1mm3小塊。D－Hank’s液清洗后均勻接種于鋪滿鼠尾膠原蛋白的細胞培養(yǎng)瓶，分別取不同培養(yǎng)瓶側置和倒置（圖1），培養(yǎng)箱中分別靜置30min和1h，吸除瓶底液體，緩慢加入完全培養(yǎng)液至剛好淹沒組織，繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞鋪滿瓶底后，移除組織塊，并將組織塊回收再接種培養(yǎng)。待細胞鋪滿瓶底約80%時，差時胰酶消化法純化奶牛乳腺上皮細胞。

圖1 培養(yǎng)瓶擺放方式Fig.1 Placement of cell culture flask

1.2.3 奶牛乳腺上皮細胞形態(tài)學觀察 采用倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察細胞形態(tài)特點。掃描電鏡樣品制備如下：參照劉莉莉［7］方法制作細胞爬片，待細胞融合至70%～80%，D－Hank’s液清洗后用2.5%戊二醛4℃下固定1h；棄去戊二醛，D－Hank’s液和蒸餾水充分清洗后，依次用40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%、100%酒精逐級脫水，自然干燥后噴晶觀察。

1.2.4 奶牛乳腺上皮細胞鑒定 參照劉莉莉［7］試驗方法制作細胞爬片。對角蛋白18進行免疫熒光標記，用PI染料核染，熒光顯微鏡下觀察［8］，鑒定上皮細胞并判斷其純度。

1.2.5 奶牛乳腺上皮細胞傳代 當細胞鋪滿瓶底約80%時，胰酶消化，顯微鏡下觀察到多數(shù)細胞回縮、變圓、細胞間隙擴大時，終止消化，反復吹打后，以1×105·mL－1細胞密度傳代培養(yǎng)。

1.2.6 奶牛乳腺組織凍存 將乳腺實質剪至約4～5mm3的小塊，每5mL凍存管中放入5～6塊組織，分別加入凍存液A和B。紗布包裹凍存管，于－80℃凍存24h后轉移至液氮中保存。

1.2.7 乳腺組織復蘇及細胞培養(yǎng) 8個月后凍存管37℃水浴快速解凍，D－Hank’s液充分清洗組織塊后，按照新鮮組織處理方法分離培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞。接種組織塊時每30塊為一組，每組3個重復，連續(xù)觀察10d，對有細胞爬出的組織塊進行計數(shù)，并計算其平均值，比較A、B凍存液保存的奶牛乳腺組織爬出細胞的活力。

2 結 果

2.1 奶牛乳腺上皮細胞分離培養(yǎng)

試驗奶牛乳腺組織脂肪含量較高（脂肪顆粒如圖2A所示），清洗小組織塊過程中易漂浮、接種后不易貼壁。相同時間內側置處理組織貼壁效果優(yōu)于倒置處理組織，30min即可達到較好貼壁效果。側置處理的組織塊培養(yǎng)至第4～5天可見細胞爬出，倒置處理的組織塊培養(yǎng)至第6天可見細胞爬出。鵝卵石樣乳腺上皮細胞后于成纖維細胞爬出，兩者間有明顯界限（圖2A）；部分組織可直接爬出鵝卵石樣上皮細胞，無成纖維細胞爬出（圖3）。回收的組織接種后第2天即有細胞爬出，且鵝卵石樣細胞比例較高。

2.2 奶牛乳腺上皮細胞純化

成纖維細胞消化30～60s，乳腺上皮細胞消化2～3.5min，純化2～3次即可得到較純的奶牛乳腺上皮細胞。純化過程中，對乳腺上皮細胞進行一次瓶內消化平鋪，可解決細胞團塊中心部位密度過大的問題（圖2B）。

2.3 奶牛乳腺上皮細胞形態(tài)學特征

奶牛乳腺上皮細胞呈單層生長，鵝卵石樣聚集，呈島嶼狀生長，有少部分細胞呈多角型、攤雞蛋樣和梭形等，大小不一（圖4A），但其與成纖維細胞的形態(tài)差異極大（圖4C、D）。乳腺上皮細胞的細胞核呈圓形或橢圓形，細胞間可見上皮細胞特有的拉網結構，存在接觸抑制現(xiàn)象。細胞傳至20代后，扁平圓餅狀極性細胞數(shù)量增多，也有三角形、長形、多邊形極性細胞（圖4B）。

在掃面電鏡下細胞輪廓清晰，大小不一。鵝卵石樣乳腺上皮細胞的細胞核呈橢圓形，邊緣不光滑，攤雞蛋樣細胞中央有皺褶，表面較光滑，細胞體積較大（圖4E、F）。電鏡掃描下新鮮組織培養(yǎng)的上皮細胞和凍存組織培養(yǎng)的細胞形態(tài)基本相同。

2.4 奶牛乳腺上皮細胞的鑒定

用熒光標記第5代乳腺上皮細胞角蛋白18，熒光顯微鏡下可觀察到大量陽性細胞，且其細胞核位置與細胞核染色位置基本重合，表明本研究成功獲得純化的奶牛乳腺上皮細胞（圖5A、B、C）。

圖2 細胞原代培養(yǎng)（Nikon，10×）Fig.2 Cell primary culture（Nikon，10×）

圖3 形態(tài)學觀察比較（10×）Fig.3 Comparison of morphology（10×）

2.5 奶牛乳腺上皮細胞穩(wěn)定性

側置與倒置處理得到的細胞生長速度和形態(tài)學無明顯差異，傳至第10代的細胞形態(tài)和生長速度基本一致；20代后細胞生長速度雖無明顯變化，但形狀不規(guī)則的極化細胞逐漸增多（圖5D、E、F）。

2.6 凍存奶牛乳腺組織活性與培養(yǎng)細胞形態(tài)觀察

分別取凍存液A和B中的組織塊進行分離培養(yǎng)，每天爬出細胞的組織塊數(shù)見表1。來自于凍存液A的組織塊存活率為50%，來自凍存液B的組織塊存活率為56%。結果顯示凍存液B對組織塊的保存效果較好。

圖4 奶牛乳腺上皮細胞形態(tài)學觀察Fig.4 The morphology of bovine mammary epithelial cell

圖5 免疫熒光鑒定角蛋白18（20×）Fig.5 The immunofluorescence assay of cytokeratin 18（20×）

表1 組織塊存活率Table 1 Survival rate of tissue piece 　塊·d－1

形態(tài)學觀察結果表明，凍存組織在第4天有細胞爬出，且其與新鮮組織爬出的細胞形態(tài)無明顯差別；部分組織塊也可直接爬出鵝卵石樣奶牛乳腺上皮細胞（圖3）。鑒定純化結果顯示，乳腺上皮細胞有角蛋白18表達。

3 討 論

3.1 組織材料的選擇

哺乳動物乳腺腺泡通常到妊娠中晚期或泌乳期才能充分發(fā)育，泌乳后期又開始萎縮，是一個循環(huán)的組織重塑過程［9］。一般認為，取自妊娠中晚期或泌乳期的乳腺組織較易獲得乳腺上皮細胞，因此利用健康的4～7歲泌乳高峰期或泌乳中后期的奶牛乳腺組織，培養(yǎng)乳腺上皮細胞報道較多［1，10－12］。也有研究表明，非泌乳期乳腺組織也可用于乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)。如M.Jedrzejczak等和G.Rauner等報道，利用小母牛乳腺組織分離、培養(yǎng)乳腺上皮細胞的效率高，獲得的原代細胞活性好［13－14］。本試驗所選奶牛（24月齡）已達到性成熟，無泌乳史，可避免泌乳期乳腺組織初乳不易清洗的問題，獲得的乳腺上皮細胞生長速度快，可隔天傳代。試驗結果提示，腺泡未得到充分發(fā)育的奶牛乳腺組織也可用于乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)。

3.2 組織材料的處理

細菌污染是困擾奶牛乳腺上皮細胞原代培養(yǎng)的主要問題，其主要原因有兩方面：一是奶?；茧[性乳房炎，其乳腺組織帶菌，一般難控制、不易消除；二是人為污染。本研究通過三個環(huán)節(jié)克服以上問題：（1）選擇無泌乳史奶牛，患隱性乳房炎概率極低，可以保證乳腺組織不帶菌；（2）注意無菌轉移，組織塊短時間浸于75%酒精中轉移至無菌操作臺，可保證組織表面無菌；（3）提高培養(yǎng)液和D－Hank’s中抗生素濃度，高于報道用量5倍，待細胞爬出后，再逐漸降低抗生素濃度，可保證組織塊處理和初期培養(yǎng)過程中對可能存在細菌產生及時有效的抑制作用。

3.3 側置處理的優(yōu)勢

本試驗中采用側置處理組織塊中乳腺上皮細胞爬出時間為4～5d，倒置處理組織塊中乳腺上皮細胞爬出時間為6～7d，側置比倒置縮短了1～2d。分析認為，側置處理能夠盡快瀝干組織塊表面液體，這有利于組織塊的快速貼壁，能更好地保持組織活力。乳腺上皮細胞免疫熒光鑒定和傳代試驗結果表明，兩種方法得到的乳腺上皮細胞特異性角蛋白18表達水平和增殖效果基本一致?？梢?，側置處理較常用的倒置［15］處理優(yōu)勢在于縮短組織塊種植法培養(yǎng)乳腺上皮細胞的周期。

3.4 形態(tài)學特征

據報道，體外培養(yǎng)的上皮細胞有3種類型：分泌上皮細胞、導管上皮細胞、肌上皮細胞。傳統(tǒng)的差速貼壁法和差時消化法很難將這3種上皮細胞分開，需要通過密度梯度離心的方法才能將其分開［16－17］。本試驗熒光鑒定結果顯示，分離獲得的乳腺上皮細胞均能表達上皮細胞特有的角蛋白18，但其形態(tài)不一，推測可能有以上3種類型上皮細胞。掃描電鏡下分離到的乳腺上皮細胞呈鵝卵石樣，這與劉明江觀察到的結果［18］類似。但本試驗觀察到的攤雞蛋樣乳腺上皮細胞還未見報道。

3.5 奶牛乳腺組織凍存法

組織凍存技術目前在遺傳育種、生物醫(yī)療領域已得到廣泛應用，不僅可以保存稀缺組織，同時可以減少某些研究需要反復取材培養(yǎng)的麻煩。本研究采用凍存較大組織塊（4～5mm3）的方法保存奶牛乳腺組織，經－80℃一步冷凍過夜后于液氮中保存8個月，凍存液A保存的乳腺組織成活率為50%，凍存液B保存的乳腺組織成活率為56%。本方法雖比孫蘇軍等［19］采用小組織塊（d＜0.3mm）和梯度凍存法保存的山羊乳腺組織塊復蘇后成活率（89.8%）低，但可大大簡化組織塊剪切、清洗、凍存和復蘇等操作過程，且凍存液中加入緩沖液HEPES/丙酮酸鈉后有利于組織塊生物活性的保持，能夠滿足細胞分離培養(yǎng)的需要。

4 結 論

在利用組織塊種植法培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞過程中，應用側置處理法與組織塊回收法，從無泌乳史奶牛乳腺組織中成功分離培養(yǎng)出了奶牛乳腺上皮細胞；在乳腺組織凍存過程中，發(fā)現(xiàn)凍存液中加入緩沖液HEPES/丙酮酸鈉后有利于組織塊生物活性的保持，采用一步凍存較大奶牛乳腺組織塊仍可保持其活性，能滿足乳腺上皮細胞分離培養(yǎng)需要。

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（編輯 白永平）

Cryopreservation of the Mammary Gland and Improvement on the Culture of the Primary Epithelial Cells in Holstein Dairy Cows

LIN Jie，WANG Xu－rong，WANG Lei，ZHANG Jing－yan，WANG Xue－zhi，MENG Jia－ren，YANG Zhi－qiang*，LI Jian－xi*
（Engineering ＆Technology Research Center of Traditional Chinese Veterinary Medicine of Gansu Province，Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Science of CAAS，Lanzhou730050，China）

Abstract：The present study was performed to improve the process of tissue explant method and explore the cryopreservation method of bovine mammary gland.The mammary epithelial cells were isolated and cultured from the fresh and cryopreserved（8mouths）mammary gland that collected from a 24months’Holstein dairy cow without history of lactation by tissue explant method including the side－place and inversion pattern respectively.Side－place method could shorten 1－2 days for appearance of cell，and improve the speed and adherence effect of tissue pieces，and the cells could climb out on the second day from the tissue pieces that were cultured and moved another flask.The survival rate was 50%for the tissue mass by liquid nitrogen storage followed by one－step cryopreservation（－80℃）with freeze－stored solution FBS∶DMSO∶DMEM/F12＝7∶2∶1while the survival rate was 56%with freeze－stored solution FBS∶DMEM/F12∶DMSO∶HEPES/sodium pyruvate＝10∶7∶2∶1.The side－place method and tissue pieces recycling method were established for mammary epithelial cells culture in the presented study，which couldshorten the cycle of tissue explant method.And the buffer HEPES/sodium pyruvate was benefit for maintaining the tissue bioactivity.

Key words：mammary epithelial cells；side－place method；tissue cryopreservation；primary cultural；dairy cow

中圖分類號：S858.237.26

文獻標志碼：A

文章編號：0366－6964（2016）05－1067－08

doi：10.11843/j.issn.0366－6964.2016.05.027

收稿日期：2015－09－21

基金項目：國家奶牛產業(yè)技術體系（CARS37）；公益性行業(yè)專項（20130304）

作者簡介：林 杰（1991－），女，滿族，河北唐山人，碩士生，主要從事奶牛疾病研究，Tel：0931－2115262，E－mail：qielinjie2009@163.com

*通信作者：楊志強，研究員，主要從事臨床獸醫(yī)學與奶牛疾病防治研究，E－mail：zhiqyang2006@163.com；李建喜，研究員，主要從事獸醫(yī)藥理毒理與中獸醫(yī)學研究與應用，E－mail：lzjianxil@163.com