孔祥偉，王 丹，王世新，王海明，楊樹青，孫淑紅

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12株禽痘疫苗毒中禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒5′LTR整合位點(diǎn)的比較研究

孔祥偉＃，王 丹＃，王世新，王海明，楊樹青，孫淑紅*

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安271018）

摘 要：為探究近年來禽痘（FP）疫苗中禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒（REV）5′長末端重復(fù)序列（LTR）的整合情況，收集2012—2014年不同地區(qū)不同批次的12株FP疫苗，稀釋后接種雞胚成纖維細(xì)胞（CEF），提取細(xì)胞DNA，擴(kuò)增REV相關(guān)基因并測定序列。結(jié)果表明，12個(gè)禽FP疫苗株均擴(kuò)增出含REV－5′LTR和FPV片段在內(nèi)的產(chǎn)物，其中2株國外疫苗擴(kuò)增序列長度為745bp，10株國產(chǎn)疫苗擴(kuò)增序列長度為485bp。經(jīng)DNA－Star比對(duì)分析，2株國外疫苗整合了446bp的幾乎完整的REV－LTR序列，另外10株國產(chǎn)疫苗整合的REV－LTR片段相對(duì)較小，僅為194 bp。這12個(gè)FP疫苗株中整合的REV－LTR與中國近年分離到的REV野毒株HA1101的LTR的相似性為70.3%～82.6%，與國外已發(fā)表的FP毒株AY255632整合的REV－LTR的相似性高達(dá)98.6%～100%。結(jié)果提示，國內(nèi)外FP疫苗整合有REV－LTR序列的現(xiàn)象普遍存在。本研究檢測的12個(gè)FP疫苗株均整合有REV－LTR序列，一部分疫苗株整合了幾乎完整的REV－LTR序列，而大部分疫苗株整合片段則相對(duì)較小，并且與國外已分離到的FP毒株的序列同源性更接近。

關(guān)鍵詞：禽痘疫苗；禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒；5′LTR

禽痘（fowl pox，F(xiàn)P）是由痘病毒科、脊椎動(dòng)物痘病毒亞科、禽痘病毒屬中的禽痘病毒（fowl pox virus，F(xiàn)PV）引起的家禽的一種急性、接觸性傳染病。FPV感染雞只在臨床上主要表現(xiàn)為皮膚型、白喉型，或者混合型3種類型。目前，世界范圍內(nèi)使用FP疫苗接種的方式已經(jīng)對(duì)FPV的傳播起到了很好的控制作用。然而，近年來，該病由于FPV基因組的變異以及與其他病毒的重組現(xiàn)象的發(fā)生又以新的形式暴發(fā)。丁家波等［1］在2004年首次報(bào)道FPV基因組中整合有禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒（reticuloendothliosis virus，REV）基因以來。近幾年陸續(xù)有分離到的FPV野毒株中含有REV前病毒全基因序列，疫苗株整合有REV的LTR（long terminal repeats）片段或者是全基因序列的報(bào)道［2－4］。目前，F(xiàn)P的高發(fā)病率和免疫失敗，給FP的防治工作帶來了新的挑戰(zhàn)。作者選取10株國產(chǎn)FP疫苗株及2株國外FP疫苗株，對(duì)不同疫苗廠家生產(chǎn)的FP疫苗株中REV－LTR序列進(jìn)行對(duì)比分析，了解FP疫苗中整合REV序列的情況，同時(shí)進(jìn)一步比較國內(nèi)及國外FP疫苗整合REV序列的差異，為有效預(yù)防FP及RE提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 疫苗株及主要試劑

12個(gè)FPV疫苗株購自2012－2014年國內(nèi)外不同批次、不同地區(qū)的生產(chǎn)廠家，編號(hào)為C1～C10、F1～F2，其中F1～F2為國外疫苗。pMD18－T、DNA Marker DL2000和DL15000均購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購自美國Biomiga公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；感受態(tài)細(xì)胞Trans－5α購自北京全式金公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)雞胚

SPF雞胚購自濟(jì)南賽斯家禽有限公司。

1.3 PCR用DNA模板的制備

將12個(gè)不同地區(qū)不同批次的禽痘疫苗產(chǎn)品分別以5mL PBS稀釋后接種長至單層的CEF，培養(yǎng)至出現(xiàn)80%細(xì)胞病變時(shí)，將細(xì)胞消化收獲，提取細(xì)胞DNA。以所提取的DNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.4 引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)程序

合成一對(duì)上下游分別來自FPV的ORF201和ORF203用于擴(kuò)增FPV－REV 5′LTR整合區(qū)的引物［2］，引物序列：5′－AACAATGATACGTCTCTTCC－3′（F）；5′－CACACGAATATACCAATAAGG－3′（R）。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min；56℃退火1min；72℃延伸6min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

另外，合成4對(duì)用于擴(kuò)增REV LTR、Env、Gag、Pol的引物，引物序列如下，①Gag－F：5′－TCGGTACAACATTTGGGGGCT－3′，Gag－R：5′－TTAGACATAGGCCCCACAG－3′；②Pol－F：5′－ATTATAGGGGCTACTGGGAAC－3′，Pol－R：5′－TGCTCGCCTGGTCAACTTTAC－3′；③Env－F：5′－ATGGACTGTCTCACCAACCT－3′，Env－R：5′－TTGACCTAGGGTATCCATCT－3′；④LTR－F：5′－AATGGTTGTAAAGGGCAGAT－3′，LTR－R：5′－CTCCTCTCACTGCCAATCT－3′。

GagPCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性5min；52℃退火30s；72℃延伸2.5min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7min。Pol PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s；53℃退火30 s；72℃延伸4min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。Env PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min；95℃變性1min；60℃退火30s；72℃延伸1.5min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。LTRPCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min；95℃變性1min；60℃退火30s；72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。

1.5 PCR產(chǎn)物純化

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并采用膠回收試劑盒回收、克隆于pMD18－T載體中由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.6 測序及基因分析

對(duì)10個(gè)FP疫苗株和隨機(jī)挑選的4個(gè)分離株進(jìn)行測序，測序結(jié)果采用DNA－Star軟件進(jìn)行序列拼接、比對(duì)、同源性分析并生成基因進(jìn)化樹。

2 結(jié) 果

2.1 FPV疫苗株中REV整合區(qū)的PCR擴(kuò)增

以接種疫苗的CEF抽提cDNA為模板，采用特異性引物對(duì)FPV－REV 5′LTR整合區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。12個(gè)FP疫苗株均擴(kuò)增出含REV－5′LTR和FPV片段在內(nèi)的產(chǎn)物，其中10個(gè)國內(nèi)疫苗株片段長度約為500bp，2個(gè)國外疫苗株片段長度較國產(chǎn)疫苗長，約為800bp。結(jié)果見圖1。

2.2 禽痘疫苗整合區(qū)測序結(jié)果及其序列分析

2.2.1 國產(chǎn)禽痘疫苗整合區(qū)序列分析 測序結(jié)果表明，10個(gè)國產(chǎn)FP疫苗株的序列長度為485bp，經(jīng)DNA－Star比對(duì)分析表明，10個(gè)國內(nèi)疫苗株整合的REV－LTR片段為194bp且高度同源，與中國近年分離到的REV野毒株HA1101、HA9901的相似性分別為98.5%和96.4%，與美國REV標(biāo)準(zhǔn)株SNV的相似性為94.3%（詳細(xì)數(shù)據(jù)略）。其基因進(jìn)化樹結(jié)果見圖2。

圖1 禽痘疫苗整合區(qū)PCR凝膠電泳Fig.1 Amplification of REV integrated regions of FPV vaccine by PCR

圖2 國產(chǎn)禽痘疫苗株整合REV－LTR基因進(jìn)化樹Fig.2 Genetic evolution tree of integrated LTRfor FPV vaccine strains of China

10個(gè)國產(chǎn)FP疫苗株整合區(qū)與國外已發(fā)表的FP毒株AY255632、HP－438［Munich］中的REV－LTR的相似性分別為98.6%和100%。其基因進(jìn)化樹結(jié)果見圖3。

圖3 國產(chǎn)禽痘疫苗株整合REV－LTR基因進(jìn)化樹Fig.3 Genetic evolution tree of integrated sector for FPV vaccine strains

2.2.2 國外禽痘疫苗整合區(qū)序列 測序結(jié)果表明，2個(gè)國外FP疫苗株的序列長度為745bp，經(jīng)DNA－Star比對(duì)分析表明，整合的REV－LTR片段為446bp，大于國產(chǎn)FP疫苗株。與中國近年分離到的REV野毒株HA1101、HA9901的相似性為98%，與美國REV標(biāo)準(zhǔn)株SNV的相似性為94.3%。但整合區(qū)與AY255632中的REV－LTR相似性達(dá)到100%（圖略）。

2.3 FPV疫苗株中REV Env、Gag、Pol基因的PCR擴(kuò)增

12個(gè)FP疫苗株均未擴(kuò)增到REV的Env、Gag、Pol基因，表明所檢測疫苗只整合REV－LTR序列，并未有REV其他基因序列的插入（圖略）。

3 討 論

禽痘（FP）是由禽痘病毒（FPV）引起的一種接觸性傳染病，能夠感染不同品種和日齡的雞，但是對(duì)雛雞的易感性最高。FPV感染雞只在臨床上主要表現(xiàn)為皮膚型、黏膜型以及混合型3種類型。禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥（RE）是由逆轉(zhuǎn)錄病毒科的禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（REV）引起的雞、鴨、火雞和其他禽類的一種以淋巴－網(wǎng)狀細(xì)胞增生為特征的腫瘤性病理綜合征。以引起免疫抑制及死亡為特征。目前，REV基因片段整合進(jìn)FP疫苗、基因片段甚至完整的基因組整合進(jìn)FPV野毒株已成為普遍現(xiàn)象，國內(nèi)外均對(duì)此有報(bào)道［1－6］。在21世紀(jì)90年代末期，美國和澳大利亞先后發(fā)現(xiàn)FP疫苗中污染有REV，澳大利亞學(xué)者還發(fā)現(xiàn)痘病毒疫苗的基因組中整合了REV前病毒的LTR序列，隨后，不斷有學(xué)者報(bào)道這一整合現(xiàn)象。丁家波等［1］于2004年首次證明了疫苗株和野毒株都整合有REV基因成分。于立娟等［2］首次對(duì)我國疫苗株和野毒株插入的REV－LTR的整合位點(diǎn)進(jìn)行了分析。盡管越來越多的人傾向于雞痘的高發(fā)率、雞痘疫苗的免疫失敗及患痘雞的后續(xù)病癥可能與REV基因整合進(jìn)FPV有關(guān)，但整合REV基因的FPV的毒力是否因此改變，目前尚未見相關(guān)的研究報(bào)道。同時(shí)由于REV污染了FP疫苗導(dǎo)致FPV免疫雞群REV感染或FP免疫失敗的現(xiàn)象偶有發(fā)生，2010年，王景艷等［7］用PCR和IFA方法首次從禽痘弱毒疫苗中分離到REV活毒。FP疫苗中存在傳染性的REV會(huì)造成疫苗接種過程中REV的感染，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，這一現(xiàn)象應(yīng)該引起高度重視。

本研究對(duì)收集的2012—2014年國內(nèi)外不同地區(qū)、不同批次的12個(gè)FP疫苗株進(jìn)行了熱點(diǎn)整合區(qū)序列的擴(kuò)增以及REV LTR、Env、Gag、Pol片段的擴(kuò)增，結(jié)果只擴(kuò)增出了REV－LTR一部分片段，并且10株國產(chǎn)疫苗的擴(kuò)增片段小于國外進(jìn)口疫苗（國產(chǎn)疫苗插入片段長度為194bp，國外疫苗插入片段為446bp），這與之前的報(bào)道相符。12株疫苗都沒有擴(kuò)增出REV的其他片段，表明所研究的疫苗只整合了REV的部分序列，并且根據(jù)測序結(jié)果及同源性比較，擴(kuò)增出的REV片段與REV標(biāo)準(zhǔn)分離株HA9901、HA1101和REV標(biāo)準(zhǔn)株SNV的同源性并不高，但與國外報(bào)道的FPV整合區(qū)高度同源。由此推測，F(xiàn)P疫苗株也可能最初從國外引進(jìn)時(shí)就已整合了REV－LTR，只是在國內(nèi)生產(chǎn)過程中發(fā)生了極少的變異。

但目前FP的高發(fā)病率是否由于FPV野毒株的毒力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致FP疫苗的免疫保護(hù)力下降？同時(shí)，目前國內(nèi)外廣泛應(yīng)用FP疫苗均整合有部分REV－LTR序列，這是否成為免疫保護(hù)性下降的原因有待于進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn)（References）：

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（編輯 白永平）

Comparative Analysis of Integration Sites of Reticuloendotheliosis Virus 5′LTR in 12Fowl Pox Vaccine Strains

KONG Xiang－wei＃，WANG Dan＃，WANG Shi－xin，WANG Hai－ming，YANG Shu－qing，SUN Shu－h(huán)ong*
（Animal Science and Technology College，Shandong Agricultural University，Tai′an 271018，China）

Abstract：To study the integration sites of avian reticuloendothliosis virus（REV）5＇long terminal repeat（LTR）in fowl pox virus（FPV）vaccine strains in recent years，12different batches of FPV vaccines in different regions from 2012to 2014were collected for study.All vaccines were diluted and inoculated into chicken embryo fibroblast（CEF），DNA was extracted for the amplification and sequencing of REV relating genes.（Result）The results showed that both REV－5′LTR and FPV fragments existed in the 12FPV vaccine strains.To be specific，745bp in the 2abroad vaccine strains and 485bp in the other 10domestic vaccine strains.By DNA－Star analysis，446bp as almost the entire REV－LTR were integrated in the 2abroad vaccine strains，while，apart of the REV－LTR fragment about 194bp were integrated in the 10domestic vaccine strains.The integrated REV－LTR sequence among the 12FPV vaccine strains had 70.3%－82.6%homology with the Chinese reference strain HA1101.But it had as high as 98.6%－100%homology with REVLTR in the published abroad PFV strain AY255632.The results suggested that the phenomenonof the integration of REV－LTR sequence in FP vaccine is common at home and abroad.In our study，the 12fowl pox vaccine strains were all integrated with REV－LTR sequence，part of the FPV vaccine strains were integrated with the complete REV－LTR sequence.While the fragment in most FPV vaccine strains was relatively small，and these sequences have a closer homology to the abroad FPV.

Key words：fowl pox vaccine；reticuloendothliosis virus；5′LTR

中圖分類號(hào)：S852.659.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366－6964（2016）05－1062－05

doi：10.11843/j.issn.0366－6964.2016.05.026

收稿日期：2015－10－10

基金項(xiàng)目：山東省科技發(fā)展計(jì)劃（2014GNC110006）

作者簡介：孔祥偉（1989－），女，山東肥城人，碩士，主要從事禽病學(xué)研究，E－mail：xiangweik0909@163.com；王 丹（1990－），女，山東萊州人，碩士生，主要從事禽病學(xué)研究，E－mail：15215385357@163.com，二人共為同等貢獻(xiàn)作者

*通信作者：孫淑紅，教授，主要從事家禽病毒病研究，E－mail：sunshuhong@sdau.edu.cn