蛋白磷酸酶2A催化亞基α在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞遷移中的作用研究

王慶華，王生存，李　斌，劉　春，吳劉成，王　旭，邵義祥*

(1.南通大學(xué)實驗動物中心，江蘇南通 226001； 2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，江蘇南通 226001)

?

蛋白磷酸酶2A催化亞基α在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞遷移中的作用研究

王慶華1，王生存1，李斌2，劉春1，吳劉成1，王旭1，邵義祥1*

(1.南通大學(xué)實驗動物中心，江蘇南通 226001； 2.南通大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，江蘇南通 226001)

摘要：利用體外基因敲除技術(shù)檢測小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)周期和遷移能力的變化，探究蛋白磷酸酶2A的Cα亞基在MEFs細(xì)胞遷移過程中的作用。用Cαfl/fl的純合子雄鼠與雌鼠1∶2配對，取E12.5 d的胚胎制作小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。利用表達(dá)Cre重組酶(Ad-Cre-EGFP)以及GFP熒光蛋白(Ad-EGFP)的腺病毒載體，對P3代MEFs進(jìn)行感染，分別用PCR，RT-PCR和Western blot方法進(jìn)行基因型鑒定。同時利用流式分選技術(shù)檢測感染后MEFs的細(xì)胞周期的變化，利用細(xì)胞劃痕試驗檢測了其細(xì)胞遷移能力的變化。結(jié)果顯示，胰酶消化的方法成功獲得了小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，DNA，RNA和蛋白水平的鑒定獲得了3對3的野生型和基因敲除MEFs。流式分選發(fā)現(xiàn)Ad-Cre處理的MEFs與Ad-EGFP處理的MEFs相比，處于G2期的細(xì)胞比例為30.8%±2.57%，高于Ad-EGFP MEFs的23.9%±2.46%，并且細(xì)胞碎片的比例也遠(yuǎn)高于后者。劃痕試驗表明，Cα亞基缺失后細(xì)胞遷移能力下降，12 h就顯著低于對照組。結(jié)果表明，腺病毒攜帶的Cre重組酶能夠在體外有效地敲除掉MEFs中的蛋白磷酸酶2A的Cα亞基，PP2A Cα亞基的缺失會導(dǎo)致MEFs細(xì)胞周期傾向于阻滯在G2期，并會降低細(xì)胞遷移的能力。

關(guān)鍵詞：蛋白磷酸酶2A；小鼠胚胎成纖維細(xì)胞；細(xì)胞遷移；細(xì)胞周期

細(xì)胞遷移在多個生命過程中發(fā)揮著重要的作用，例如胚胎發(fā)育、血管生成、神經(jīng)生長、組織修復(fù)、炎癥反應(yīng)、動脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥以及侵襲和轉(zhuǎn)移過程。有很多信號通路參與其中的調(diào)節(jié)過程，磷酸化作為一個快速發(fā)生并且可逆的蛋白翻譯后修飾的過程是其中重要的機制之一[1]。在T淋巴細(xì)胞中，蛋白磷酸酶I和蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)能夠與cofilin結(jié)合并使之去磷酸化從而促進(jìn)細(xì)胞的遷移過程[2]。PP2A通過B′亞基定位到細(xì)胞黏著點并與paxillin結(jié)合使之酪氨酸基團(tuán)去磷酸化促進(jìn)細(xì)胞遷移[3-4]。

PP2A是30多個絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶之一，其結(jié)構(gòu)亞基A和催化亞基C各具有α和β異構(gòu)體，其具有4種不同的調(diào)節(jié)亞基家族，可以組成100多種不同的全酶，能使眾多底物去磷酸化，從而影響細(xì)胞的遷移、分化和凋亡[5]。其中Cα的表達(dá)量為Cβ的10倍。PP2A蛋白表達(dá)量高，在有的細(xì)胞中能達(dá)到總蛋白的1%[6]。PP2A的催化活性受到許多因素的調(diào)節(jié)，如調(diào)節(jié)亞基、翻譯后修飾、抑制性蛋白質(zhì)、第二信使和酶抑制劑等[7-8]。在Ahnak 敲除的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)中，PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate )刺激PKC-α和Raf的磷酸化程度上升的能力降低，主要是因為PP2A在Ahnak缺失的條件下對PKC-α和Raf的結(jié)合能力增強，從而促進(jìn)其脫磷酸化[9]。PP2A-B55α和Cdc14B在MEFs中相互作用，進(jìn)而影響DNA雙鏈斷裂后的修復(fù)過程[9]。PP2A能夠與Pin1和AMPK互作，進(jìn)而影響MEFs細(xì)胞周期[10]。本研究通過腺病毒載體表達(dá)的Cre重組酶在體外敲除MEFs的PP2A Cα亞基，通過流式細(xì)胞分選技術(shù)檢測了其細(xì)胞周期以及細(xì)胞遷移能力的改變，探討了Cα亞基在細(xì)胞遷移過程的作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑DAPI(D9542)，Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；實時定量熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒，南京諾維贊公司產(chǎn)品；Trizol，TaKaRa公司產(chǎn)品；PI(Propidium iodide)染色液，Sigma公司產(chǎn)品；Western blot抗體PP2A-C(#80665)，Santa Cruz 公司產(chǎn)品；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.1.2實驗動物PP2A Cα敲除鼠和同窩野生型對照鼠均來自于南京大學(xué)模式動物研究所，品系為C57BL/6J，共12只，其中雄鼠4只，雌鼠8只，10周齡，飼養(yǎng)于SPF級屏障環(huán)境中，自由采食，明暗周期為12 h/12 h。使用許可證號為SYXK(蘇)2012-0031。

1.1.3腺病毒表達(dá)Cre重組酶(Ad-Cre-EGFP)以及GFP熒光蛋白(Ad-EGFP)的腺病毒載體由南京大學(xué)模式動物研究所饋贈，利用293A細(xì)胞進(jìn)行擴增純化后備用。

1.2方法

1.2.1小鼠胚胎成纖維細(xì)胞分離及腺病毒感染用Cαfl/fl的純合子雄鼠與雌鼠(來自南京大學(xué)模式動物研究所)以1∶2比例配對，配2籠，每天8：00之前檢查小鼠陰道栓，見栓當(dāng)天胚齡記為0.5 d(0.5 days postcoitum，0.5 dpc)。取11.5 dpc胚胎，尾巴留作基因型鑒定用，去除頭、內(nèi)臟及四肢，剪碎后2.5 g/L的胰酶在37℃水浴中振蕩消化20 min，3 000 r/min離心3 min，去上清后10% FBS的DMEM(高糖)重懸，均勻接種到6 cm培養(yǎng)皿中，次日換液。根據(jù)基因型鑒定結(jié)果留3對3野生型和敲除鼠胚胎成纖維細(xì)胞作為試驗用，標(biāo)記為P1代。本研究使用P3代細(xì)胞作為研究對象。用病毒數(shù)和細(xì)胞數(shù)1∶1的比例感染MEFs，每個10 cm培養(yǎng)中加入3 mL的5% FBS-DMEM，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后加入7 mL的全培養(yǎng)基繼續(xù)感染過夜，次日換液并復(fù)染DAPI后進(jìn)行檢測GFP熒光，如果感染率較低則再次感染。

1.2.2流式細(xì)胞儀分選檢測細(xì)胞周期和凋亡取P3代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，胰酶消化后收集，計數(shù)，以1×106cells/100 μL的量加入FACS分選管。加1 mL PBS清洗細(xì)胞，500 r/min離心5 min，去上清。重復(fù)洗一次后用100 μL流式細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞，加入10 μL PI染色液，混勻，冰上或者室溫避光孵育10 min～15 min。上機進(jìn)行流式分析。

1.2.3細(xì)胞劃痕試驗檢測細(xì)胞遷移能力先用Marker筆在6孔板背后均勻地劃橫線，每隔0.5 cm～1 cm一道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。每孔中加入約5×105個細(xì)胞。第2天用槍頭沿著直尺劃痕。用PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按0、6、12、24 h取樣，拍照后用Imag J軟件進(jìn)行分析。

1.2.4基因型鑒定及基因表達(dá)檢測用PCR和RT-PCR法進(jìn)行基因型鑒定。常規(guī)酚氯仿法抽提小鼠胚胎成纖維細(xì)胞DNA，使用25 μL體系用引物P2 F/R進(jìn)行PCR擴增，59℃退火，35個循環(huán)，產(chǎn)物用20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。用Trizol抽取胚胎成纖維細(xì)胞RNA，去除基因組DNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板用引物EXdel F/R進(jìn)行PCR擴增，58℃退火，20個循環(huán)，產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。熒光定量PCR檢測以cDNA為模板用SYBR Premix EXTaq體系進(jìn)行擴增，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。引物為P4 F/R(表1)。 收集細(xì)胞后用RIPA裂解液提取蛋白，BCA法測定濃度后加入上樣緩沖液煮沸變性5 min，80 g/L的SDS-PAGE膠電泳分離，100V電泳90 min，濕法轉(zhuǎn)膜80 min后，50 g/L脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃過夜。TBST洗滌5 min，3次，二抗室溫孵育1 h后ECL顯影。

表1　引物序列

2結(jié)果

2.1MEFs制作和基因型鑒定

利用腺病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了表達(dá)Cre-EGFP(Ad-Cre)的試驗組病毒以及僅表達(dá)EGFP(Ad-EGFP)的對照病毒，用293A細(xì)胞進(jìn)行大量擴增后超速離心純化，分裝凍存于-80℃?zhèn)溆?。用來自E12.5的小鼠胚胎制作成小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)，記為P1代。取P3代MEFs進(jìn)行病毒感染，檢測GFP熒光表達(dá)判斷感染效率(圖1)，并取感染后細(xì)胞提取DNA，RNA和蛋白進(jìn)行基因型鑒定。以DNA為模版，用引物P2 F/R進(jìn)行PCR擴增分別檢測5′端的LoxP位點，產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，在5′端會檢測到593 bp的LoxP條帶和369 bp的野生型條帶(圖2A上)。用引物Exdel F/R進(jìn)行PCR擴增檢測基因敲除后殘余片段，產(chǎn)物用20 g/L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，敲除鼠MEFs獲得了339 bp條帶，而野生型鼠MEFs則沒有條帶(圖2A下)。RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，作為模版用P4 F/R引物檢測外顯子缺失情況，電泳檢測會觀察到451 bp的剪切后條帶和877 bp的野生型條帶(圖2B)。在此基礎(chǔ)上，Western blot檢測MEFs細(xì)胞中PP2AC的表達(dá)，純合子中PP2AC蛋白表達(dá)量顯著降低，并沒有完全消失，這是由于C亞基的高度同源性導(dǎo)致抗體不能完全區(qū)分這兩個亞基(圖2C和圖2D)。

圖1　腺病毒感染效率免疫熒光觀察結(jié)果(10×)

A． 以DNA為模板，用P2 F/R引物檢測5′端LoxP位點，用Exdel F/R引物檢測敲除后殘余片段；B． 以cDNA為模板，用P4 F/R引物通過RT-PCR檢測敲除效率；C． 提取感染后MEFs細(xì)胞蛋白，用Western blot檢測PP2AC的表達(dá)；D． Western blot結(jié)果的灰度分析統(tǒng)計。其中1表示Cαfl/fl:Ad-Cre，2表示Cαfl/+:Ad-Cre，3表示Cαfl/+:Ad-EGFP，4表示Cαfl/fl:Ad-EGFP。

A． PCR amplification of 5′ LoxP site with primers P2 F/R,and of residue fragment after deletion by Cre recombinase with primers Exdel F/R； B． RT-PCR investigation on knockout efficiency with primers P4 F/R using cDNA as template；C． Western blot analysis on the protein expression of PP2AC in knockout MEFs and the control；D． Density analysis on the Western blot bands.1 indicates Cαfl/fl:Ad-Cre,2 indicates Cαfl/+:Ad-Cre,3 indicates Cαfl/+:Ad-EGFP,4 indicates Cαfl/fl:Ad-EGFP

圖2腺病毒感染后MEFs細(xì)胞敲除效率檢測

Fig.2Examination of knockout efficiency in MEFs after adenovirus infection

2.2流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

用流式細(xì)胞分選技術(shù)檢測細(xì)胞周期，用PI染色后流式分選，發(fā)現(xiàn)PP2A Cα缺失的MEFs細(xì)胞碎片所占的比例高于野生型細(xì)胞，說明其中細(xì)胞凋亡較高。對流式分選結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)PP2A Cα敲除MEFs(Cafl/fl:Ad-Cre)中處于G2期的細(xì)胞比例為30.8%±2.57%，而野生型MEFs(Cafl/fl：Ad-EGFP)中處于G2期的細(xì)胞比例為23.9%±2.46%，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)二者之間差異并不顯著(圖3A，B)。

2.3細(xì)胞遷移能力的檢測

目前也有很多研究表明PP2A通過去磷酸化作用參與了細(xì)胞遷移的過程。細(xì)胞劃痕試驗是一種常見的研究細(xì)胞遷移的試驗方法，簡單易行，可重復(fù)性較高。因此本研究用細(xì)胞劃痕試驗來檢測缺失催化亞基Cα的情況下MEFs遷移能力的變化。通過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)在劃痕后0 h，6 h二者并沒有顯著性差異。但在12 h時二者差異顯著，敲除后MEFs遷移能力顯著低于野生型MEFs。在24 h二者的差異更顯著(圖4)。

圖3　腺病毒感染后細(xì)胞凋亡檢測

A． 感染后MEFs劃痕試驗光鏡檢測(×10)；B． 劃痕后特定時間點細(xì)胞傷痕剩余距離統(tǒng)計結(jié)果

A.Scratch test on MEFs infected with Ad-Cre-EGFP and Ad-EGFP (×10)；B.Statistics on the distance of MEFs infected with Ad-Cre-EGFP and Ad-EGFP

圖4腺病毒感染后MEFs劃痕試驗結(jié)果

Fig.4Scratch test on MEFs after adenovirus infection

3討論

PP2A是一個廣泛性表達(dá)的蛋白，主要參與蛋白脫磷酸化過程，從而調(diào)控機體的各種生命活動，包括細(xì)胞周期和凋亡過程。細(xì)胞周期(cell cycle)是指連續(xù)分裂細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂所經(jīng)歷的所有過程，包括間期(interphase)和有絲分裂期(M phase)。間期以DNA合成為標(biāo)志，由G0期、間期、G1期和S期構(gòu)成，而M期則完成了細(xì)胞的分裂，從而形成新的細(xì)胞。這過程受到內(nèi)源性“Cyclins-CDKs-CKIs”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)，從而完成器官和組織的發(fā)育。其中Cyclins為正向調(diào)控CDKs的關(guān)鍵因子，而研究表明PP2A(Cdc55/B55)能夠調(diào)節(jié)Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄水平[11]。在T淋巴細(xì)胞中，蛋白磷酸酶I和蛋白磷酸酶2A能夠和cofilin結(jié)合并使之去磷酸化從而促進(jìn)細(xì)胞的遷移過程[2]。PP2A通過B′亞基定位到細(xì)胞黏著點并與paxillin結(jié)合使之絡(luò)氨酸基團(tuán)去磷酸化促進(jìn)細(xì)胞遷移[3-4]。在MEFs細(xì)胞中，PP2A也參與多條信號通路的調(diào)控，進(jìn)而影響MEFs細(xì)胞DNA修復(fù)，周期變化以及遷移[9-10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，利用12.5 d的小鼠胚胎通過胰酶消化的方法成功獲得胚胎成纖維細(xì)胞，利用腺病毒載體表達(dá)系統(tǒng)成功構(gòu)建和擴增了表Cre重組酶和EGFP熒光蛋白的對照腺病毒。通過體外用腺病毒感染MEFs的方法成功建立了PP2A Cα敲除的MEFs細(xì)胞，并直接通過觀察熒光的表達(dá)來判斷感染效率。通過PCR方法鑒定出ppp2ca敲除的MEFs，從而在DNA水平上確認(rèn)了Cα基因已經(jīng)被敲除。接著以cDNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)鑒定出Cα基因在RNA水平上也成功被敲除掉了[12]。最后利用Western blot技術(shù)在蛋白水平上驗證了Cα基因的敲除狀況。可以看出純合子MEFs中PP2A的表達(dá)量顯著低于野生型，但并沒有完全剔除干凈。這是由于Cα和Cβ基因僅在N端有3個氨基酸序列的差異，沒有特異性的抗體進(jìn)行識別，而前者表達(dá)量是后者的10倍[13-14]，Cβ基因的冗余效應(yīng)導(dǎo)致蛋白表達(dá)量檢測不能達(dá)到100%的敲除效率，但整體表達(dá)量的顯著下降也表明敲除是有效的。

本研究PI染色后流式分選結(jié)果顯示，敲除MEFs中處于G2期的比例為30.8%±2.57%，高于野生型MEFs中的23.9%±2.46%，說明敲除Cα后細(xì)胞會傾向于阻滯在G2期，降低其增殖效率，但統(tǒng)計分析并沒有顯著差異(P>0.05)。我們在試驗過程中也觀測到敲除的MEFs中細(xì)胞碎片的比例也高于野生型MEFs，這也部分驗證了敲除Cα可能會增加MEFs凋亡。由于在FACs分選時凋亡細(xì)胞被洗掉，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期并沒有差異。

本研究細(xì)胞劃痕試驗表明，缺失Cα基因?qū)е录?xì)胞遷移能力在12 h后顯著降低(圖4B)。在圖4A中可以觀察到敲除組MEFs雖然劃痕也在緩慢愈合，但愈合速度顯著低于對照組細(xì)胞，表明其遷移能力降低，與目前已發(fā)表的研究結(jié)論相吻合，PP2A功能的缺失導(dǎo)致了cofilin和paxillin不能正常去磷酸化而活性降低，從而不能正常地繼續(xù)細(xì)胞的遷移活動[2]。

綜上所述，PP2A的Cα基因在調(diào)節(jié)MEFs細(xì)胞周期和細(xì)胞遷移過程中具有重要的作用。本研究的結(jié)果顯示，Cα基因的缺失能夠輕微影響小鼠胚胎成纖維細(xì)胞周期，而顯著降低其遷移的能力。對于其具體作用于何種下游底物以及具體的作用機制尚需要進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Larsen M,Tremblay M L,Yamada K M.Phosphatases in cell-matrix adhesion and migration[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2003,4(9):700-711.

[2]Ambach A,Saunus J,Konstandin M,et al.The serine phosphatases PP1 and PP2A associate with and activate the actin-binding protein cofilin in human T lymphocytes[J].Eur J Immunol,2000,30(12):3422-3431.

[3]Ito A,Kataoka T R,Watanabe M,et al.A truncated isoform of the PP2A B56 subunit promotes cell motility through paxillin phosphorylation[J].EMBO J,2000,19(4):562-571.

[4]Jackson J L,Young M R.Protein phosphatase-2A modulates the serine and tyrosine phosphorylation of paxillin in Lewis lung carcinoma tumor variants[J].Clin Exp Metastasis,2002,19(5):409-415.

[5]Janssens V,Goris J.Protein phosphatase 2A:a highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling[J].Biochem J,2001,353(Pt 3):417-439.

[6]Shi Y G.Serine/Threonine phosphatases:Mechanism through structure[J].Cell,2009,139(3):468-484.

[7]Low I C,Loh T,Huang Y,et al.Ser70 phosphorylation of Bcl-2 by selective tyrosine nitration of PP2A-B56delta stabilizes its antiapoptotic activity[J].Blood,2014,124(14):2223-34.

[8]Janssens V,Longin S,Goris J. PP2A holoenzyme assembly:in cauda venenum (the sting is in the tail)[J].Trends Biochem Sci,2008,33(3):113-121.

[9]Lin H,Ha K,Lu G,et al.Cdc14A and Cdc14B redundantly regulate DNA double-strand break repair[J].Mol Cell Biol,2015,35(21):3657-3668.

[10]Khanal P,Kim G,Yun H J,et al.The prolyl isomerase Pin1 interacts with and downregulates the activity of AMPK leading to induction of tumorigenicity of hepatocarcinoma cells[J].Mol Carcinog,2013,52(10):813-823.

[11]Noguchi E.PP2A(Cdc55/B55),a possible therapeutic target in cyclin D1-dependent cancers[J].Cell Cycle,2013,12(10):1484.

[12]蘇春霞，段相國，鄭潔，等．共表達(dá)FMDV VP1-2A基因與豬IL-2重組腺病毒的構(gòu)建及其免疫原性研究[J]．動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014,35(2):1-5．

[13]于艷紅，許杰，李文彬，等.Tau 蛋白磷酸化在阿爾茨海默病中所處的地位[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015,15(8):1573-1576．

[14] 王慶華，王生存，李斌，等. 蛋白磷酸酶2A的Cβ亞基在胚胎成纖維細(xì)胞凋亡過程中的作用[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016,37(2):64-69．

Effects of Catalytic Subunit α of Protein Phosphatase 2A on Cell Migration of Mouse Embryo Fibroblasts

WANG Qing-hua1,WANG Sheng-cun1,LI Bin2,LIU Chun1,WU Liu-cheng1,WANG Xu1,SHAO Yi-xiang1

(1.LaboratoryAnimalCenterofNantongUniversity,Nantong,Jiangsu,226001,China;2.DepartmentofPediatrics,AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong,Jiangsu,226001,China)

Abstract:To investigate the effects of catalytic subunit α of protein phosphatase 2A (PP2A) on cell cycle and cell migration in mouse embryo fibroblasts(MEFs), the mouse embryos were got at E12.5 by mating the heterozygotes of Cα subunit conditional knockout male and female homozygous mice at the ratio of 1∶2.MEFs were prepared by trypsin digestion and genotyped by PCR,RT-PCR and Western blot to identify the genetic basis of each embryo.Adenovirus associated Cre recombinase and GFP immunofluorescence protein were constructed and delivered to the P3 MEFs to knockout the Cα gene,GFP was used as control.After confirming the knockout efficiency by PCR,RT-PCR and Western blot,FACs was carried out to determine the cell cycle.Cell scratch test was carried in MEFs treated with the two kinds of viruses to investigate the effects on migration.Adenovirus associated Cre recombinase could knockout the gene efficientlyinvitro.The knockout MEFs at G2 stage was 30.8%±2.57%,while the control MEFs was 23.9%±2.46%,and had more cell debris.Loss of Cα decreased the cell migration ability significantly from 12h after the scratch.Cre recombinase delivered by adenovirus could efficiently pop out double floxed geneinvitro.Disruption of Cα subunit slightly arrested the MEFs at G2 stage,and decreased the migration ability.

Key words:protein phosphatase 2A; mouse embryonic fibroblast; cell migration; cell cycle

收稿日期：2015-10-29

基金項目：江蘇省高校自然科學(xué)研究項目(11KJB180010)；江蘇省高校自然科學(xué)研究項目(14KJB180018)；江蘇省高校自然科學(xué)研究項目(15KJB180015)

作者簡介：王慶華(1978-)，男，江蘇泰州人，碩士研究生，主要從事實驗動物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)研究。*通訊作者

中圖分類號:S852.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:1007-5038(2016)06-0049-06