呂立君　王光華　李文兵　盧露露　劉念汝　陳彪　劉貝

(武漢科技大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院　武漢 430081)

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降解長鏈烷烴菌株的選育及性能研究

呂立君王光華李文兵盧露露劉念汝陳彪劉貝

(武漢科技大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院武漢 430081)

摘要以正十六烷無機(jī)鹽培養(yǎng)基為選擇培養(yǎng)基，從武漢石化輸油管附近土壤中篩選出1株高效降解長鏈烷烴的菌株，命名C3，對(duì)其進(jìn)行生理生化、16S rDNA鑒定，C3為不動(dòng)桿菌屬。在正十六烷濃度為1 000 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中接入4%的種子液，放入35 ℃、125 r/min搖床中震蕩60 h，C3對(duì)正十六烷的降解率可達(dá)100%，其降解動(dòng)力學(xué)擬合結(jié)果符合Monod模型。將C3應(yīng)用到柴蠟的降解，96 h后，1 000 mg/L的柴蠟混合溶液的降解率能達(dá)到91%。C3產(chǎn)生的生物表面活性劑經(jīng)鑒定為磷脂類活性劑，排油圈直徑為80 mm，CMC約為35 mg/L，能將水的表面張力降低到20.79 mN/m。該菌株對(duì)長鏈烷烴的降解提供了良好的菌源。

關(guān)鍵詞長鏈烷烴生理生化鑒定16S rDNA降解動(dòng)力學(xué)生物表面活性劑

0引言

長鏈烷烴是嚴(yán)重破壞生態(tài)環(huán)境的有機(jī)污染物之一，由于其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、疏水性強(qiáng)、常溫常壓下為固體等特點(diǎn)，很難自然降解，會(huì)對(duì)環(huán)境造成長期的危害。經(jīng)污水廠處理后的石化類廢水仍含有大量的長鏈烷烴，被其他廠引作循環(huán)水而帶入新一輪的生產(chǎn)中。劉雪琴[1]采用生物活性炭技術(shù)，對(duì)武鋼焦化二沉池廢水進(jìn)行降解后，仍有部分長鏈烷烴未能被徹底降解。對(duì)武鋼焦化廠蒸氨塔原水及循環(huán)水分別采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)進(jìn)行定性分析，發(fā)現(xiàn)長鏈烷烴均來自循環(huán)水。

因此需針對(duì)未降解的長鏈烷烴繼續(xù)篩菌，從而完善復(fù)合菌系，以達(dá)到更好的處理效果。由于長鏈烷烴的疏水性，需要篩選出一株能產(chǎn)生表面活性劑的菌株，來降低長鏈烷烴與水的表面張力。生物表面活性劑除了具有良好的降低表面張力、乳化、發(fā)泡的特性外，還具有易生物降解、無污染的優(yōu)點(diǎn)，在化妝品、食品以及微生物采用中有廣泛的應(yīng)用潛力。

1材料與方法

菌種來源：采自武漢石化輸油管附近的土壤。

培養(yǎng)基：無機(jī)鹽培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基。

正十六烷含量測定：采用氣相色譜儀Agilent 6890，色譜柱為HP-5毛細(xì)管柱；FID檢測器；載氣為高純氮?dú)?。檢測程序：檢測器溫度300 ℃；進(jìn)樣口溫度300 ℃；分流比20∶1；載氣流速1.5 mL/min；進(jìn)樣量1 μL。程序升溫：

降解菌的富集和分離：

(1)降解菌的富集。將采集的樣品，加入到裝有100 mL無菌蒸餾水的錐形瓶中進(jìn)行攪拌，靜置后，取上清液5 mL加入到以正十六烷為唯一碳源，且正十六烷濃度為1 000 mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，在125 r/min，35 ℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h，以獲得大量菌群混合物。

(2)降解菌的分離。在相同條件下培養(yǎng)，馴化菌株，取5 mL菌懸液加入到無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，將正十六烷的濃度依次增加至2 000、3 000、4 000、5 000 mg/L，以增強(qiáng)菌株對(duì)正十六烷的降解能力。將馴化后的降解菌懸液稀釋涂布到LB固體培養(yǎng)基上，于35 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，挑取單菌落劃線分離，經(jīng)多次純化分離得到單一菌株，對(duì)其進(jìn)行正十六烷降解試驗(yàn)，篩選出降解效果最佳的菌株。

菌株生理生化鑒定[2]。

16S rDNA分子遺傳學(xué)鑒定[2]。

C3降解動(dòng)力學(xué)研究。對(duì)于模型中的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的求解一般多采用Monod方程的線性簡化公式[3-4]。

生物表面活性劑的研究：

(1)表面活性劑的提取與純化[5]。

(2)表面張力的測定。采用JK99全自動(dòng)張力儀測定吊環(huán)法測定表面張力。

(3)生物表面活性劑排油活性測定[6-7]。

(4)生物表面活性劑乳化性測定[6-7]。

(5)生物表面活性劑臨界膠束濃度的測定[6-7]。

(6)生物表面活性劑紅外分析[8]。

(7)采用薄層層析(TLC)法對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行薄層分離，然后根據(jù)不同顯色劑的顯色結(jié)果判斷生物表面活性劑的種類，鑒定其屬于糖脂、磷脂或者脂肽[8]。

2結(jié)果與分析

2.1長鏈烷烴降解菌的選育

將樣品經(jīng)過富集、分離和純化，得到1株長鏈烷烴高效降解菌，命名為C3。

2.2C3菌株的生理生化特性

對(duì)C3進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果如表1所示，依據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)，初步鑒定C3為不動(dòng)桿菌屬。

表1　優(yōu)勢菌生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：“+”表示試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)；“-”表示試驗(yàn)呈陰性反應(yīng)。

2.316S rDNA分子遺傳學(xué)鑒定

2.3.1PCR片段的序列分析

通過提取菌株C3的基因組DNA，將篩選出的PCR產(chǎn)物，送武漢擎科有限公司測序，測序后獲得總長為1 411 bp的16S rDNA基因片段，該序列在GenBank中的登陸號(hào)為KR072554。

2.3.2序列同源性的分析

將測得到的菌株C3的16S rDNA序列輸入NCBI網(wǎng)站，進(jìn)行16S rDNA序列的同源性比對(duì)，該菌株C3的16S rDNA序列和Acinetobacter sp 16S rDNA序列相近，其同源性均大于97%。因此初步鑒定菌株C3為Acinetobacter sp(不動(dòng)桿菌)。

將菌株C3的16S rDNA序列與GenBank中相關(guān)序列進(jìn)行BLAST相似性分析后，以同源性高的11株菌株用Mega軟件以相近序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1所示，C3在發(fā)育地位上鑒定為Acinetobacter sp，C3的亞種有待進(jìn)一步分析。

圖1　菌株C3的16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4降解特性研究

在正十六烷濃度為1 000 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中接入4%的種子液，放入35 ℃、125 r/min搖床中震蕩60 h，C3降解正十六烷的生長曲線和降解曲線，如圖2所示。菌株C3的生長趨勢與對(duì)正十六烷的降解過程基本同步，表明該菌能利用正十六烷作為唯一碳源促進(jìn)自身生長，并對(duì)正十六烷有良好的降解效果，培養(yǎng)60 h能將其降解完全。0～9 h，培養(yǎng)液中OD600較低，主要是因?yàn)檎榫哂休^強(qiáng)的疏水性，C3與正十六烷接觸面小，因缺少碳源而生長較慢；9～42 h后，菌體光密度逐步增長，此階段C3分泌了一種生物表面活性劑，降低了發(fā)酵液的表面張力，如圖3所示，該表面活性劑對(duì)正十六烷具有增溶作用，能將發(fā)酵液的表面張力降低到20 mN/m左右，加大了C3與正十六烷的接觸面；培養(yǎng)42 h后，菌株C3進(jìn)入穩(wěn)定期，生長速度與衰亡速度基本保持同步；培養(yǎng)51 h后，隨著正十六烷的降解完全，C3因缺少碳源而進(jìn)入衰亡期。

圖2菌株C3對(duì)正十六烷的降解及生長曲線

圖3發(fā)酵液表面張力的變化

為了了解菌株C3的降解規(guī)律，采用Monod方程為C3對(duì)正十六烷的降解模型。Monod方程表明底物濃度和降解速率之間的定量關(guān)系見下式：

(1)

式中，v、vmax分別為底物的生物降解速率和最大底物的生物降解速率，mg/(L·h)；Km是方程的半飽和常數(shù)，mg/L；S是底物濃度，mg/L。

對(duì)圖2中正十六烷降解曲線中，對(duì)數(shù)期各點(diǎn)進(jìn)行計(jì)算，得到各點(diǎn)的斜率即正十六烷降解速率v，正十六烷濃度倒數(shù)1/S以及速率倒數(shù)1/v，結(jié)果如表2所示。

表2　C3降解正十六烷S-v數(shù)據(jù)

圖41/v～1/S關(guān)系

將C3運(yùn)用到柴蠟混合物的降解中，在柴蠟混合物濃度為1 000mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，置于125r/min，35 ℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)96h。通過紫外分光光度法[9]，測定發(fā)酵液在225nm處的吸光值，得到柴蠟混合物的降解情況如圖5所示。經(jīng)過96h的培養(yǎng)，柴蠟混合物的降解率能達(dá)到91%，比馬秋莎等[10]報(bào)道柴蠟混合物的降解率高4%。表明C3對(duì)廢水中的長鏈烷烴的降解有著很高的應(yīng)用價(jià)值，達(dá)到了篩菌目的。

2.5生物表面活性劑的研究

2.5.1表面活性劑的特性研究

提取發(fā)酵液中的生物表面活性劑，獲得的產(chǎn)物為淡黃色粉狀物質(zhì)，產(chǎn)量為2.53g/L。排油圈大小為80mm。取一刻度試管，加4mL油和4mL發(fā)酵液，混合均勻后，在避光低溫下靜置，在不同時(shí)間測量乳化液和油相體積。每隔12h檢測乳化體積的變化，連續(xù)監(jiān)測72h，結(jié)果如圖6所示，72h后乳化體積仍能達(dá)到60%以上。說明菌株C3產(chǎn)生的表面活性劑乳化性能穩(wěn)定，具有很好的增溶效果。

圖5柴蠟混合物的降解曲線

圖6乳化性能的測定

圖7臨界膠束濃度的測定

將提取的表面活性劑分別稀釋至5、10、15、20、25、30、35、40、45mg/L后，測定不同質(zhì)量濃度的表面活性劑溶液的表面張力。測量結(jié)果如圖7所示，當(dāng)溶液濃度低于35mg/L時(shí)，隨著濃度增加，水的表面張力相應(yīng)降低，當(dāng)樣品濃度高于35mg/L時(shí)，增加樣品濃度不能使水的表面張力進(jìn)一步降低，表明C3菌株產(chǎn)物的臨界膠束濃度約為35mg/L，能把水的表面張力降低到20.79mN/m。鄭新偉[11]在論文中報(bào)道過多種表面活性劑降低水的表面張力的能力，C3產(chǎn)生的表面活性劑降低水的表面張力的能力能占到上游水平。

2.5.2表面活性劑的鑒定

生物表面活性劑紅外光譜掃描結(jié)果如圖8所示，3 436cm-1處為-OH吸收，1 649cm-1處為NH+吸收；1 543cm-1和1 389cm-1為C=O的吸收；1 079cm-1處可能是PO-R的吸收；950cm-1為P=0的吸收；668cm-1處為P=S的吸收，511cm-1為P-S的吸收。該表面活性劑初步鑒定為磷脂類，與RobertM等[12]研究一致。

取1mL發(fā)酵液離心，上清液用氯仿/甲醇：2/1(V/V)抽提后，進(jìn)行薄層層析。展開劑為氯仿/甲醇/水：65/15/2(V/V/V)。選取高氯酸為顯色劑，溶液顯藍(lán)色。與紅外光譜掃描鑒定結(jié)果一致，可以判定C3產(chǎn)生的表面活性劑為磷脂類表面活性劑。

圖8　菌株C3產(chǎn)生的生物表面活性劑的紅外吸收光譜

3結(jié)論

(1)C3菌株經(jīng)生理生化及16SrDAN鑒定為不動(dòng)桿菌。

(3)將C3運(yùn)用到1 000mg/L柴蠟混合物的降解中，經(jīng)過96h的培養(yǎng)，柴蠟混合物的降解率能達(dá)到91%。說明了C3對(duì)長鏈烷烴有著良好的降解作用。

(4)C3菌株產(chǎn)生的生物表面活性劑經(jīng)紅外分析及顯色反應(yīng)，鑒定為磷脂類表面活性劑。排油圈大小為80mm，臨界膠束濃度約為35mg/L，能將水的表面張力降低到20.79mN/m。

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作者簡介呂立君，女，碩士，研究方向?yàn)閺U水再生處理。

(收稿日期：2015-06-20)

Study on the Selection and Degradation Characteristics of Long-chain Alkanes Degrading Bacteria

LYU LijunWANG GuanghuaLI WenbingLU LuluLIU NianruCHEN BiaoLIU Bei

(CollegeofChemicalEngineeringandTechnology,WuhanUniversityofScienceandTechnologyWuhan430081)

AbstractWith the mineral salt medium with the n-hexadecane as the selecting medium, a strain that can effectively degrade the long-chain alkane is screened out from the soil near the pipeline of Wuhan Petrochemical Works，named as C3, conducted for physiological and biochemical identification and 16S rDNA comparison and the strain C3 is identified as Acinetobacter sp．The n-hexadecane degradation is 100%after 4%seed liquid of the strain is inoculated on the mineral salt medium with 1 000 mg/L of n-hexadecane and cultured at 35 ℃、125 r/min for 60 h, in accordance with Monod equation. The degradation of diesel and paraffin mixture can reach 91% after 96 h. The biosurfactants produced by strain C3, is identified as phospholipids, whose oil spreading size is 80 mm，the CMC of purified product is 35 mg/L, and the lowest surface tension is 20.79 mN/m. The study has provided the good resources of the microbial strain for degrading long-chain alkane.

Key Wordslong-chain alkanephysiological and biochemical identification16S rDNAdegradation kineticsbiosurfactants