羅先群，黃雪星

(廣西科學(xué)院生物研究所，廣西南寧　530007)

杏鮑菇菌株的rDNA ITS序列鑒定和同工酶分析*

羅先群，黃雪星

(廣西科學(xué)院生物研究所，廣西南寧530007)

摘要：【目的】鑒于誘變處理后杏鮑菇菌株在栽培性狀上的明顯差異，對(duì)兩株杏鮑菇菌株(杏A和杏B)進(jìn)行分子水平上的鑒定，分析兩者的差異性。【方法】對(duì)杏鮑菇菌絲體樣本的rDNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間ITS片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序驗(yàn)證；同時(shí)應(yīng)用同工酶電泳對(duì)菌絲體的酯酶、過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶進(jìn)行分析?！窘Y(jié)果】通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和序列比對(duì)分析，兩株菌株ITS序列相似度達(dá)到99%；菌絲體的酯酶、過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶同工酶電泳檢測(cè)無(wú)差異。【結(jié)論】杏A和杏B菌株為同一菌株，在分子水平上差異不明顯。

關(guān)鍵詞：杏鮑菇同工酶rDNA ITS序列分析

0引言

【研究意義】本研究前期對(duì)杏鮑菇菌株進(jìn)行誘變處理，處理后的杏鮑菇菌株子實(shí)體在形態(tài)、產(chǎn)量上與未處理的菌株存在明顯差異。而傳統(tǒng)的菌種鑒定主要通過(guò)對(duì)菌絲、菌落和子實(shí)體形態(tài)的宏觀觀察以及不同菌株間發(fā)生的拮抗反應(yīng)等來(lái)進(jìn)行，具有一定的局限性和主觀性[1]。鑒于此，本研究對(duì)兩株杏鮑菇菌株進(jìn)行分子水平上的鑒定，分析兩者的差異性。【前人研究進(jìn)展】近年來(lái)，同工酶分子標(biāo)記技術(shù)已被應(yīng)用于真菌的分類鑒定、遺傳育種和種群分化研究中，成為菌株分類、種質(zhì)鑒定的重要手段[2]。另外，目前國(guó)內(nèi)外開(kāi)展 RAPD、rDNA 等多種分子標(biāo)記技術(shù)研究香菇、黑木耳、雙孢蘑菇、草菇等的種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和菌種鑒別[3-8]，并取得顯著成效。其中，真核生物rDNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間ITS片段因其序列保守性和科、屬、種水平上的特異性，被廣泛應(yīng)用于真菌系統(tǒng)發(fā)育學(xué)與分類鑒定等方面的研究中[9-12]，張丹等[13]對(duì)中國(guó)7個(gè)毛木耳菌株rDNA ITS進(jìn)行克隆測(cè)序，并將其與木耳屬其他種的相應(yīng)序列進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)ITS 序列分析適用于屬內(nèi)種間的分類鑒定?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究從真核生物rDNA ITS片段以及同工酶的兩方面入手，對(duì)兩株杏鮑菇菌株進(jìn)行分子技術(shù)方面的鑒定。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和序列比對(duì)分析兩株菌株ITS序列相似度，同時(shí)對(duì)菌絲體進(jìn)行同工酶電泳檢測(cè)。

1材料與方法

1.1供試菌株

兩株杏鮑菇菌株系本所保藏，編號(hào)杏A、杏B(圖1)。

(a)對(duì)照菌株Control Pleurotus eryngii(杏A，Pleurotus eryngii A)；(b)處理菌株Ultraviolet mutational breeding Pleurotus eryngii (杏B，Pleurotus eryngii B)

圖1杏鮑菇

Fig.1Pleurotus eryngii

1.2方法

1.2.1ITS 序列鑒定

1.2.1.1總DNA提取

稱取適量菌絲體樣品，放入預(yù)冷研缽中，加入適量液氮研磨。將研磨粉末轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，采用CTAB法提取總DNA。

1.2.1.2樣品rDNA ITS序列的PCR 擴(kuò)增

所用引物如下：

ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG-G-3′

ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′

反應(yīng)體系(50 μL)：5 μL 10×Ex Taq Buffer，1 μL引物ITS5(10 μmol·L-1)，1 μL ITS4(10 μmol·L-1)，4 μL dNTPs(2.5 mmol·L-1)，0.5 μL Ex Taq DNA聚合酶(5 U·μL-1，Takara)，1 μL模板DNA(約50 ng)，37.5 μL ddH2O。

反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最后，72℃延伸10 min。

1.2.1.3DNA純化測(cè)序和分析

采用E.Z.N.A?.Cycle-Pure Kit(D6492，Omega Bio-Tek公司)純化PCR 產(chǎn)物，純化步驟參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)，純化后的PCR 產(chǎn)物送華大基因公司測(cè)序。

測(cè)得的ITS序列用Vector NTI 軟件排序和Align分析，并通過(guò)BLAST進(jìn)行同源序列比對(duì)。

1.2.2同工酶電泳

1.2.2.1同工酶提取

用無(wú)菌刮刀刮取0.5 g菌絲體，放置于預(yù)冷研缽中，加入適量液氮將菌絲體研磨至粉末狀，并轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中；加入0.5 mL Tris-HCl提取液，混勻，并于4℃，8 000 r/min條件下離心10 min，取上清液置于另一無(wú)菌離心管中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

采用SDS-PAGE進(jìn)行同工酶分析。SDS-PAGE(15%分離膠，W/V；4%濃縮膠，W/V；Tris-Gly緩沖液系統(tǒng))電泳條件：上樣量40 μL，濃縮膠區(qū)段電壓為120 V，分離膠區(qū)段電壓為180 V，4℃環(huán)境條件下電泳約4 h。

1.2.2.3染色

(1)酯酶

染色液配制：稱取100 mg重氮固藍(lán)，溶于5 mL丙酮中，再加入預(yù)先配制的1%(V/V)乙酸-α萘酯丙酮溶液1.5 mL和2%(V/V)乙酸-β萘酯丙酮溶液1.5 mL，最后用0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH值為6.4)定容100 mL。使用前加入40%(V/V)甲醛0.5 mL，以降低凝膠的非特異性背景染色。

染色方法：預(yù)先用蒸餾水漂洗凝膠，然后放入染色液中，于37℃搖床保溫震蕩，待凝膠上顯現(xiàn)酶帶后停止染色，用7%(V/V)醋酸溶液漂洗凝膠2～3次，最后將凝膠保存于7%(V/V)醋酸溶液中。

(2)超氧化物歧化酶

染色液：A液，25 μmol/L NBT溶液；B液，用50 mmol/L，pH值為7.8的磷酸緩沖液(含1 mmol/L EDTA)配制成的0.01%(W/V)核黃素溶液。

染色方法：將凝膠置于A液中，室溫下暗反應(yīng)20 min；然后取出凝膠放入B液中于日光下曝光約20 min，直到凝膠顯現(xiàn)出暗背景下的灰白色酶帶，停止染色。

(3)過(guò)氧化物酶

染色液：C液，2%(W/V)聯(lián)苯胺醋酸溶液；D液，4%(W/V)氯化銨溶液；E液，5%(W/V)EDTA-Na2溶液(pH值 6.0)；F液，0.3%(V/V)H2O2溶液。其中，C液現(xiàn)用現(xiàn)配，D、E、F溶液在4℃條件下貯存?zhèn)溆?。使用時(shí)按照C∶D∶E∶F∶水=1∶1∶1∶1∶8(V∶V∶V ∶V∶V)的比例配制成染色液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

染色方法：預(yù)先用蒸餾水漂洗凝膠，然后放入染色液中，搖床震蕩5 min，待凝膠上顯現(xiàn)酶帶后停止染色，用蒸餾水漂洗，保存于7%(V/V)醋酸溶液中。

2結(jié)果與分析

2.1ITS序列鑒定

杏A和杏B菌株的ITS序列經(jīng)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物約600 bp(圖2)。從測(cè)序結(jié)果可知，擴(kuò)增的杏A ITS片段長(zhǎng)675 bp，杏B為672 bp。用Vector NTI 軟件對(duì)ITS序列進(jìn)行排序和Align分析，結(jié)果表明杏A和杏B菌株ITS序列相似度達(dá)到100%。

另外，ITS序列測(cè)定結(jié)果經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST后，與數(shù)據(jù)庫(kù)中HM561985、JX429941和DQ333235等杏鮑菇已有序列相似度達(dá)到99%。

M：DL2000；1：杏A；2:杏B

M：DL2000；1：Pleurotus eryngii A；2：Pleurotus eryngii B

圖2PCR產(chǎn)物電泳

Fig.2The PCR products electrophoregram

2.2同工酶電泳

從圖3中可以看出，酯酶同工酶電泳結(jié)果顯示兩株菌的酯酶譜帶較為豐富，培養(yǎng)15 d的菌株與培養(yǎng)13 d的菌株酯酶各譜帶的表達(dá)峰度不同。另外，杏A和杏B菌株酯酶的提取用Tris-HCl緩沖液比用PBS緩沖液效果要好。

①，③，⑤，⑦:培養(yǎng)15 d、15 d 、13 d、13 d的杏A；②，④，⑥，⑧：培養(yǎng)15 d、15 d、13 d、13 d的杏B，其中①,②,⑦,⑧是用Tris-HCl緩沖液提取的樣品，③,④,⑤,⑥是用PBS緩沖液提取的樣品

①，③，⑤，⑦:Pleurotus eryngii A(15 d，15 d，13 d，13 d，respectively)；②，④，⑥，⑧：Pleurotus eryngii B(15 d，15 d，13 d，13 d，respectively)；Sample ①,②,⑦ and ⑧ were extracted by Tris-HCl buffer；Sample ③,④,⑤ and ⑥ were extracted by PBS buffer

圖3酯酶同工酶電泳

Fig.3Esterase isozyme electrophoresis

如圖4所示，培養(yǎng)15 d、13 d、11 d、9 d的杏A和杏B菌株的過(guò)氧化物酶酶帶非常接近，不管是培養(yǎng)時(shí)間還是菌株之間，差別都不大。

①，②，③，④：培養(yǎng)15 d、13 d、11 d、9 d的杏A；⑤，⑥，⑦，⑧：培養(yǎng)15 d、13 d、11 d、9 d的杏B

①，②，③，④:Pleurotus eryngii A(15 d，13 d，11 d，9 d，respectively)；⑤，⑥，⑦，⑧：Pleurotus eryngii B(15 d，13 d，11 d，9 d，respectively)

圖4過(guò)氧化物酶同工酶電泳

Fig.4Peroxidase isozyme electrophoresis

另外，培養(yǎng)15 d、13 d、11 d的超氧化物歧化酶同工酶電泳色帶以培養(yǎng)15 d的最為豐富，杏A和杏B兩菌株間無(wú)差異(圖5)。

圖3～5結(jié)果顯示,杏A和杏B菌株所表達(dá)的同工酶無(wú)差異條帶；兩株菌的3種同工酶的表達(dá)中以酯酶的譜帶最為豐富，而且培養(yǎng)15 d的菌株與培養(yǎng)13 d的菌株酯酶各譜帶的表達(dá)峰度不同。

①，②，③：培養(yǎng)15 d、13 d、11 d的杏A；④，⑤，⑥：培養(yǎng)15 d、13 d、11 d的杏B

①，②，③:Pleurotus eryngii A(15 d，13 d，11 d，respectively)；④，⑤，⑥：Pleurotus eryngii B(15 d，13 d，11 d，respectively)

圖5超氧化物歧化酶同工酶電泳

Fig.5Superoxide dismutase isozyme electrophoresis

3討論

同工酶分子標(biāo)記對(duì)于研究菌株遺傳多樣性、菌種親緣關(guān)系以及菌種鑒定均有一定作用[14]。酶是基因編碼的產(chǎn)物，具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性和特異性；但是，同一生物在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期以及不同生長(zhǎng)條件下其酶譜的多態(tài)性均不同，這些條件影響同工酶基因的開(kāi)放、關(guān)閉及表達(dá)量的改變。因此，同工酶在食用菌菌種選育的應(yīng)用上應(yīng)保證培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基以及所有操作條件一致的情況下，才可能得到穩(wěn)定準(zhǔn)確的分析結(jié)果[15-16]。另外，一些酶的異質(zhì)性未經(jīng)過(guò)專門(mén)的精細(xì)分辨，進(jìn)而影響對(duì)生理性酶的多態(tài)性的區(qū)分[17]。

遺傳多樣性是生物多樣性的基礎(chǔ)，遺傳多樣性水平代表一個(gè)物種在特定環(huán)境中基因的豐富程度，是物種適應(yīng)和進(jìn)化的遺傳基礎(chǔ)。多樣性的分析對(duì)了解物種的適應(yīng)性、物種起源和基因資源的分布及育種親本的選擇等具有重要意義[18]。對(duì)秀珍菇菌株進(jìn)行rDNA ITS 序列分析[19]，表明rDNA ITS序列分析在食用菌菌株分析與鑒定上的應(yīng)用日益廣泛。

4結(jié)論

對(duì)杏A和杏B菌株進(jìn)行rDNA ITS 序列分析和同工酶電泳分析，2株菌株ITS序列相似度達(dá)到99%，而且酯酶、過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶等同工酶電泳檢測(cè)無(wú)差異，據(jù)此認(rèn)為杏A和杏B菌株為同一菌株，在分子水平上差異不明顯。

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(責(zé)任編輯：米慧芝)

收稿日期：2016-03-10

作者簡(jiǎn)介：羅先群(1965-)，男，高級(jí)工程師，主要從事生物工程與技術(shù)的研究與開(kāi)發(fā)。

中圖分類號(hào)：Q55,Q78

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-7378(2016)02-0156-05

Analysis on Isozyme and rDNA ITS Sequence of Pleurotus eryngii Strains

LUO Xianqun，HUANG Xuexing

(Biology Institute,Guangxi Academy of Sciences,Nanning,Guangxi,530007,China)

Abstract:【Objective】In view of the fact that the mutation of Pleurotus eryngii strains is different in the cultivated character. Two strains of Pleurotus eryngii strains (A and B) are identified at molecular level and analyze their difference.【Methods】The rDNA fragment of Pleurotus eryngii mycelium samples was amplified by PCR and sequencing. Mycelium of esterase, peroxidase and superoxide dismutase enzyme are analyzed by isozyme electrophoresis. 【Results】Through the analysis of GenBank database search and sequence alignment,the similarity of ITS sequences of the two strains was reached to 99%；There was no difference between esterase,peroxidase and superoxide dismutase isozymes in the mycelium.【Conclusion】A and B strain is the same strain,at the molecular level with insignificant difference.

Key words:Pleurotus eryngii，isoenzyme，rDNA ITS，sequence analysis

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間:2016-05-12

網(wǎng)絡(luò)優(yōu)先數(shù)字出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1075.N.20160512.1517.020.html

*廣西科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(15YJ22SW20)資助。