甘敏鑫，吳健程，劉興胥，呂　軍,2**

(1.南寧市新科健生物技術(shù)有限責任公司，廣西南寧　530003;2.廣西科學院生物研究所，廣西南寧　530007)

具有快速凝乳性能的水牛奶奶酪菌種篩選*

甘敏鑫1，吳健程1，劉興胥1，呂軍1,2**

(1.南寧市新科健生物技術(shù)有限責任公司，廣西南寧530003;2.廣西科學院生物研究所，廣西南寧530007)

摘要：【目的】提高水牛奶產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益，為廣西水牛奶奶酪工業(yè)化生產(chǎn)提供參考?！痉椒ā坎捎闷桨搴Y選法從鮮水牛奶和黃牛奶中分離出能夠生產(chǎn)水牛奶奶酪的菌種，對篩選到的菌株進行初步的發(fā)酵性能試驗，并測定其傳代穩(wěn)定性、乳酸和雙乙酰含量?！窘Y(jié)果】篩選到1株能在4.5 h內(nèi)使水牛奶凝固的菌株；該菌株在最佳發(fā)酵溫度37℃下，經(jīng)過厭氧發(fā)酵4.5 h即可使水牛奶完全凝固，所獲得凝乳的黏度為109.2 Pa·S，酸度為47.3°T，雙乙酰含量為2.826×10-3g/L，乳酸含量為11.59%?！窘Y(jié)論】該菌株產(chǎn)酸能力強、產(chǎn)香性能高、黏度和酸度大、有合適的蛋白質(zhì)水解特性。

關(guān)鍵詞：水牛奶凝乳雙乙酰奶酪

0引言

【研究意義】水牛奶占全球牛奶總產(chǎn)量的12%，其營養(yǎng)價值高，能提供比普通牛奶更多的單位體積能量，且組分中含有大量的維生素A和D，如應用于日常飲食中，將是解決微量元素及優(yōu)質(zhì)動物性蛋白質(zhì)攝入量的一條良好途徑。由于具有極高的總固體含量、脂肪、蛋白質(zhì)、鈣膠體及較大尺寸的酪蛋白膠束和脂肪等特點[1-2]，水牛奶是最適合用于發(fā)酵乳制品的牛奶。此外，水牛奶不需要濃縮或者制成奶粉便可做為優(yōu)質(zhì)的乳制品。水牛奶所具有的優(yōu)良理化特點和高營養(yǎng)價值使得水牛奶乳制品具有廣闊的開發(fā)前景?！厩叭搜芯窟M展】乳制品在發(fā)酵過程中，由于各種微生物共存，導致產(chǎn)品容易變質(zhì)，而乳酸菌產(chǎn)生的乳酸則具有良好的抗微生物作用[3]。在乳制品中，雙乙酰對于發(fā)酵乳制品的風味與香味尤為重要[4-5]，它已被美國食品藥品管理局批準為一種調(diào)味品，并用于生產(chǎn)各種口味的食品[6]。劉文俊[7]測定單菌酸奶發(fā)酵期間的發(fā)酵時間、滴定酸度、pH值、乳酸含量、雙乙酰含量等指標，研究菌種發(fā)酵、產(chǎn)酸特性和風味物質(zhì)產(chǎn)量形成的菌株特異性，同時進行產(chǎn)酸、風味物質(zhì)產(chǎn)量特性的變化規(guī)律和相關(guān)性分析,并提出乳酸菌發(fā)酵過程是個動態(tài)的完整過程。因此平均產(chǎn)酸速率是衡量菌株發(fā)酵、產(chǎn)酸特性的重要指標?！颈狙芯壳腥朦c】廣西水牛奶資源豐富，但產(chǎn)品的品種單一，目前只有鮮牛奶和酸奶上市，市面上尚無水牛奶奶酪產(chǎn)品?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從鮮水牛奶和黃牛奶中篩選能夠在短時間內(nèi)促進水牛奶奶酪凝結(jié)的菌株，對篩選到的菌株進行初步的發(fā)酵性能試驗，并測定其傳代穩(wěn)定性、乳酸和雙乙酰含量。

1材料與方法

1.1材料

樣品：市面售買的水牛奶和黃牛奶。

斜面培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基、E培養(yǎng)基和SL培養(yǎng)基，配方參照文獻[8-10]，平板培養(yǎng)基在斜面培養(yǎng)基中分別加入0.2%(W/V)碳酸鈣。

1.2方法

1.2.1菌種的分離與純化

將水牛奶和黃牛奶稀釋一定倍數(shù)后，吸取0.1 mL分別涂布于MRS，M17，E，SL平板培養(yǎng)基上，靜置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，挑選各平板上產(chǎn)酸透明圈明顯的菌落劃線接入新的平板中進行純化，對篩選到的菌株進行革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察其形態(tài)，并分別接入對應的MRS，M17，E，SL斜面培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2種子液的制備及菌種凝乳性能初測

純菌種分別經(jīng)對應的MRS，M17，E，SL斜面培養(yǎng)24 h后，挑取一環(huán)菌體加入裝有5 mL水牛奶的試管中，37℃過夜靜置培養(yǎng)活化，再以3%(V/V)的接種量將試管中已經(jīng)凝固的水牛奶轉(zhuǎn)接入5 mL的新鮮水牛奶試管中，37℃靜置培養(yǎng)，每小時觀察一次水牛奶的凝乳效果，并記錄凝固時間，凝固后對其進行感官評定。

1.2.3溫度對凝乳的影響

參照1.2.2節(jié)制備發(fā)酵種子液，分別在31℃、34℃、37℃、40℃、43℃下進行靜置發(fā)酵6 h后測定凝乳黏度和酸度。其中，黏度采用NDJ-8S數(shù)顯粘度計測定；酸度測定：準確吸取10 mL凝乳，用25 mL蒸餾水稀釋，加入0.5 mL 5 g/L的酚酞指示劑，混勻后用0.1 mol/L的NaOH標準溶液滴定，直至微紅色在1 min之內(nèi)不消失為止。把滴定時消耗的NaOH體積(mL)乘以10，即得凝乳酸度。

1.2.4菌種的穩(wěn)定性

參照1.2.2節(jié)制備發(fā)酵種子液，在37℃下發(fā)酵4.5 h，觀察凝乳狀態(tài)并測定其黏度和酸度，進行5次傳代。

1.2.5雙乙酰含量的測定[11]

鄰苯二胺和雙乙酰反應生成2，3-二甲基喹喔啉，利用反應生成物的鹽酸鹽在紫外分光光度計335 nm波長下有最大吸收值，可對雙乙酰進行定量測定。

取純化后的菌種經(jīng)斜面培養(yǎng)24 h后，挑取一環(huán)菌體加入裝有5 mL水牛奶的試管中，于37℃靜置培養(yǎng)18 h進行活化。再以2%(V/V)的接種量接于100 mL水牛奶中，于37℃靜置發(fā)酵4.5 h后，將凝乳置于蒸餾瓶中，加入50 mL蒸餾水蒸餾。當蒸餾液為50 mL時，停止蒸餾，在蒸餾液中加入50 mL蒸餾水。吸取10 mL于具塞比色管中，向管內(nèi)加入0.5 mL 1%(V/V)鄰苯二胺溶液，搖勻后于暗處放置20 min,然后加入2 mL 4 mol/L鹽酸溶液，搖勻，在335 nm下以蒸餾水為空白對照，用紫外分光光度計測定其吸光值。

1.2.6乳酸的測定

取凝乳1 g(精密稱定)，加入50 mL蒸餾水和25 mL 1 mol/L的NaOH溶液，煮沸5 min，加入酚酞指示劑2滴，趁熱用0.5 mol/L硫酸標準溶液滴定，以蒸餾水為空白對照。乳酸的實際含量W(mg)計算公式如下：

W=90.08×(V0-V)×C×2，

式中，V表示滴定樣品所消耗的硫酸體積(mL)，V0為空白試樣滴定所消耗的硫酸體積(mL)，C為硫酸濃度(mol/L)。

乳酸溶液的重量百分濃度為

乳酸(%)=(W/W1)×100%，

式中，W為乳酸的實際含量(mg)，W1為稱取樣品的重量。

2結(jié)果與分析

2.1菌落形態(tài)

從水牛奶和黃牛奶中分離得到27株菌株，這些菌落在4種培養(yǎng)基上生長的形態(tài)主要有圓形白色表面光滑、蘑菇狀白色表面光滑、圓形透明表面光滑和片狀淡黃表面褶皺等。前3種有產(chǎn)酸與不產(chǎn)酸兩種，后者不產(chǎn)酸。其中SL、MRS培養(yǎng)基上的菌落產(chǎn)酸透明圈較大(圖1)，M17培養(yǎng)基上的產(chǎn)酸菌落極少，E培養(yǎng)基上的產(chǎn)酸菌落雖較多，但經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)6 h后，可以使牛奶凝結(jié)的卻極少。

圖1產(chǎn)透明圈的菌落(MRS培養(yǎng)基)

Fig.1Colony which produced transparent circle(MRS culture medium)

在顯微鏡下觀察分離得到的27株菌株的形態(tài)，結(jié)果如圖2所示，有8株(分別為12～15號、17～19號和22號)呈鏈球狀排列，為革蘭氏陽性；有12株(分別為1～2號、4～8號、10～11號、16號、20～21號)呈球形或近似球形，為革蘭氏陽性；有7株(分別為3號、9號、23～27號)一般呈桿狀，也有近卵圓形的，菌體大多平直，亦有稍彎曲的，菌體兩端多鈍圓，少數(shù)是平截狀或尖突狀，為革蘭氏陽性。

2.2凝乳性能

如表1所示，經(jīng)初步篩選得到的27株菌株，其促使牛奶凝固的時間為4～6 h，凝固后的pH值為3.8～5.5。經(jīng)過3次傳代發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)22號菌株的產(chǎn)酸能力強、產(chǎn)香性能高、黏度和酸度大、有適當?shù)牡鞍踪|(zhì)水解性能，因此，選取22號菌株進行初步的發(fā)酵性能研究。

圖2顯微鏡鏡檢結(jié)果

Fig.2Result of microscopic examination

2.3溫度對凝乳的影響

如圖3所示，22號菌株對發(fā)酵溫度的變化敏感，發(fā)酵溫度過高或者過低時其凝乳黏度和酸度均有所下降，當發(fā)酵溫度為37℃時，其發(fā)酵產(chǎn)物的黏度和酸度均最高，其中黏度值為109.2 Pa·S，酸度值為47.3°T。

2.4菌種的穩(wěn)定性及凝乳中雙乙酰和乳酸含量

如表2所示，22號株菌經(jīng)過5次傳代后，其理化性質(zhì)與第一代相近，表明該菌株傳代的穩(wěn)定性能好。采用22號株菌進行發(fā)酵，獲得的凝乳中雙乙酰的含量為2.827×10-3g/L，乳酸的含量為11.59%。

表1菌株凝乳性能

Table 1Milk clotting properties of bacterial strains

序號No.培養(yǎng)基Culturemedium凝固時間Coagulationtime(h)凝固后pH值pHvalueaftercoagulation凝乳氣味Smellofcoagulation凝乳狀態(tài)*Coagulationstate1SL6.03.8酸,餿Sour,spoiled組織細膩,光滑,少許清液Organizationfine,smooth,alittleliquid2SL6.05.1奶酸Sourmilk組織細膩,光滑,無清液Organizationfine,smooth,noliquid3SL4.04.2奶酸Sourmilk組織粗糙,少許清液Tissueroughness,alittleliquid4SL5.05.1奶酸Sourmilk組織粗糙,少許清液Tissueroughness,alittleliquid5SL6.04.2奶酸Sourmilk組織粗糙,少許清液Tissueroughness,alittleliquid6SL4.54.2奶酸Sourmilk組織細膩,光滑,較多清液Organizationfine,smooth,alotofliquid7SL6.04.3奶酸Sourmilk組織細膩,光滑,少許清液Organizationfine,smooth,alittleliquid8SL4.05.5奶酸Sourmilk組織細膩,光滑,少許清液Organizationfine,smooth,alittleliquid9SL5.04.2奶酸Sourmilk組織細膩,光滑,無清液Organizationfine,smooth,noliquid10SL4.54.2較酸Sour組織細膩,光滑,少許清液Organizationfine,smooth,alittleliquid11SL5.04.3奶酸Sourmilk組織細膩,光滑,少許清液Organizationfine,smooth,alittleliquid12MRS6.03.8奶酸,稍甜Sourmilk,sweet組織細膩,光滑,無清液Organizationfine,smooth,alittleliquid13MRS4.04.2奶酸Sourmilk組織粗糙,少許清液Tissueroughness,alittleliquid14MRS5.04.2酸,餿Sour,sour組織細膩,光滑,少許清液Organizationfine,smooth,alittleliquid15MRS6.04.1奶酸Sourmilk組織細膩,光滑,少許清液Organizationfine,smooth,alittleliquid16MRS4.03.9奶酸,稍甜Sourmilk,sweet組織細膩,光滑,少許清液Organizationfine,smooth,alittleliquid17MRS4.04.0奶酸Sourmilk組織細膩,光滑,無清液Organizationfine,smooth,noliquid18MRS6.04.7奶酸Sourmilk組織粗糙,少許清液Tissueroughness,alittleliquid19MRS4.53.9奶酸Sourmilk組織細膩,光滑,少許清液Organizationfine,smooth,alittleliquid20MRS5.04.2奶酸Sourmilk組織細膩,光滑,少許清液Organizationfine,smooth,alittleliquid21MRS6.04.0奶酸Sourmilk組織細膩,光滑,少許清液Organizationfine,smooth,alittleliquid22MRS4.54.1奶酸,香甜Sourmilk,sweet組織細膩,光滑,少許清液Organizationfine,smooth,alittleliquid23M175.54.2酸,餿Sour,sour組織粗糙,大量清液Tissueroughness,alotofliquid24M175.04.6奶酸Sourmilk組織細膩,光滑,少許清液Organizationfine,smooth,alittleliquid25M176.05.1酸,餿Sour,sour組織粗糙,大量清液Tissueroughness,alotofliquid26M175.04.3酸,餿Sour,sour組織細膩,光滑,少許清液Organizationfine,smooth,alittleliquid27E6.04.9奶酸,稍甜Sourmilk,sweet組織細膩,光滑,少許清液Organizationfine,smooth,alittleliquid

注：*為發(fā)酵6 h后觀察結(jié)果

Note：*indicates the result of 6 h fermentation

圖3溫度對凝乳黏度和酸度的影響

Fig.3Effect of temperature on the viscosity and acidity of milk clotting

表2第22株菌的凝乳理化性質(zhì)

Table 2The physicochemical properties of 22th strains of bacteria

傳代數(shù)GenerationNo.凝乳狀態(tài)Coagulationstate黏度Viscosity(Pa·S)酸度Acidity(°T)1+++109.247.32+++108.645.53+++110.346.24+++105.445.85+++108.646.4

注：+表示凝乳效果

Note：+indicates the effect of condensed

3結(jié)論

本實驗從鮮水牛奶和黃牛奶中成功分離出27株菌株，其形態(tài)包括鏈球狀、桿狀和球狀。其中，以22號菌株的傳代穩(wěn)定性最好，初步的發(fā)酵性能結(jié)果表明，在37℃下進行發(fā)酵，其發(fā)酵產(chǎn)物的黏度和酸度均為最佳，分別為109.2 Pa·S和47.3°T，雙乙酰含量為2.826×10-3g/L，乳酸含量為11.59%。

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(責任編輯：陸雁)

收稿日期：2015-11-02

作者簡介：甘敏鑫(1985-)，女，工程師，主要從事生物技術(shù)研究。 **通訊作者：呂軍(1981-)，男，助理工程師，主要從事發(fā)酵工程研究,E-mail：304943290@qq.com。

中圖分類號：S879.1

文獻標識碼：A

文章編號：1002-7378(2016)02-0146-05

Strains Screening for Rapid Milk Clotting of Buffalo Milk into Cheese

GAN Minxin1，WU Jiancheng1，LIU Xingxu1，LV Jun1,2

(1.Nanning Newkergen Biotechnology Sciences Co.Ltd.，Nanning，Guangxi，530003，China;2.Biology Institute，Guangxi Academy of Sciences，Nanning，Guangxi，530007，China)

Abstract：【Objective】The objective of this study is to screen strains that can produce cheese from buffalo milk and scalper milk.【Methods】Pure microbial species were isolated from the fresh buffalo milk and cattle milk,which could made buffalo milk coagulate from 4 to 6 h.Then their genetics stability,lactic acid content and diacetyl content were tested.【Results】With preliminary fermentation experiments,the strain 22 was chosen for further experiments,which showed strong acid-producing,high fragrance production,high viscosity and appropriate protein hydrolysate properties.【Conclusion】The results showed that the optimal fermentation condition is at 37℃,for 4.5 h.The resulting cheese has viscosity 109.2 Pa·S,acidity 47.3°T,diacetyl content 2.826×10-3g/L and lactic acid 11.59%.

Key words：buffalo milk，curd，diacetyl，cheese

網(wǎng)絡優(yōu)先數(shù)字出版時間:2016-05-12

網(wǎng)絡優(yōu)先數(shù)字出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1075.N.20160512.1516.008.html

修回日期：2015-11-10

*廣西自然科學基金青年科學基金項目(2013GXNSFBA019113)資助。