李鵬飛，畢錫麟，王　鍇，景炅婕，呂麗華

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801；2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801）

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CART在不同發(fā)育階段牛卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)和定位

李鵬飛1，畢錫麟2，王鍇2，景炅婕2，呂麗華2

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801；2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801）

摘要：【目的】探討牛卵泡顆粒細(xì)胞中可卡因-苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽（cocaine-and amphetamine-regulated transcript, CART）的表達(dá)對(duì)牛不同階段卵泡發(fā)育的影響?！痉椒ā客ㄟ^對(duì)牛卵泡轉(zhuǎn)錄組ODF1（the largest onset of deviation follicle）和ODF2（the second largest onset of deviation follicle）顆粒細(xì)胞（granulesa cells, GCs）構(gòu)建RNA文庫，Illumina HiSeq 2000平臺(tái)測(cè)序；采集屠宰牛雙側(cè)卵巢，通過黃體形態(tài)特征篩選處于第一卵泡波階段的最大卵泡和第二大卵泡；分別抽取卵泡液，競爭性ELISA法測(cè)定卵泡液雌激素（estrodiol, E2）和孕酮（progestin, P）濃度，確定優(yōu)勢(shì)卵泡（dominant follicles，DF）和從屬卵泡（subordinate follicles，SF）；分別分離DF和SF顆粒細(xì)胞（granulosa cells, GCs），提取總RNA；設(shè)定3個(gè)重復(fù)樣本，以RPLP0作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)引物在牛DF和SF進(jìn)行qRT-PCR表達(dá)量檢測(cè)，GraphPad Prism 5.0作圖并進(jìn)行顯著性分析；兔抗CART一抗檢測(cè)CART在牛卵泡的表達(dá)?！窘Y(jié)果】轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，CART在ODF1的表達(dá)量是ODF2的38.2倍；通過黃體形態(tài)特征及激素測(cè)定共篩選出3頭牛的卵泡發(fā)育處于第一卵泡波，并獲得DF和SF；qRT-PCR結(jié)果顯示CART 在DF與SF的表達(dá)量差異極顯著（P＜0.01），高達(dá)2 310倍，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的表達(dá)差異趨勢(shì)一致；免疫組化結(jié)果表明，CART在牛DF和SF中均有表達(dá)，且DF表達(dá)量明顯高于SF，同時(shí)，CART主要在卵泡顆粒細(xì)胞層表達(dá)。【結(jié)論】在牛卵泡發(fā)育過程中，卵泡發(fā)育選擇期有其它抑制因子抑制了大多數(shù)卵泡的發(fā)育，阻止其成為DF；當(dāng)出現(xiàn)偏差后，CART的高表達(dá)抑制了DF進(jìn)入排卵期，推測(cè)CART可能是通過促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步抑制了顆粒細(xì)胞層E2的分泌，最終導(dǎo)致DF閉鎖。

關(guān)鍵詞：牛；卵泡；發(fā)育；CART；表達(dá)

聯(lián)系方式：李鵬飛，E-mail：adamlpf@126.com。通信作者呂麗華，E-mail：lihualvsxau@126.com

0 引言

【研究意義】單胎動(dòng)物在一個(gè)發(fā)情周期均會(huì)出現(xiàn)2—3個(gè)卵泡發(fā)育波，一般只有最后一個(gè)卵泡波中的優(yōu)勢(shì)卵泡最終排卵，排卵率低一直是影響單胎家畜繁殖環(huán)節(jié)的關(guān)鍵因素?？煽ㄒ?苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽（cocaine-and amphetamine-regulated transcript， CART）屬于動(dòng)物下丘腦分泌的神經(jīng)肽，課題組前期研究表明 CART對(duì)牛［1-2］、綿羊［3］、豬［4］卵泡顆粒細(xì)胞（granulesa cells， GCs）的增殖及雌激素（estrodiol， E2）的分泌具有抑制作用。本研究從分子和蛋白水平探究CART在牛不同發(fā)育階段卵泡的表達(dá)變化，為后期進(jìn)一步研究 CART對(duì)牛卵泡發(fā)育的影響奠定基礎(chǔ)。【前人研究進(jìn)展】 對(duì)牛卵泡發(fā)育和排卵相關(guān)的研究一直以來集中在人工調(diào)控發(fā)情持續(xù)時(shí)間及排卵時(shí)間和數(shù)量上［5］。近年來，研究人員通過促性腺激素與卵泡內(nèi)生長因子互作［5-7］、GCs凋亡與卵泡閉鎖的關(guān)系［8-11］來探討牛優(yōu)勢(shì)卵泡（dominant follicles，DF）生長發(fā)育和閉鎖規(guī)律。BABITHA等［12］在對(duì)水牛卵泡液VEGF研究證實(shí)卵巢毛細(xì)血管組織增生有助于牛卵泡波啟動(dòng)及卵泡發(fā)育。GUPTA等［13］研究發(fā)現(xiàn)卵泡液中的活性氧濃度對(duì)牛卵泡波發(fā)生和卵子發(fā)育具有調(diào)控作用。此外，高濃度的 E2和孕酮（progestin， P）以及 IGF-Ⅰ可顯著促進(jìn)末期卵母細(xì)胞的成熟［14-16］。【本研究切入點(diǎn)】在牛發(fā)情周期第一卵泡波中，ODF1最終必將發(fā)育為DF，ODF2無疑為從屬卵泡（subordinate follicles，SF），而第一卵泡波中的DF和SF隨著第一卵泡波發(fā)育的結(jié)束最終都將閉鎖，本研究選擇第一卵泡波中的卵泡作為研究對(duì)象，旨在探究CART在卵泡發(fā)育的不同階段是否為促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的主要因子?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)通過高通量測(cè)序、qRT-PCR和免疫組織化學(xué)定位技術(shù)探討CART在不同發(fā)育階段卵泡的表達(dá)，從而探明CART在卵泡發(fā)育各階段的調(diào)控作用及其信號(hào)傳導(dǎo)途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及材料

高通量測(cè)序用試驗(yàn)牛選取及ODF1和ODF2卵泡分離方法［17］。qRT-PCR和免疫組化試驗(yàn)用海福特牛選自山西文水肉牛屠宰場(chǎng)（采樣時(shí)間為2015年9月24日），采集雙側(cè)卵巢標(biāo)記并投入滅菌DPBS中，帶回山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物繁殖實(shí)驗(yàn)室處理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Illumina平臺(tái)測(cè)序 卵泡 GCs的分離、總RNA的提取以及 Illumina平臺(tái)對(duì)轉(zhuǎn)錄組 ODF1和ODF2進(jìn)行測(cè)序［17］。

1.2.2 通過黃體特征確定第一卵泡波 確定牛發(fā)情周期所采集的卵泡屬于第一卵泡波依據(jù)IRELAND等的研究［18］，可通過卵巢黃體表觀變化特征準(zhǔn)確判斷母牛發(fā)情階段。處于第一卵泡波階段的黃體要求處于牛發(fā)情周期的第5—6天，這時(shí)的黃體外觀呈紅色，表明近日排卵；裂點(diǎn)未被上皮細(xì)胞覆蓋；切開黃體內(nèi)部呈紅色，偶爾充滿血液，細(xì)胞松弛且有規(guī)則；黃體直徑0.5—1.5 cm；黃體表面的脈管系統(tǒng)外圍固有；此時(shí)卵巢上最大卵泡直徑 6—10 mm（圖1）。

1.2.3 采集卵泡液 用于 qRT-PCR的卵泡需確定DF和SF，將采集到的卵泡分別置于無菌培養(yǎng)皿上，超凈臺(tái)中用1 mL注射器及針頭注入卵泡，緩慢抽取各組卵巢中最大和第二大卵泡液，并分別分離GCs，-20℃保存待激素測(cè)定和總RNA提取。

1.2.4 E2和P的測(cè)定 卵泡液E2和P的測(cè)定選用競爭性ELISA法，使用牛E2ELISA Kit和PROG ELISA Kit試劑盒，具體方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5 qRT-PCR反應(yīng) 依據(jù) NCBI上Bos taurus的CART mRNA序列，Primer 5.0在線設(shè)計(jì)qRT-PCR引物；牛RPLP0作為內(nèi)參基因，上海生工合成引物。引物序列見表1。

表1　qRT-PCR引物序列Table 1 Primers of quantitative PCR

qRT-PCR反應(yīng)體系如下：SYBR? Premix Ex TaqⅡ 10 μL，Primer 各0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ0.4 μL，cDNA 2 μL，滅菌H2O至總體系20 μL。配置好反應(yīng)體系按如下條件進(jìn)行反應(yīng)，95℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 15 s，45個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。目的基因和內(nèi)參基因在同一條件反應(yīng)。

1.2.6 免疫組織化學(xué)分析 卵泡分離后放入 4％的多聚甲醛溶液中固定24 h后，70％ 酒精洗脫黃色，脫水包埋，制成5 μm厚的切片；二甲苯脫蠟后梯度酒精浸泡，蒸餾水沖洗；3％ H2O2阻斷后消化酶抗原修復(fù)；5％ BSA室溫封閉30 min，滴加500倍稀釋的山羊抗兔CART一抗（Abcam， America），濕盒4℃孵育10—12 h；滴加二抗，DAB顯色20 min；蘇木精復(fù)染25 s后，梯度酒精脫水，二甲苯透明；中性樹膠封片。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，GraphPad Prism 5.0作圖并進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 高通量測(cè)序后CART差異表達(dá)

通過 AUDIC［19］等的研究算法從兩個(gè)文庫中獲得差異表達(dá)基因，設(shè)定條件RPKM＞0.5，F(xiàn)DR校正后的P＜0.05，通過設(shè)定ODF1-RPKM/ODF2-RPKM ＞5，在ODF1和ODF2文庫中共發(fā)現(xiàn)147個(gè)高差異表達(dá)基因，其中 CART的差異表達(dá)倍數(shù)最高，為38.1519倍（表2）。

表2　Illumina平臺(tái)測(cè)序后CART的高差異表達(dá)Table 2 Highly differentially expressed CART in ODF1 and ODF2 by sequencing platform of Illumina

2.2 發(fā)情期第一卵泡波卵巢的篩選

在采樣過程中，共獲得11對(duì)卵巢的黃體形態(tài)符合第一卵泡波黃體形態(tài)的要求（圖 1-A為對(duì)照組）。確定第一卵泡波通過黃體形態(tài)特征觀察，該黃體為上一發(fā)情周期排卵后形成，主要從黃體的外部和內(nèi)部特點(diǎn)、黃體大小以及此時(shí)卵巢上最大卵泡的直徑來確定，圖 1為編號(hào)為 3、5、7的牛卵巢及其黃體圖（1-B、C、D）。

2.3 激素測(cè)定

本試驗(yàn)確定牛DF和SF卵泡的方法參考XU等［20］的研究結(jié)果，測(cè)定每一對(duì)卵巢中最大卵泡和第二大卵泡卵泡液中E2和P的濃度平均值，通過比值確定DF和SF，4次重復(fù)測(cè)定數(shù)值是同一卵泡液的激素濃度，因此，不進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用E2Elisa Kit和PROG Elisa Kit試劑盒、酶標(biāo)儀分別對(duì)采集的 11對(duì)牛卵巢各組最大和第二大卵泡的卵泡液進(jìn)行E2、P測(cè)定（表3），結(jié)果表明：第3、5、7組E2和P測(cè)定值中，最大卵泡的E2∶P值＞1，第二大卵泡的E2∶P值＜1，確定第3、5、7組卵巢采集的最大和第二大卵泡分別為第一卵泡波中的DF和SF。

2.4 CART基因在第一卵泡波DF和SF中表達(dá)差異分析

通過樣本重復(fù)校正、物理校正和RPLP0內(nèi)參基因校正，利用△△CT算法對(duì)CART在牛發(fā)情周期第一卵泡波DF和SF的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示：CART在DF中的表達(dá)量極顯著高于SF（P＜0.01），表達(dá)倍數(shù)高達(dá)2 310倍。

表3　各組卵巢卵泡液E2和P的測(cè)定Table 3 The E2and P determination results from groups of ovarian follicle fluid

圖1　牛發(fā)情周期第一卵泡波黃體形態(tài)Fig. 1 Corpus luteum morphological feature of the first follicular wave during the estrous cycle of cattle.

**表示在0.01水平上的比較結(jié)果** indicate significantly different at the level of 0.01圖2　CART在優(yōu)勢(shì)卵泡和從屬卵泡中的表達(dá)Fig. 2 Real time PCR analysis of CART expression in DF vs SF

2.5 CART免疫組織化學(xué)定位分析

免疫組化分析表明，CART在牛卵巢DF和SF均有表達(dá)（圖3-B， D），對(duì)照組無特異性顯色（圖3-A， C）；DF的GCs層和TCs層CART表達(dá)量明顯高于SF。

3 討論

卵泡發(fā)生閉鎖的典型特征就是 E2的分泌能力喪失［21-22］和卵泡內(nèi)E2與P比值的降低。E2分泌活躍的卵泡具有健康生長卵泡的生物化學(xué)特性和高的E2：P值；相對(duì)于閉鎖卵泡或向閉鎖趨勢(shì)發(fā)育的卵泡，其E2分泌能力低下，E2：P值較低，其比值通常以1為分界［22-24］。因此，在本試驗(yàn)中采用第一卵泡波中最大卵泡卵泡液E2：P＞1和第二大卵泡卵泡液 E2：P＜1來確定 DF和SF。在一個(gè)卵泡發(fā)育波中，卵巢內(nèi)部和表面分布有大量卵泡。在實(shí)際采樣過程中，所采集的最大卵泡和第二大卵泡是從母牛雙側(cè)卵巢中挑選，只能根據(jù)突出卵巢表面部分的卵泡大小情況，肉眼來估測(cè)最大卵泡和第二大卵泡，這會(huì)造成所采集的最大卵泡可能與卵泡發(fā)育的實(shí)際情況不符。因此，篩選的處于第一卵泡發(fā)育波階段的11對(duì)卵巢，只有第3、5、7組分離的卵泡為DF和SF。同時(shí)，也進(jìn)一步表明對(duì)卵泡液E2和P測(cè)定的必要性。

牛發(fā)情周期內(nèi)通常出現(xiàn)2個(gè)［25］或3個(gè)［26］卵泡波，但排卵卵泡僅出現(xiàn)在最后一個(gè)卵泡波的DF中。在牛卵泡發(fā)育的卵泡期和黃體期，E2分泌量較高的卵泡的生長與GCs增殖與卵泡內(nèi)E2的濃度、GCs和膜細(xì)胞（theca cells， TCs）中促黃體素（luteinizing hormone，LH）結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量有關(guān)；反之，E2分泌量較低的卵泡GCs中促卵泡素（follicle-stimulating hormone， FSH）結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量減少［22-23，27］。ILHA等研究表明，F(xiàn)SH濃度降低導(dǎo)致SF顆粒細(xì)胞LIF-STAT3信號(hào)活性降低，最終造成卵泡閉鎖，當(dāng) FSH濃度提高可恢復(fù)LIF-STAT3信號(hào)活性［28］。GARCIA等通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)卵泡發(fā)育波啟動(dòng)前FSH和LH的過量刺激可增強(qiáng)較小的有腔卵泡發(fā)育能力，但不會(huì)使原始卵泡持續(xù)募集，延長刺激時(shí)間可促進(jìn)大卵泡的成熟和排卵［29］。ATANASOV等通過在海福特牛和荷斯坦奶牛陰道內(nèi)放置P緩釋裝置，發(fā)現(xiàn)海福特牛排卵時(shí)血液P濃度較高且排卵提前，獲得的DF數(shù)量增加，排卵卵泡直徑較大［30］。哺乳期奶牛通過生物刺激和暫時(shí)性斷奶協(xié)同作用也可顯著提高卵泡發(fā)育、同期排卵，進(jìn)而提高母牛的受孕率［31］。

課題組通過體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)CART與卵泡GCs激素分泌和調(diào)控研究發(fā)現(xiàn)，牛卵泡GCs雌激素的分泌需在FSH誘導(dǎo)下產(chǎn)生，CART對(duì)卵泡發(fā)育有負(fù)調(diào)控作用，能夠引起牛卵泡閉鎖［1，32-33］。本研究通過采集牛發(fā)情期第一卵泡波ODF1/DF和ODF2/SF，通過高通量測(cè)序、qRT-PCR和免疫組化試驗(yàn)，從mRNA和蛋白水平證明CART在牛DF和SF中高差異表達(dá)，而第一卵泡波中DF和SF注定均會(huì)發(fā)生閉鎖，這表明在第一卵泡波中當(dāng)卵泡發(fā)育出現(xiàn)偏差前，卵泡能否優(yōu)勢(shì)化取決于卵泡內(nèi)因子和相關(guān)激素濃度；當(dāng)發(fā)育波出現(xiàn)偏差后，DF能否最終排卵，可能是由于GCs高表達(dá)的CART決定的。同時(shí)，免疫組化結(jié)果表明，GCs 層CART的表達(dá)量明顯高于TCs層，而牛卵泡E2主要由GCs分泌，高表達(dá)的CART可能通過促進(jìn)GCs凋亡，抑制顆粒細(xì)胞E2的分泌，進(jìn)而對(duì)卵泡的發(fā)育產(chǎn)生調(diào)控作用。

圖3　卵巢組織 CART 的表達(dá)（免疫組化 400×）Fig. 3 Expressions of CART in the ovary （immunohistochemistry 400×）

4 結(jié)論

牛卵泡發(fā)育過程中，第一卵泡波卵泡發(fā)育選擇期卵泡內(nèi)因子和相關(guān)激素抑制了大多數(shù)卵泡的發(fā)育，阻止其成為DF；當(dāng)出現(xiàn)偏差后，CART的高表達(dá)抑制了DF進(jìn)入排卵期，推測(cè)CART可能是通過促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡，最終導(dǎo)致DF閉鎖。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

Research on the Expression and Localization of CART in Bovine Granulosa Cells at Different Developmental Stages

LI Peng-fei1， BI Xi-lin2， WANG Kai2， JING Jiong-jie2， Lü Li-hua2
（1College of Life Science， Shanxi Agricultural University， Taigu 030801， Shanxi；2College of Animal Science and Technology，Shanxi Agricultural University， Taigu 030801， Shanxi）

Abstract：【Objective】The objective of this paper is to investigate the effect of CART （cocaine-and amphetamineregulated transcript） expression in granulosa cells on bovine follicular development at different stages.【Method】 Two RNA libraries from ODF1 （the largest onset of deviation follicle） and ODF2 （the second largest onset of deviation follicle）granulosa cells were prepared and sequenced using Illumina HiSeq 2000 platform. Cows were slaughtered， and both ovaries were collected， then the largest and the second largest follicles were screened through the morphology of corpus luteum in the first follicular wave. Follicular fluid was extracted for the concentration of E2and P measurement using competitive ELISA method to determine DF （dominant follicles） and SF （subordinate follicles）. Granulesa cells were isolated from DF and SF，and total RNA were extracted， respectively. Using RPLP0 as a reference gene， primers were designed. qRT-PCR wasperformed to detect the expression of CART in DF and SF， GraphPad Prism 5.0 was used for construction and significant analysis. Rabbit anti-CART antibody was used to detect the CART expression in cow follicles.【Result】Deep sequencing results showed that CART amounts in ODF1 were 38.2 times more than that in ODF2. Ovaries of 3 cows were screened out which were in the first follicular wave according to the observation of the morphology of corpus luteum， and the DF and SF were obtained. Real-time PCR results showed that CART expressed in DF was extremely significantly higher than that in SF，up to 2310-fold， which is consistent with the deep sequencing results. Immunohistochemistry results showed that CART expressed both in DF and SF， and the amounts in DF was significantly greater than that in SF， at the same time， CART was mainly expressed in granulosa cell layer.【Conclusion】During the process of follicular development in cattle， other inhibitors have suppressed most of the follicles， and prevented them to develop into DF； when the deviation appears， CART inhibited DF to further develop into ovulatory follicle， so it is considered that CART possibly by promoting granulosa cells apoptosis， and suppresses the E2secretion in granulosa cell layer， eventually leads to DF atresia.

Key words：bovine； follicle； development； CART； expression

收稿日期：2015-12-01；接受日期：2016-04-30

基金項(xiàng)目：國家自然基金（31172211）、農(nóng)業(yè)部“948”項(xiàng)目（2010-Z43）、山西省橫向協(xié)作與委托項(xiàng)目（2010HX54）、山西省回國留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目（2014-重點(diǎn)5）、山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20130311027-2）、山西省人事廳人才引進(jìn)項(xiàng)目、山西農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才博士科研啟動(dòng)費(fèi)（2014ZZ04） 和科研管理費(fèi)資助重大項(xiàng)目和標(biāo)志性成果培育項(xiàng)目（71060003）