尚　羽，周　倩，蔣玉婷

（上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院環(huán)境污染與健康研究所，上海200444）

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1-硝基芘和苯并［a］芘對人肺上皮A549細(xì)胞的聯(lián)合細(xì)胞毒性

尚羽，周倩，蔣玉婷

（上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院環(huán)境污染與健康研究所，上海200444）

摘要：1-硝基芘（1-nitropyrene，1-NP）是柴油車尾氣中檢測濃度最高的硝基多環(huán)芳烴.以1-NP為主體，人肺上皮A549細(xì)胞為研究對象，探討了1-NP和苯并［a］芘（benzo（a）pyrene，B［a］p）的聯(lián)合細(xì)胞毒性及其對DNA的損傷.聯(lián)合染毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)B［a］p和1-NP同時(shí)作用于A549細(xì)胞時(shí)，B［a］p能明顯減弱由1-NP造成的細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）水平升高，但對DNA的損傷與1-NP單獨(dú)染毒組相近；利用B［a］p預(yù)染毒A549細(xì)胞24 h，能明顯減弱由1-NP造成的細(xì)胞增殖抑制和ROS水平升高，但對DNA的損傷加劇.以上結(jié)果說明，1-NP和B［a］p聯(lián)合作用可能是通過抑制ROS的生成來降低對細(xì)胞增殖的抑制，但所造成的對DNA損傷的加劇可能是通過其他的作用途徑.

關(guān)鍵詞：1-硝基芘；苯并［a］芘；大氣顆粒物；DNA損傷；活性氧簇

近年來，大氣顆粒物（particulate matter，PM）污染已經(jīng)成為影響人類健康的重要環(huán)境因素［1-3］.PM的來源復(fù)雜，包括工業(yè)排放、燃煤發(fā)電、機(jī)動(dòng)車尾氣、秸稈焚燒、道路和建筑工地?fù)P塵等［4］.有機(jī)物是PM的重要化學(xué)組分，而最受關(guān)注的，且會(huì)對健康產(chǎn)生影響的是多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）及其衍生物（如硝基多環(huán)芳烴、醌類有機(jī)物等）.硝基多環(huán)芳烴（nitro-PAHs）廣泛存在于大氣、機(jī)動(dòng)車尾氣等環(huán)境介質(zhì)中，可直接來源于化石燃料的不完全燃燒，也可由前體物經(jīng)大氣光化學(xué)反應(yīng)的二次轉(zhuǎn)化產(chǎn)生.Bonnefoy等［5］的研究發(fā)現(xiàn)，nitro-PAHs的致突變和致癌潛力可達(dá)其母體PAHs的10～100000倍.吸附于顆粒物表面的nitro-PAHs能隨呼吸進(jìn)入人體，并可能通過直接突變引起肺癌.

大氣環(huán)境中的nitro-PAHs種類較多，其中1-硝基芘（1-nitropyrene，1-NP）是柴油車尾氣中檢測濃度最高的nitro-PAHs［6］，對柴油車尾氣顆粒的致突變性有重要影響［7］.已有研究發(fā)現(xiàn)，1-NP可以促進(jìn)人肺上皮A549細(xì)胞產(chǎn)生活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），導(dǎo)致DNA損傷和細(xì)胞死亡［8］，并誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌［9］.苯并［a］芘（benzo（a）pyrene，B［a］p）是污染范圍最廣、致癌性最強(qiáng)的一種多環(huán)芳烴，是環(huán)境中多環(huán)芳烴類化合物的典型代表.因此，本工作以1-NP為主體，人肺上皮A549細(xì)胞為研究對象，探討了1-NP和B［a］p的聯(lián)合細(xì)胞毒性及其對DNA的損傷，并利用熒光探針的方法測定了細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS水平.

1　材料與儀器

1.1主要材料和試劑

胎牛血清（奧地利PAA Laboratories GmbH公司），HAM’S/F-12培養(yǎng)基（賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司），四甲基偶氮唑鹽（3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT，美國Life Science公司），瓊脂糖、1-NP（＞99%）和B［a］p（＞95%）（美國Sigma-Aldrich公司），96孔、24孔及6孔培養(yǎng)板、35 mm培養(yǎng)皿以及75 cm2培養(yǎng)瓶（美國Corning公司），其他試劑（分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）.

1.2儀器

CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國LINGDE公司），iMark-680型酶聯(lián)免疫檢測儀（美國BIO-RAD公司），正置熒光顯微鏡（BX51型，日本Olympus公司）.

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)和染毒

（1）細(xì)胞培養(yǎng).

人肺上皮A549細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫.使用HAM’S/F-12培養(yǎng)基，于5%CO2，37?C恒溫恒濕條件下對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng).當(dāng)細(xì)胞生長2～3 d，單層細(xì)胞達(dá)到80%以上時(shí)，按1∶3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng).

（2）染毒.

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，按每孔3×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，供MTT實(shí)驗(yàn)使用；按每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板或35 mm培養(yǎng)皿，供彗星實(shí)驗(yàn)、ROS測定使用.接種后于5%CO2，37?C恒溫恒濕條件下對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，令其貼壁生長.待細(xì)胞貼壁后，棄培養(yǎng)基，使用D-Hanks清洗兩次，進(jìn)行染毒.

1-NP單獨(dú)染毒的條件如下：使用不同濃度（1，2，3，4，5μmol/L）的1-NP染毒24 h.

1-NP和B［a］p聯(lián)合染毒的條件如下：①預(yù)染毒，使用B［a］p（5μmol/L）預(yù)染毒24 h后，棄上清液，使用D-Hanks清洗兩次，再使用不同濃度1-NP繼續(xù)染毒24 h；②混合染毒，待細(xì)胞貼壁（8～24 h）后，加入含有B［a］p，1-NP的2%胎牛血清培養(yǎng)液，在37?C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，之后棄去培養(yǎng)基，用D-Hanks清洗3次，并在37?C，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行檢測.設(shè)置3～6個(gè)平行樣.

使用二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）將1-NP和B［a］p配置成100 mmol/L的儲(chǔ)備液，每次染毒時(shí)重新稀釋至所需濃度.染毒時(shí)使用含2%胎牛血清的培養(yǎng)液稀釋至所需濃度，并保持DMSO的濃度為0.1%（v/v）.實(shí)驗(yàn)設(shè)置溶劑對照組（DMSO，0.1%）和空白對照組（HAM’S/F-12培養(yǎng)基，不含細(xì)胞）.

2.2MTT實(shí)驗(yàn)

染毒結(jié)束后，每孔加入5 mg/mL MTT試劑10μL，混勻后，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；之后棄去培養(yǎng)液，加入DMSO溶液100μL，震蕩10 min.用酶聯(lián)免疫檢測儀測定光密度D，波長為490 nm.細(xì)胞存活率的計(jì)算公式如下：

式中，S為細(xì)胞存活率，DE，DB，DC分別為實(shí)驗(yàn)組、空白對照組和溶劑對照組的光密度.

2.3彗星實(shí)驗(yàn)

彗星實(shí)驗(yàn)（comet assay），又稱單細(xì)胞凝膠電泳（single cell gel electrophoresis，SCGE）分析，是一種快速檢測單個(gè)細(xì)胞內(nèi)DNA損傷的技術(shù).在電泳過程中，DNA未受損的細(xì)胞其核DNA停留在核基質(zhì)中，染色后呈現(xiàn)圓形的熒光團(tuán)，無拖尾；DNA受損的細(xì)胞其DNA斷鏈或碎片將向陽極遷移，形成拖尾.細(xì)胞核DNA損傷越重，表現(xiàn)為拖尾長度的增加和尾部熒光強(qiáng)度的增強(qiáng).因此，通過測定DNA遷移部分的光密度或遷移長度就可定量測定單個(gè)細(xì)胞DNA的損傷程度.本研究采用了Tice等［10］提出的彗星方法，具體步驟可參考文獻(xiàn)［8，11］.使用分析軟件CASP進(jìn)行彗星數(shù)據(jù)分析，記錄尾長（tail length）、頭部（head）和尾部（tail）DNA的熒光強(qiáng)度，并將尾部DNA含量作為DNA損傷的定量指標(biāo)［12］，即

式中，AT為尾部DNA熒光強(qiáng)度，AH為頭部DNA熒光強(qiáng)度.每個(gè)樣本分析不少于80個(gè)細(xì)胞，

取其中位值，再取3～4個(gè)平行樣的平均值.

2.4ROS測定

使用2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯（2’，7’-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）作為熒光探針檢測ROS水平.DCFH-DA本身沒有熒光，且可以自由穿過細(xì)胞膜，在胞內(nèi)可以被酯酶水解生成DCFH，而DCFH卻不能穿透細(xì)胞膜，從而被裝載到細(xì)胞內(nèi).細(xì)胞內(nèi)的活性氧ROS可以氧化無熒光的DCFH，生成帶有熒光的DCF.通過檢測DCF的熒光強(qiáng)度即可指示細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平，具體步驟可參考文獻(xiàn)［8，11］.本實(shí)驗(yàn)用光密度值來表示ROS水平，并將所得結(jié)果與對照組作歸一化處理.

2.5數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的處理和計(jì)算采用Microsoft Office Excel 2007進(jìn)行，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）”的形式表示，各指標(biāo)組間差異采用t檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì).

3　結(jié)果和討論

3.1細(xì)胞存活率

1-NP和B［a］p的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示.圖2為1-NP和B［a］p聯(lián)合染毒條件下A549細(xì)胞的存活率，其中???表示染毒組與溶劑對照組相比p＜0.001；#和##分別表示1-NP單獨(dú)染毒組與1-NP和B［a］p聯(lián)合染毒組相比p＜0.05和p＜0.01.B［a］p的濃度選定為5μmol/L，在此濃度下B［a］p對A549細(xì)胞的存活率并無顯著影響（數(shù)據(jù)略）.由圖2（a）可見，經(jīng)5μmol/L B［a］p和不同濃度的1-NP聯(lián)合染毒24 h，A549細(xì)胞的存活率與1-NP單獨(dú)染毒24 h相比，有不同程度的上升，且在1-NP濃度為4和5μmol/L處，呈顯著上升（p＜0.01）.由圖2（b）可見，使用5μmol/L B［a］p預(yù)染毒24 h，再使用不同濃度的1-NP染毒24 h，B［a］p預(yù)染毒可使1-NP 對A549細(xì)胞的增殖抑制作用有所減弱，與1-NP單獨(dú)染毒相比，細(xì)胞存活率略有上升，且在高劑量處呈顯著上升（p＜0.05）.

圖1 1-NP和B［a］p的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of 1-NP and B［a］p

圖2 1-NP和B［a］p聯(lián)合染毒條件下A549細(xì)胞的存活率Fig.2 Cell viability of A549 cells after treated with 1-NP and B［a］p

3.2DNA損傷

彗星照片顯示，對照組A549細(xì)胞頭部DNA致密，邊緣光滑，沒有明顯的損傷；而染毒組和陽性對照組一樣，拖尾明顯，成掃帚狀，且1-NP的濃度越高，拖尾現(xiàn)象越明顯（圖片略）.圖3為使用兩種不同的混合染毒方式，1-NP和B［a］p對A549細(xì)胞DNA的損傷，其中??和???分別表示染毒組與溶劑對照組相比p＜0.01和p＜0.001，##表示1-NP單獨(dú)染毒組與1-NP和B［a］p聯(lián)合染毒組相比p＜0.05.由圖3（a）可見，經(jīng)5μmol/L B［a］p和不同濃度的1-NP聯(lián)合染毒24 h，可對A549細(xì)胞的DNA造成損傷，且隨著1-NP濃度的增加，尾部DNA含量不斷上升，呈顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系（p＜0.01），與1-NP單獨(dú)染毒組相比，DNA損傷程度有顯著升高（p＜0.01）.由圖3（b）可見，使用5μmol/L B［a］p預(yù)染毒24 h，再使用不同濃度的1-NP染毒24 h，也會(huì)對A549細(xì)胞的DNA造成損傷，但與1-NP單獨(dú)染毒組相比，拖尾量并無顯著差異（p＞0.05）.

圖3 1-NP和B［a］p聯(lián)合染毒對A549細(xì)胞DNA的損傷Fig.3 DNA damage of A549 cells after treated with 1-NP and B［a］p

3.3ROS生成

圖4為1-NP和B［a］p聯(lián)合染毒對A549細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響（對比于對照組的100倍），其中?和??分別表示染毒組與溶劑對照組相比p＜0.01和p＜0.001，#為1-NP單獨(dú)染毒組與1-NP和B［a］p聯(lián)合染毒組相比p＜0.01，tBHP為氧化劑叔丁基過氧化氫（tert-butyl hydroperoxide）.由圖4（a）可見，經(jīng)5μmol/L B［a］p和不同濃度的1-NP聯(lián)合染毒2 h后，A549細(xì)胞內(nèi)的ROS水平隨1-NP濃度的增加而不斷升高，但與1-NP單獨(dú)染毒2 h相比，卻略有降低，且在1-NP濃度為5μmol/L處呈顯著降低.由圖4（b）可見，使用5μmol/L B［a］p預(yù)染毒24 h，再使用不同濃度的1-NP染毒2 h，B［a］p預(yù)染毒在某種程度上抑制了1-NP單獨(dú)染毒后細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，且在1-NP濃度為4和5μmol/L處，ROS的產(chǎn)量呈顯著下降（p＜0.05）.

圖4 1-NP和B［a］p聯(lián)合染毒對A549細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響Fig.4　ROS formation of A549 cells after treated with 1-NP and B［a］p

4　結(jié)束語

MTT實(shí)驗(yàn)是評價(jià)外源性物質(zhì)總體毒性的常用方法之一.本研究結(jié)果表明：對于經(jīng)B［a］p（5μmol/L）預(yù)染毒后的A549細(xì)胞，1-NP對其增殖抑制作用呈顯著降低；當(dāng)B［a］p （5μmol/L）和不同濃度的1-NP同時(shí)作用于A549細(xì)胞時(shí)，1-NP對其增殖抑制作用也呈顯著降低.本研究采用的彗星實(shí)驗(yàn)具有快速、簡便、應(yīng)用范圍廣和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，是檢測細(xì)胞遺傳毒性的常用方法之一.本研究使用的是強(qiáng)堿性電泳液（pH＞13），通過尾部DNA的含量定量表征單個(gè)細(xì)胞DNA的損傷程度，是單鏈斷裂、雙鏈斷裂和堿性不穩(wěn)定位點(diǎn)的綜合損傷結(jié)果.本研究結(jié)果顯示，1-NP可對A549細(xì)胞造成顯著的DNA損傷，且隨著1-NP濃度的升高，DNA的損傷程度顯著加深，并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系（p＜0.01）.B［a］p（5μmol/L）預(yù)染毒24 h會(huì)使1-NP對A549細(xì)胞的DNA損傷加劇，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）；當(dāng)B［a］p （5μmol/L）和不同濃度的1-NP同時(shí)作用于A549細(xì)胞時(shí)，會(huì)加劇對A549細(xì)胞的DNA損傷，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）.“氧化應(yīng)激”是指機(jī)體的促氧化與抗氧化之間的不平衡狀態(tài).以促氧化效應(yīng)為主、抗氧化劑被消耗，中間會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，通常會(huì)導(dǎo)致生物大分子如DNA的損傷，亦會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡.當(dāng)B［a］p與1-NP聯(lián)合染毒時(shí)，ROS水平低于1-NP單獨(dú)染毒時(shí)，但仍顯著高于對照組.

在本研究中，當(dāng)B［a］p和1-NP同時(shí)作用于A549細(xì)胞時(shí)，降低了1-NP單獨(dú)染毒時(shí)產(chǎn)生的ROS，使得急性毒性降低，細(xì)胞的增殖活性抑制減弱，但DNA的損傷明顯高于1-NP單獨(dú)染毒組.這可以理解為當(dāng)B［a］p和1-NP同時(shí)作用于A549細(xì)胞時(shí)，B［a］p的毒性和1-NP同時(shí)占據(jù)A549細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)，A549細(xì)胞對不同PAHs的代謝方式和代謝能力不同，導(dǎo)致其表現(xiàn)出不同的生物學(xué)效應(yīng).B［a］p對細(xì)胞的增殖在24 h內(nèi)沒有顯著性差異，這可能是由于時(shí)間較短，還檢測不到對細(xì)胞的增殖抑制，所以1-NP和B［a］p聯(lián)合染毒時(shí)檢測到的細(xì)胞存活率較1-NP單獨(dú)染毒時(shí)更高.5μmol/L的B［a］p誘導(dǎo)A549細(xì)胞產(chǎn)生ROS的能力較弱，因?yàn)閾屨嘉稽c(diǎn)的原因，降低了1-NP作用于A549細(xì)胞產(chǎn)生的ROS水平，從而使聯(lián)合染毒產(chǎn)生的ROS低于1-NP單獨(dú)染毒時(shí)產(chǎn)生的ROS.1-NP和B［a］p都具有遺傳毒性，5μmol/L B［a］p的遺傳毒性大于1-NP，1-NP和B［a］p聯(lián)合染毒時(shí)，表現(xiàn)為B［a］p占突出優(yōu)勢，導(dǎo)致的DNA損傷大于1-NP單獨(dú)染毒時(shí).這也說明在1-NP和B［a］p聯(lián)合染毒時(shí)，B［a］p起主導(dǎo)作用.

用B［a］p預(yù)染毒A549細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的抗氧化物酶（如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等）活化，使細(xì)胞的抗氧化能力增強(qiáng)，對細(xì)胞形成保護(hù)作用，降低了1-NP產(chǎn)生的ROS，使得A549細(xì)胞存活率顯著上升.用B［a］p預(yù)染毒A549細(xì)胞時(shí)，大量的B［a］p占據(jù)了有限的結(jié)合位點(diǎn)，但這種結(jié)合是不穩(wěn)定的.因此，當(dāng)B［a］p不存在，或與1-NP相比濃度特別低時(shí)，B［a］p所占據(jù)的有限的結(jié)合位點(diǎn)就會(huì)被1-NP所取代，表現(xiàn)為DNA損傷較1-NP單獨(dú)染毒時(shí)加重，但不存在顯著性差異.以上聯(lián)合實(shí)驗(yàn)說明，1-NP作用于A549細(xì)胞導(dǎo)致的DNA損傷不僅是通過ROS攻擊DNA所致，同時(shí)還有其他方式，如nitro-PAHs直接或其代謝后產(chǎn)物與DNA形成加合產(chǎn)物，但具體是哪一種方式，還需要進(jìn)一步研究.

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E-mail：yushang@shu.edu.cn

中圖分類號：R 994.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1007-2861（2016）02-0181-07

DOI：10.3969/j.issn.1007-2861.2016.01.008

收稿日期：2016-01-12

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21107068，41561144007）；上海大學(xué)長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目（IRT13078）

通信作者：尚羽（1982—），女，副研究員，博士，研究方向?yàn)榇髿馕廴疚锏膮^(qū)域污染特征和健康影響.

Combined effects of 1-nitropyrene and benzo（a）pyrene on cytotoxicity and DNA damage in human lung epithelial A549 cells

SHANG Yu，ZHOU Qian，JIANG Yuting
（Institute of Environmental Pollution and Health，School of Environmental and Chemical Engineering，Shanghai University，Shanghai 200444，China）

Abstract：Using human lung epithelial A549 cells，combined toxic effects of 1-nitropyrene （1-NP）and benzo（a）pyrene（B［a］p）were evaluated.The 1-NP caused a significantly concentration-dependent viability decrease，DNA damage and reactive oxygen species（ROS）generation.Compared with the groups treated with 1-NP alone，viability was significantly increased and ROS generation was significantly reduced in combined-treated groups with 1-NP and B［a］p.However，the DNA damage was significantly increased in the combinedtreated groups compared with the groups treated with 1-NP alone.These results suggested that 1-NP may mediate the cytotoxic effects through ROS generation，and pretreatment，with B［a］p may inhibit ROS generation induced by 1-NP，and thereby reducing the cell death in A549 cells.However mechanisms of DNA damage deserves further investigations.

Key words：1-nitropyrene（1-NP）；benzo（a）pyrene（B［a］P）；particulate matter；DNA damage；reactive oxygen species（ROS）