付淵++周存六

摘 要：以雞胸肉中提取的肌球蛋白為研究對象，考察不同添加量（0～0.09%）L-精氨酸對肌球蛋白凝膠的硬度、保水性和微結(jié)構(gòu)等凝膠特性以及肌球蛋白溶液熱特性的影響。結(jié)果表明：L-精氨酸可顯著提高肌球蛋白凝膠的保水性（P<0.05），降低凝膠硬度（P<0.05）。掃描電鏡顯示空白組樣品呈現(xiàn)大小不均的孔洞與顆粒狀聚集物共存的凝膠結(jié)構(gòu)，而添加0.03%～0.05% L-精氨酸的樣品呈現(xiàn)相對致密的凝膠結(jié)構(gòu)。L-精氨酸添加量達(dá)到0.03%以上時，肌球蛋白的第1個變性溫度TM1顯著降低；L-精氨酸添加量達(dá)到0.04%以上時，肌球蛋白的第2個變性溫度TM2顯著降低（P<0.05）。

關(guān)鍵詞：肌球蛋白；L-精氨酸；保水性；硬度；微觀結(jié)構(gòu)；熱特性

保水性和質(zhì)構(gòu)是肉制品的重要品質(zhì)特性，對肉制品的產(chǎn)率與口感有十分重要的影響[1]。鈉鹽的使用是目前提高肉制品保水性和質(zhì)構(gòu)的重要手段之一。在肉制品加工過程中，氯化鈉能夠改善產(chǎn)品的風(fēng)味、嫩度和多汁性等品質(zhì)特性，有利于產(chǎn)品的保藏[2]。但是，攝入過量鈉鹽可誘發(fā)高血壓[3]，增加中風(fēng)及心腦血管的發(fā)病幾率[4]；降低肉制品鈉鹽的使用量，將降低產(chǎn)品風(fēng)味、口感，縮短產(chǎn)品貨架期。因此，研發(fā)鈉鹽替代物顯得尤為重要。

研究表明，添加精氨酸可提高豬肉腸的保水性、硬度、咀嚼性、彈性以及其他感官性能，提高豬肉糜蛋白的變性溫度，有利于光滑、致密、均勻凝膠的形成[5]，在肉制品加工中具有潛在的應(yīng)用前景。

鹽溶蛋白是肌肉中的重要蛋白成分，參與肉凝膠的形成過程，對肉制品的保水性和質(zhì)構(gòu)特性產(chǎn)生重要影響[6]。研究精氨酸對鹽溶蛋白凝膠形成的影響有利于揭示精氨酸對肉制品保水性和質(zhì)構(gòu)特性的影響機(jī)制。然而，迄今為止，國內(nèi)外關(guān)于外源性氨基酸對鹽溶蛋白熱凝膠的影響研究很少[7]；精氨酸對肌球蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的影響尚未見報(bào)導(dǎo)。本研究以雞胸肉中提取的肌球蛋白為研究對象，考察不同添加量（0～0.09%）L-精氨酸對肌球蛋白凝膠的硬度、保水和微結(jié)構(gòu)等凝膠特性以及肌球蛋白溶液熱特性的影響，以探討L-精氨酸對肉制品保水性和質(zhì)構(gòu)特性影響的機(jī)制，為低鈉肉制品研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胸肉購于合肥市家樂福超市。

磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、焦磷酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、氯化鉀、無水乙醇、丙酮、戊二醛、甲醛等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BC/BD-241冰柜 青島Haier集團(tuán)公司；ML104型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SCX-8/2A絞肉機(jī) 上海雙碟廚具有限公司；DS-1組織搗碎機(jī) 上海越磁電子科技有限公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；CT14RD冷凍離心機(jī) 上海天美生化儀器設(shè)備有限公司；8S-1磁力攪拌器 江蘇省金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；752N紫外-可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；FD-1A-50冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TA-XT Plus硬度儀 英國Stable Micro System公司；JSM6490LV掃描電子顯微鏡 日本JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的提取

肌球蛋白提取：參照Chen等[8]的方法，將雞胸肉剔除可見脂肪和結(jié)締組織，切碎后取約150 g，在0～4 ℃條件下提取肌球蛋白。肌球蛋白溶液濃度的測定參照Zhou等[9]的方法，利用0.6 mol/L氯化鉀磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.5），將蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度調(diào)整至20 mg/mL，待用。

1.3.2 肌球蛋白-精氨酸混合溶液的制備

參照史可夫等[10]的方法，分別向50 g 20 mg/mL肌球蛋白溶液中加入L-精氨酸，使L-精氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到0.00%、0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%。在0～4 ℃條件下緩慢攪拌30 min，至完全溶解，在冰箱中（約4 ℃）靜置過夜（約12 h），形成肌球蛋白-精氨酸混合溶液待用。

1.3.3 肌球蛋白-精氨酸混合凝膠的制備

參照史可夫等[10]的方法，將處理后的肌球蛋白-精氨酸混合凝膠樣品倒入小燒杯（27 mm×35 mm），放在20 ℃水浴鍋中，以2 ℃/min的升溫速率加熱至80 ℃，并恒溫處理30 min，取出小燒杯放入冰水浴中冷卻10 min，放入冰箱中過夜（約12 h），待測。

1.3.4 凝膠保水性的測定

參照Qin等[11]的方法。取約10 g肌球蛋白-精氨酸凝膠在1 000 g/min下離心10 min，重復(fù)檢測3 組。

1.3.5 凝膠硬度的測定

參照Zhou等[9]的方法。采用TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀，設(shè)定GMIA程序測定肌球蛋白-精氨酸混合凝膠的硬度。參數(shù)設(shè)定：探頭選用P/0.5，測試前速率1.50 mm/s，測試中速率1.00 mm/s，測試后速率1.00 mm/s，穿刺距離4 mm，觸發(fā)力5 g。檢測重復(fù)3 次。

1.3.6 掃描電子顯微鏡的測試

參照Qin等[11]的方法。將肌球蛋白-精氨酸凝膠樣品放置在4%甲醛和2.5%戊二醛混合溶液（1∶1，V/V）中浸泡固定2 h，在凝膠樣品固定變硬后，將樣品均勻地切成10 mm×10 mm×2 mm的薄片；采用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.2）漂洗5～10 次；用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇（30%、40%、60%、80%和100%）溶液脫水，每次浸泡10 min，在通風(fēng)廚中用冷風(fēng)除去易揮發(fā)的有機(jī)溶劑；在真空冷凍干燥機(jī)中干燥15 h；噴金，觀察。

1.3.7 肌球蛋白熱特性的檢測

參照陳星[12]的方法并稍加改動。稱取10～15 mg蛋白樣品，密封于鋁坩堝中，放入設(shè)備中，并同時以空的鋁坩堝作為對照。起始溫度為20 ℃，并在此溫度下平衡5 min，再以2 ℃/min升至80 ℃，收集其熱相變溫度T及相變焓值△H。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以O(shè)rigin 8.0進(jìn)行繪圖，方差分析中的顯著性檢驗(yàn)采用IBM SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，當(dāng)P<0.05時視為顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同添加量L-精氨酸對肌球蛋白凝膠保水性的影響

樣品1～6. L-精氨酸添加量分別為0.00%、0.01%、0.03%、0.05%、0.07%和0.09%。下同。

由圖1可知，與空白組相比，添加精氨酸

（L型，下同）能夠很明顯地提高肌球蛋白凝膠的保水性

（P<0.05）。這一現(xiàn)象與將精氨酸、賴氨酸分別添加到豬肉香腸中能顯著提高其保水性的研究結(jié)果相似[7，13]。李俊[7]、Zhou[13]等推測由于精氨酸為堿性氨基酸，加入精氨酸可以改變豬肉香腸的pH值，使其偏離等電點(diǎn)，進(jìn)而改變其保水性。已有研究[14]指出：調(diào)整牛肉的pH值可以提高其產(chǎn)率，進(jìn)一步支持他們的觀點(diǎn)。Guo等[15]研究發(fā)現(xiàn)精氨酸能夠增加豬肉肌球蛋白的溶解性，表明精氨酸能夠增強(qiáng)肌球蛋白的水合作用，進(jìn)一步說明添加精氨酸能夠增加蛋白凝膠的保水性。另一方面，Qin等[11]研究結(jié)果表明隨著精氨酸添加量的增加，雞鹽溶性蛋白凝膠的保水性也隨之增加；該研究指出隨著精氨酸添加量的增加，鹽溶性蛋白的微觀組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變是可能導(dǎo)致上述結(jié)果的又一重要原因。另外，精氨酸添加量為0.03%與0.01%、0.05%與0.03%以及0.07%與0.05%的蛋白凝膠的保水性差異不顯著（P>0.05），這可能是由于精氨酸添加量的變化不足以明顯改變蛋白溶液的pH值，或添加精氨酸所導(dǎo)致的pH值的改變不足以顯著提高其保水性。雖然差別不顯著，但是仍然可以發(fā)現(xiàn)，隨著精氨酸的增加，肌球蛋白凝膠的保水性呈逐漸升高的趨勢，意味著精氨酸的添加有利于改善肉制品的產(chǎn)率及多汁性。

2.2 不同添加量L-精氨酸對肌球蛋白凝膠硬度的影響

由圖2可知，相對于空白組，添加了精氨酸的肌球蛋白混合凝膠的硬度顯著降低（P<0.05）；并且，肌球蛋白凝膠的硬度隨著精氨酸添加量的增加而顯著降低（P<0.05）。Ma等[16]研究表明，在超高壓條件下添加卡拉膠和CaCl2到鹽溶蛋白體系后，其凝膠硬度也出現(xiàn)顯著性降低（P<0.05）。有學(xué)者[17-18]指出肌球蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)可以通過高靜壓等不同技術(shù)處理或外源性成分的添加來實(shí)現(xiàn)；經(jīng)上述處理，肌球蛋白得以展開并暴露出更多的帶電基團(tuán)，這種變化可能與其凝膠硬度相關(guān)。另外，有學(xué)者指出pH值的變化也對肉蛋白凝膠的硬度產(chǎn)生影響[19]，并指出最優(yōu)的pH值約為6.0。精氨酸的等電點(diǎn)為10.8[20]，可以推測精氨酸的添加能夠顯著改變肌球蛋白體系的pH值，導(dǎo)致凝膠硬度的降低。但精氨酸影響肌球蛋白凝膠的硬度的機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步的探究。然而，Zhou等[5]發(fā)現(xiàn)添加精氨酸能夠明顯增加豬肉腸的硬度（P<0.05），這與目前的研究結(jié)果相反，可能由于豬肉蛋白與雞肌球蛋白的凝膠性質(zhì)有很大差異。Qin等[11]研究也指出雞鹽溶蛋白凝膠的硬度隨精氨酸添加量的增加而顯著提高。除了肌球蛋白，鹽溶性蛋白中還含有肌動蛋白、肌動球蛋白[21]，這些成分的存在對肌球蛋白凝膠特性有重要的影響[22]，可能是導(dǎo)致Qin等[11]的結(jié)果與本結(jié)果不同的原因。

2.3 不同添加量L-精氨酸對肌球蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

A～F. L-精氨酸添加量分別為0.00%、0.01%、0.03%、0.05%、0.07%和0.09%。

由圖3可知，空白組的肌球蛋白凝膠由大小不均一的無規(guī)則的空洞和不規(guī)則的團(tuán)狀聚集物共同組成。

Qin[11]、Sun[23]等研究表明，未添加精氨酸的肌鹽溶蛋白加熱也形成相對粗糙的凝膠。當(dāng)精氨酸的加入量達(dá)到0.03%和0.05%時，可以明顯觀察到肌球蛋白凝膠較為平整，且團(tuán)狀聚集物呈現(xiàn)減少的現(xiàn)象。隨著添加量增加到0.07%和0.09%時，可以看到肌球蛋白凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中分布著較為均勻的孔洞。Sun等[23]認(rèn)為，蛋白凝膠的保水性與其孔徑呈負(fù)相關(guān)，添加精氨酸導(dǎo)致凝膠結(jié)構(gòu)的變化可能與其保水性的變化密切相關(guān)。另外，多孔的凝膠結(jié)構(gòu)與其硬度降低也可能有關(guān)。

2.4 不同添加量精氨酸對肌球蛋白凝膠熱特性的影響

由圖4及表1可知，空白組的差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）呈現(xiàn)出2 個特征峰，分別位于52.81 ℃和66.95 ℃，這與Ma等[16]的研究結(jié)果基本一致。有研究[23-24]報(bào)道，位于52.81 ℃特征峰為肌球蛋白頭部變性所致，而位于66.95 ℃特征峰為肌球蛋白尾部變性所致。相較于空白組，精氨酸的添加量達(dá)到0.03%以上時，第1個峰對應(yīng)的溫度顯著降低

（P<0.05），表明添加精氨酸之后肌球蛋白頭部的轉(zhuǎn)變溫度朝較低的溫度方向移動、穩(wěn)定性呈現(xiàn)降低的趨勢。精氨酸的添加量達(dá)到0.04%以上時，第2個峰對應(yīng)的溫度顯著降低（P<0.05），表明添加精氨酸之后肌球蛋白尾部的變性溫度降低、穩(wěn)定性下降。Qin等[11]發(fā)現(xiàn)精氨酸添加到雞胸鹽溶蛋白中導(dǎo)致鹽溶蛋白對應(yīng)的第1個峰消失，而第2個峰對應(yīng)的溫度降低。Ma等[16]研究也表明，同時向豬鹽溶蛋白中加入0.2% CaCl2和0.6%卡拉膠的混合物，可以顯著降低肌球蛋白尾部的變性溫度，同時肌球蛋白頭部的轉(zhuǎn)變峰消失。這些研究報(bào)導(dǎo)與本研究結(jié)果基本類似。Ma等[16]指出加入的Ca2+可能激活了內(nèi)源性谷氨酰胺酶，同時卡拉膠可能與蛋白質(zhì)間產(chǎn)生靜電作用，兩者共同作用于鹽溶蛋白，導(dǎo)致上述結(jié)果。

3 結(jié) 論

添加精氨酸能夠提高肌球蛋白凝膠的保水性，降低硬度（P<0.05）。同時，添加0.03%和0.05%精氨酸的樣品呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)均勻致密的凝膠網(wǎng)狀，顯著改變肌球蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。精氨酸的添加量達(dá)到0.03%以上顯著降低肌球蛋白頭部變性溫度，添加量達(dá)0.04%以上顯著降低尾部變性溫度（P<0.05）。本研究表明，精氨酸的添加改變了肌球蛋白溶液的熱特性及肌球蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)，可能導(dǎo)致最終肌球蛋白凝膠保水性的提高、硬度的降低。

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