戴智慧，黃士文,2，倪 穗*，胡 偉

(1.寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.慈溪市橫河鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)辦公室，浙江 慈溪 315318 ；3.慈溪市橫河鎮(zhèn)童岙茶場，浙江 慈溪 315318)

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HPLC法測定浙江慈溪水稻田栽培的西紅花中西紅花苷Ⅰ、Ⅱ含量的研究

戴智慧1，黃士文1,2，倪 穗1*，胡 偉3

(1.寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211；2.慈溪市橫河鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)辦公室，浙江 慈溪 315318 ；3.慈溪市橫河鎮(zhèn)童岙茶場，浙江 慈溪 315318)

摘要為了檢測栽培于浙江慈溪水稻田中的西紅花所含的西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的含量，采用高效液相色譜法，色譜條件為Intertsil ODS-SP C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(60∶40)，檢測波長440 nm，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫為室溫。結(jié)果表明：西紅花花柱中西紅花苷I的平均含量為8.85%，西紅花苷Ⅱ的平均含量為3.72%；雄蕊中西紅花苷I的平均含量為0.094%，西紅花苷Ⅱ的平均含量為0.005%；而花瓣中西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ的含量極少，未能檢出。因此，栽培于浙江慈溪水稻田中的西紅花花柱中西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ兩者含量之和為12.57%，符合2010版《中國藥典》的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可以作為藥用。

關(guān)鍵詞西紅花；西紅花苷I；西紅花苷Ⅱ；高效液相色譜法；慈溪

西紅花(CrocussativusL.)又名為番紅花、藏紅花，為鳶尾科(Iridaceae)番紅花屬(Crocus)多年生草本植物[1]。其花柱及柱頭可供藥用[1]，有活血化瘀、解郁安神、涼血解毒的功效，可用于經(jīng)閉癥瘕、產(chǎn)后瘀阻、溫毒發(fā)斑、憂郁痞悶、驚悸發(fā)狂等癥[2]。此外還有抗精神失常、治療經(jīng)前期綜合征、治療神經(jīng)退行性疾病、治療腦血管疾病、改善學(xué)習(xí)記憶障礙、治療心血管疾病等多種作用[3]。

西紅花中含有多種有效的化學(xué)成分[3-4]，在這些化學(xué)成分中，主要有效成分為西紅花總苷類化合物[5]，西紅花總苷為混合物,其中西紅花苷Ⅰ為含量較高的主成分[6]。西紅花苷作為西紅花的主要有效成分，在治療腫瘤、心血管疾病、急性炎癥、肝腎疾病等多種疾病的治療中發(fā)揮著重要的作用[6]。目前關(guān)于西紅花苷類成分含量的測定主要有分光光度法[7-8]、薄層掃描法[9]、高效液相色譜法[5,10-11]、熒光法[12]及LC/MS法[13]。

本研究以浙江慈溪水稻田栽培的西紅花為實(shí)驗(yàn)材料，采用高效液相色譜法同時(shí)測定其花朵不同部位的西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ的含量，研究結(jié)果為浙江慈溪水稻田栽培西紅花提供理論依據(jù)。

1儀器與試劑

1.1儀器

LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)：包括SPD-20A檢測器，LC-20AT泵；優(yōu)普超純水系統(tǒng)(成都超純科技有限公司)；SB-5200DTD超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；AL104電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

1.2試劑與材料

標(biāo)準(zhǔn)品：西紅花苷Ⅰ (crocin I ,HPLC≥98%)、西紅花苷Ⅱ (crocin Ⅱ，HPLC≥98%)，上海源葉生物科技有限公司

甲醇為色譜純；乙醇為分析純，水為純水。

分析所用的西紅花材料于2014年12月采自浙江省慈溪市橫河鎮(zhèn)西紅花栽培基地。將新鮮采集的西紅花的花瓣、雄蕊、柱頭分別于60 ℃條件下烘干，在4 ℃條件下避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

Inertsil ODS-SP C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(60∶40)；檢測波長440 nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；柱溫：室溫。

2.2對照品溶液的配制

精密稱取對照品西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ各10 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，用50%乙醇溶解并稀釋至刻度，分別制成0.2 mg/mL的西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ的對照品溶液，置4 ℃ 冰箱避光保存。

2.3供試品溶液的制備

取適量的干燥的西紅花花瓣、雄蕊、柱頭于研缽中研成細(xì)粉，精確稱取各個(gè)樣品粉末10 mg，每個(gè)樣品稱取3份,至50 mL棕色容量瓶中,加入50% 乙醇溶液40 mL，室溫避光條件下超聲(300 W， 40 kHz)處理30 min，用50%的乙醇定容至刻度，搖勻。溶液用0.45 μm微孔濾膜過濾至棕色樣品瓶中，置4 ℃冰箱避光保存?zhèn)浯妗?/p>

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系的考察

取上述西紅花苷I與西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌啡芤?，分別移取0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL置于10 mL棕色容量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，按上述色譜條件測定峰面積。以西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌窛舛葹闄M坐標(biāo)(X),峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制得標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

計(jì)算得西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ線性范圍均為4.0～64μg/mL，回歸方程及相關(guān)系數(shù)分別為Y=141 710.68X+288 850.46 (r=0.999 6)，Y=161 926.93X+364 797.33 (r=0.999 8)。結(jié)果表明，西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ峰面積與其濃度的線性關(guān)系良好。

圖1　西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.5精密度試驗(yàn)

精密吸取制備的花柱的供試品溶液，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果見表1。由表1知，西紅花苷I的色譜峰面積RSD為1.87% (n=5)，西紅花苷Ⅱ的色譜峰面積RSD為0.81% (n=5)，結(jié)果表明儀器精密度良好。

表1　精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6重復(fù)性試驗(yàn)

取西紅花花柱細(xì)粉5份，各10 mg精密稱定,按照上述供試品溶液的制備方法，平行制備5份供試品溶液，按上述色譜條件測定紅花苷I和西紅花苷Ⅱ的含量并計(jì)算其RSD值，結(jié)果見表2。由表2知西紅花苷I的平均含量為8.56%，RSD為1.79% (n=5)；西紅花苷Ⅱ的平均含量為3.64%，RSD為1.12% (n=5)。其RSD值均小于2%,表明試驗(yàn)重復(fù)性良好。

表2　重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

吸取同一供試樣品溶液，置于4 ℃避光保存，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，按上述色譜條件測定，記錄峰面積并計(jì)算RSD值，結(jié)果見表3。由表3可知西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ平均峰面積分別為2 706 541、1613795，RSD值分別為1.56%、1.87% (n=5)。表明供試品溶液在4 ℃避光保存在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表3　穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.8加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的花柱5份(西紅花苷I含量為8.85%，西紅花苷Ⅱ含量為3.72%)各5 mg，加入濃度均為0.2 mg/mL的西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌啡芤焊? mL,按上述供試品溶液的制備方法，配制成供試品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)樣，分別計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。由表4知西紅花苷I的平均回收率為99.01%，RSD為1.77% (n=5)；西紅花苷Ⅱ的平均回收率為99.65%(n=5)，RSD為0.42%。

表4　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ含量的測定

分別吸取對照品溶液以及3個(gè)不同部位的供試品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積并計(jì)算西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ的含量，連續(xù)測定3個(gè)批次，取平均值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。對照品及供試品色譜圖見圖2。

1.西紅花苷Ⅰ；2.西紅花苷Ⅱ

由表5可得，花柱中西紅花苷I的平均含量為8.85%，西紅花苷Ⅱ的平均含量為3.72%；雄蕊中西紅花苷I的平均含量為0.094%，西紅花苷Ⅱ的平均含量為0.005%；而花瓣中由于西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ的含量極少，在這次實(shí)驗(yàn)中未能測得其含量。

表5　西紅花不同部位西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ含量測定結(jié)果

注：“—”表示未檢測出。

3分析與討論

3.1高效液相色譜法可有效檢測西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ的含量

西紅花苷類成分極性大且性質(zhì)很不穩(wěn)定，會在一定程度上影響其含量的測定結(jié)果[5],而高效液相色譜法操作簡單、靈敏度高且測得結(jié)果穩(wěn)定，被廣泛的應(yīng)用于西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ含量的測定。本實(shí)驗(yàn)開始參照2010版《中國藥典》的色譜條件，以甲醇-水(45∶55)為流動(dòng)相，但出峰時(shí)間較晚并且峰形不理想。后經(jīng)調(diào)整以甲醇-水(60∶40)為流動(dòng)相，出峰時(shí)間提前，保留時(shí)間縮短(2.5～5min)，并且達(dá)到了分離的效果。

3.2浙江慈溪水稻田中的西紅花可以作為藥用

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)有效地測定出西紅花的花柱及雄蕊中的西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ的含量。其中西紅花花柱中西紅花苷的含量最高，西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ的含量分別為8.85%±0.45%和3.72%±0.11%。西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ兩者含量之和為12.57%，這符合2010版《中國藥典》規(guī)定的西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ兩者含量之和不低于10.0%[2]。因此，慈溪水稻田栽培的西紅花花柱可以用于藥用。而相比于何常明等[5]測得的西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ的含量(含量分別為17.3%和9.8%)相對較少，其原因可能是產(chǎn)地的不同。另外，由于西紅花苷的含量易受到光照、采收時(shí)間和干燥方法的影響[14]，從慈溪采得的西紅花未能及時(shí)干燥并避光保存可能是造成其西紅花苷含量較低的主要原因。

雄蕊中含有少量的西紅花苷I(平均含量為0.094%)和西紅花苷Ⅱ(平均含量為0.005%)，因此，雄蕊可以用于茶飲，有日常保健之功效?；ò曛袔缀醪缓骷t花苷成分，并且所取的花瓣樣品含量較少，未能測出西紅花苷I和西紅花苷Ⅱ。

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doi：10.3969/j.issn.1006-9690.2016.02.006

收稿日期：2015-08-11

基金項(xiàng)目:慈溪市科技局民生類科技計(jì)劃項(xiàng)目(CN2012006)；慈溪市農(nóng)業(yè)局科技項(xiàng)目(201104)；寧波市農(nóng)科教項(xiàng)目(2012NK02)—珍貴中藥材西紅花引種與栽培技術(shù)研究。

作者簡介:戴智慧(1989—),女,研究生,主要研究方向:植物生物學(xué)。E-mail:lh.huihui@163.com *通訊作者:倪穗(1965—),女,教授,主要研究方向:植物生物學(xué)。E-mail:nisui@nbu.edu.cn

中圖分類號：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-9690(2016)-02-0014-05

Content Determination of Crocin I and Crocin Ⅱ inCrocussativusL.Cultivated from Rice Paddy in Cixi, Zhejiang Province by HPLC

Dai Zhihui1, Huang Shiwen1,2, Ni Sui1,Hu Wei3

(1.School of Marine Science,Ningbo University,Ningbo 315211, China;2.Cixi Agricultural Office of Henghe, Cixi 315318,China;3.Tong’ao Tea Plantation of Henghe, Cixi 315318,China)

AbstractTo determine the content of crocin I and crocin Ⅱ in Crocus sativus L. cultivated from rice paddy in Cixi, Zhejiang Province. In this paper, the active ingredients of different parts of saffronwere detected by high performance liquid chromatography (HPLC).And Inertsil ODS-SP C18chromatographic column( 150 mm×4.6 mm，5 μm) was used. The mobile phase was methanol and water (60∶40). The detection wavelength was 440 nm，the flow rate was 1.0 mL/min,the injection volume was 20 μL and the column temperature was room temperature. The results showed that the average content of crocin I was 8.85% and the average content of crocin Ⅱ was 3.72% in style of saffron. The average content of crocin I was 0.094% and the average content of crocin Ⅱ was 0.005% in stamen of saffron. While the content of crocin I and crocin Ⅱ in petal of saffron was few, it did not be detected. The both content of crocin I and crocin Ⅱ was 12.57% in style of saffron,which met the quality of the 2010 edition of China Pharmacopoeia standard. So the saffron cultivated from rice paddy in Cixi, Zhejiang province can be used as medicine.

Key wordsCrocus sativus L. ; Crocin I ;Crocin Ⅱ ;HPLC;Cixi