陳麗麗++何玲玲++趙雅

摘要：研究了地衣芽孢桿菌W10對煙草的促生作用及對生長相關基因表達的影響，結果表明：W10能明顯增加煙草根長、株高、鮮質量；與對照相比，W10處理煙草后茉莉酸信號通路標志基因COI1和調節(jié)植物細胞生長的擴展基因NtEXP2、NtEXP6都不同程度上調表達。

關鍵詞：地衣芽孢桿菌；煙草；促生作用；促生機制

中圖分類號：S476.1；S572.04文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0152-03

芽孢桿菌（Bacillus spp.）是植物病害生物防治研究和應用較多的一類生物防治細菌，其生物防治機制主要有營養(yǎng)和空間位點競爭、產生多種抑菌物質（如脂肽類抗生素、降解胞壁酶類、細菌素、抗菌蛋白、多肽類化合物等）、溶菌作用、促進植物生長、誘導植物抗病性等方面[1-2]。地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）W10是筆者從根際篩選獲得的1株生物防治細菌，對多種植物病原真菌均有較好的抑制作用，田間防治效果與化學藥劑相當，已明確該菌株的防病機理涉及競爭定殖作用、產生抗菌蛋白和誘導植物產生抗病性[3-9]。但該菌株的促生作用尚不清楚。本研究對地衣芽孢桿菌W10在煙草上的促生作用及分子機制進行了初步研究，旨在為拓寬生物防治細菌地衣芽孢桿菌W10的應用領域奠定基礎。

1材料與方法

1.1供試煙草和菌株

供試煙草品種三生煙（Nicotiana tabacum L. “Xanthi”）種子由筆者所在實驗室提供；生物防治細菌地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）W10從番茄根際土壤中分離獲得。

1.2培養(yǎng)基

細菌培養(yǎng)基NB：5 g聚蛋白胨、3 g牛肉浸膏、1 g酵母膏、10 g蔗糖、1 L水，pH值7.0，用于W10菌株種子活化和搖瓶培養(yǎng)。水瓊脂培養(yǎng)基：15 g瓊脂、1 L水，用于煙草種子培養(yǎng)。1/2 MS培養(yǎng)基：4.42 g MS、30 g蔗糖、2 g植物凝膠、1 L水，pH值5.8，用于煙草培養(yǎng)。

1.3W10菌液制備

將活化的W10接種于150 mL NB中，28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)2 d得到培養(yǎng)菌液，用平板計數法測量濃度，調制成1億 CFU/mL，作為煙草處理菌液。

1.4煙草根長的測量

將三生煙種子在W10菌液中浸泡6 h，然后用15%次氯酸鈉溶液表面消毒10 min，無菌水漂洗3次后，呈直線均勻排列在水瓊脂培養(yǎng)基平板上，豎置于26 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（16 h/d光照）。根據平板擺放位置距離光源遠近，設3個處理，分別為：處理1，距離光源近；處理2，距離光源中等；處理3，距離光源遠。每個處理重復3次（平板），每個平板10粒煙草種子，同時設清水對照（CK）。待處理的煙草種子根長至25 mm左右時，測量各處理根長。

1.5煙草株高和鮮質量的測量

將三生煙種子于15%次氯酸鈉溶液中消毒10 min，用無菌水漂洗3次后，均勻放入1/2MS平板中，并置于26 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（光照時間16 h/d），出芽后幼苗長至高1～2 cm 時將其輕輕從培養(yǎng)基中連根拔出，用W10菌液處理 6 h，后移入含滅菌營養(yǎng)土的盆缽中，置于溫室培養(yǎng)，設清水對照。距光源遠近設3個處理，每個處理重復3次，每個重復6株煙草。待煙草幼苗三葉一心時測量株高。

上述煙草幼苗長至五葉一心時，用W10菌液澆灌煙草根部，每株10 mL，10 d后測量整株煙草的鮮質量。

1.6基因表達分析

1.6.1煙草總RNA提取和檢測W10菌液灌根處理2 d后，取煙草上部嫩葉，采用AxyPrep總RNA提取試劑盒[美國Axygen生物技術（杭州）有限公司]提取煙草葉片總RNA。用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，分光光度計檢測RNA的純度，質量符合要求后計算RNA樣品的濃度（D260 nm×稀釋倍數×40），RNA樣品于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2半定量RT-PCR分析取2 μg RNA作為模板，以Oligo（dT）15為引物，用反轉錄酶M-mLV（RNase H—）（Promega公司）合成cDNA。取適量反轉錄產物為模板，進行PCR反應。以在真核生物中高度保守并且組成性表達的EF-1α基因為內參。擬PCR擴增的基因有抗病防衛(wèi)反應調控基因NPR1[10]，茉莉酸（jasmonic acid，JA）信號通路分子標志基因Thi2.1、COI1，調節(jié)植物細胞生長的擴展基因NtEXP2、NtEXP6[11]?；蛎Q、登錄號、上游引物/下游引物、涵蓋長度、PCR反應條件等信息見表1。

采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。

2結果與分析

2.1地衣芽孢桿菌W10對煙草根長的影響

從圖1可見，地衣芽孢桿菌W10對煙草根生長具有明顯的促進作用，其中距離光源近的處理促生作用最明顯，比對照根長增加了105.6%，距離光源較遠的處理也比對照增長36.0%。

2.2地衣芽孢桿菌W10對煙草株高的影響

由圖2可見，經地衣芽孢桿菌W10處理后，煙草株高比對照增加了41.2%～76.5%，距離光源越近，煙草株高不斷增加，但促生作用在減少。如近光源處理煙草株高達到了 12 cm，但促生作用只有41.2%；遠光源處理株高雖然只有 10 cm，但促生作用達到了76.5%。

2.3地衣芽孢桿菌W10對煙草鮮質量的影響

由圖3可知，地衣芽孢桿菌W10處理后，煙草鮮質量明顯增加，比對照增加101.9%～114.6%，且各光源距離處理間差異不明顯，這可能與煙草五葉一心期進行了1次W10菌液灌根有關，W10菌液灌根促進煙草生長，減小了不同光源距離處理間的差異。

2.4煙草中促生相關基因的表達

從圖4可以看出，地衣芽孢桿菌W10菌液處理煙草后，JA信號通路標志基因COI1以及調節(jié)植物細胞生長的擴展基因NtEXP2、NtEXP6都能不同程度地被誘導表達，其中COI1、NtEXP2呈組成性本底表達（對照），W10菌液誘導后表達量略有上升。W10菌液處理的煙草中NtEXP6基因表達微弱，但對照檢測不到該基因的表達。多次PCR分析并未發(fā)現抗病防衛(wèi)反應調控基因NPR1、JA信號通路標志基因Thi2.1的表達。

3結論與討論

目前芽孢桿菌對植物促生作用的報道集中在枯草芽孢桿菌（B. subtilis）[12-15]、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）[16-18]、蠟狀芽孢桿菌（B. cereus）[19-20]、巨大芽孢桿菌（B. megaterium）[21-22]，涉及蔬菜、果樹、小麥、煙草等植物。

而地衣芽孢桿菌的促生作用及機制研究未見報道。本研究發(fā)現，地衣芽孢桿菌W10對煙草根長、株高、鮮質量都有明顯的促生作用，同時也發(fā)現距離光源距離對煙草生長也有一定影響，一般距離光源近的處理生長量較大，這可能是由于近光源位置光照度和溫度都較高，有利于煙草植株的發(fā)育和生長，與光、溫度等環(huán)境因子影響植物內源茉莉酸信號的變化[23]有關。本研究中有關根長、株高試驗中，只進行了1次W10菌液處理，誘導強度較小，對煙草的促生作用小，從而導致個別處理和對照間差異不顯著；而鮮質量試驗進行了2次誘導處理，誘導強度較大，對煙草的促生作用也大，所有誘導處理和對照間差異均達到顯著水平。因此，地衣芽孢桿菌W10須要多次誘導處理才會具有較好的植物促生作用。

JA和水楊酸（salicylate，SA）信號轉導途徑之間主要模式是拮抗作用，NPR1是SA信號途徑中抗病防衛(wèi)反應的正調控基因，在許多病原菌防衛(wèi)基因的調控中起重要作用，它通過SA信號轉導途徑來抑制JA信號轉導，是JA信號途徑的負調控基因[24]，本研究中W10處理煙草后未能檢測到NPR1基因的表達與此相吻合，說明W10引發(fā)的促生作用涉及JA信號途徑。JA信號通路調節(jié)植物生長發(fā)育和對脅迫的響應[25]，COI1基因是JA信號途徑中1個關鍵調控基因，目前為止是所有依賴JA信號響應所必需的[26]。本研究發(fā)現，COI1經W10誘導處理后表達有所增加，說明促生作用與JA信號通路有關。Thi2.1基因常被作為檢測JA信號通路應答的標記基因[27]，但本研究未能檢測到該基因的表達，這可能與該基因的表達水平低以及W10菌液誘導強度不夠有關，也可能是該基因表達與抗性需要病原生物脅迫，還須進一步研究。

調節(jié)植物細胞生長的擴展基因NtEXP2、NtEXP6在枯草芽孢桿菌G1處理煙草1～3 d后能被誘導顯著表達，且NtEXP2基因呈組成性表達[11]，這與本研究結果基本一致，但本研究中這2個基因誘導表達較弱，可能是地衣芽孢桿菌W10誘導處理次數較少的緣故，或許W10誘導的促生作用還可能由其他生長相關基因控制，這還須進一步研究。JA信號通路標志基因COI1、調節(jié)植物細胞生長的擴展基因NtEXP2、NtEXP6都不同程度地被地衣芽孢桿菌W10誘導表達，為地衣芽孢桿菌W10的促生作用提供了理論依據，也拓寬了這類生物防治菌的應用領域。

參考文獻：

[1]Compant S，Duffy B，Nowak J，et al. Use of plant growth-promoting bacteria for biocontrol of plant diseases：principles，mechanisms of action，and future prospects[J]. Applied and Environmental Microbiology，2005，71（9）：4951-4959.

[2]陳志誼，劉永峰，劉郵洲，等. 植物病害生防芽孢桿菌研究進展[J]. 江蘇農業(yè)學報，2012，28（5）：999-1006.

[3]童蘊慧，徐敬友，陳夕軍. 灰葡萄孢拮抗細菌的篩選[J]. 中國生物防治，2000，16（3）：123-126.

[4]唐麗娟，紀兆林，徐敬友，等. 地衣芽孢桿菌W10對灰葡萄孢的抑制作用及其抗菌物質[J]. 中國生物防治，2005，21（3）：203-205.

[5]紀兆林，凌箏，張清霞，等. 地衣芽孢桿菌對蘋果輪紋病菌和炭疽病菌的抑制及其對貯藏期蘋果輪紋病的防治作用[J]. 果樹學報，2008，25（2）：209-214.

[6]童蘊慧，紀兆林，徐敬友，等. 灰葡萄孢拮抗細菌在番茄植物體表的定殖[J]. 中國生物防治，2003，19（2）：78-81.

[7]凌箏，紀兆林，張紀兵，等. 地衣芽孢桿菌W10在蘋果和柑橘果實表面的定殖[J]. 果樹學報，2009，26（6）：851-854.

[8]紀兆林，唐麗娟，張清霞，等. 地衣芽孢桿菌W10抗菌蛋白的分離純化及其理化性質研究[J]. 植物病理學報，2007，37（3）：260-264.

[9]童蘊慧，郭桂萍，徐敬友，等. 拮抗細菌對番茄植株抗灰霉病的誘導[J]. 中國生物防治，2004，20（3）：187-189.

[10]Dong H，Delaney T P，Bauer D W，et al. Harpin induces disease resistance in Arabidopsis through the systemic acquired resistance pathway mediated by salicylic acid and the NIM1 gene[J]. Plant Journal，1999，20（2）：207-215.

[11]Wang S，Wu H J，Qiao J Q，et al. Molecular mechanism of plant growth promotion and induced systemic resistance to tobacco Mosaic virus by Bacillus spp[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology，2009，19（10）：1250-1258.

[12]梁建根，張炳欣，喻景權，等. 植物根圍促生細菌（PGPR）對黃瓜生長及生理生化特性的影響[J]. 浙江大學學報：農業(yè)與生命科學版，2007，33（2）：202-206.

[13]易有金，肖浪濤，王若仲，等. 內生枯草芽孢桿菌B-001對煙草幼苗的促生作用及其生長動態(tài)[J]. 植物保護學報，2007，34（6）：619-623.

[14]劉勇，柯紹英，黃小琴，等. 枯草芽孢桿菌Bs2004菌株的防病促生效果[J]. 中國生物防治，2008，24（增刊1）：46-49.

[15]王美琴，劉慧平，韓巨才. 內生枯草芽孢桿菌Thhy1的促生與定殖力研究[J]. 中國農學通報，2011，27（16）：196-199.

[16]申莉莉，王鳳龍，錢玉梅，等. 解淀粉芽孢桿菌Ba33對煙草的促生及抗TMV作用[J]. 吉林農業(yè)大學學報，2010，32（4）：383-386.

[17]張艷群，來航線，韋小敏，等. 2株植物促生芽孢桿菌的多向篩選及鑒定[J]. 西北農業(yè)學報，2014，23（3）：193-200.

[18]趙靜，夏海波，李艷青，等. 根際促生菌YHN對番茄和茄子的促生作用研究[J]. 北方園藝，2014（4）：30-32.

[19]管珺，楊文革，王瑞榮，等. 蠟樣芽孢桿菌CMCC63305的促生、抑菌及殺蟲作用研究[J]. 安徽農業(yè)科學，2010，38（1）：228-230.

[20]秦嗣軍，張碩，周文杰，等. 根際促生細菌對東北山櫻幼苗光合特性及生長的影響[J]. 果樹學報，2014，31（增刊1）：98-102.

[21]王瑞霞，賀運春，趙廷昌，等. 馬鈴薯環(huán)腐病生防菌株P1的鑒定、防病效果及促生作用研究[J]. 植物病理學報，2010，40（1）：66-73.

[22]李祖紅，曾嶸，劉芳，等. 一株紫莖澤蘭根際細菌分離鑒定及對煙草促生作用研究[J]. 云南農業(yè)大學學報：自然科學版，2014，29（4）：602-605.

[23]李夢莎，閻秀峰. 植物的環(huán)境信號分子茉莉酸及其生物學功能[J]. 生態(tài)學報，2014，34（23）：6779-6788.

[24]Spoel S H，Koornneef A，Claessens S M，et al. NPR1 modulates cross-talk between salicylate-and jasmonate-dependent defense pathways through a novel function in the cytosol[J]. Plant Cell，2003，15（3）：760-770.

[25]朱家紅，彭世清. 茉莉酸及其信號傳導研究進展[J]. 西北植物學報，2006，26（10）：2166-2172.

[26]Xie D X，Feys B F，James S，et al. COI1：an Arabidopsis gene required for jasmonate-regulated defense and fertility[J]. Science，1998，280（5366）：1091-1094.

[27]Reymond P，Farmer E E. Jasmonate and salicylate as global signals for defense gene expression[J]. Current Opinion in Plant Biology，1998，1（5）：404-411.張文靜，肖佳冰，李佳，等. 秸稈覆蓋和保水劑對烤煙化學成分的影響[J]. 江蘇農業(yè)科學，2016，44（5）：155-157.