王太亮,王子秦

(1.河北省唐山市食品藥品檢驗(yàn)中心，河北 唐山 063000；2.上海師范大學(xué)，上海 200235)

HPLC-ELSD法測(cè)定氨糖美辛腸溶膠囊中鹽酸氨基葡萄糖及相關(guān)物質(zhì)

王太亮1Δ,王子秦2

(1.河北省唐山市食品藥品檢驗(yàn)中心，河北 唐山 063000；2.上海師范大學(xué)，上海 200235)

目的 建立高效液相色譜法-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法(high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector，HPLC-ELSD)法測(cè)定氨糖美辛腸溶膠囊中鹽酸氨基葡萄糖的含量及其有關(guān)物質(zhì)。方法 采用Inertsil C8色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈-水(70:30)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃。結(jié)果 在選定的色譜條件下, 鹽酸氨基葡萄糖進(jìn)樣量在25～312.5 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好r=0.9991(n=6)。加樣回收率為98.0%,RSD為1.3%(n=5)；鹽酸氨基葡萄糖對(duì)酸穩(wěn)定，堿、熱、光不穩(wěn)定。結(jié)論 方法準(zhǔn)確、快捷、重復(fù)性好,可用于含量的測(cè)定及其有關(guān)物質(zhì)的檢查。

鹽酸氨基葡萄糖；HPLC-ELSD；含量測(cè)定；有關(guān)物質(zhì)

鹽酸氨基葡萄糖(分子式C6H13NO5·HCl)是甲殼素降解產(chǎn)物[1]。臨床上，鹽酸氨基葡萄糖具有多種生物活性，是預(yù)防和治療骨關(guān)節(jié)炎疾病的特異性生化藥物。

目前常用的檢測(cè)方法有：紫外-可見(jiàn)分光光度法[2-3]、高效液相色譜-紫外檢測(cè)法[4-5]、柱前衍生化-高效液相色譜法[6]和高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法[7-9]。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBH07802008中鹽酸氨基葡萄糖的含量采用Elson-Morgan比色法測(cè)定，樣品處理需衍生化反應(yīng)，操作繁瑣，且樣品溶液不穩(wěn)定，溶液顏色隨時(shí)間變化而變化，定量重復(fù)性較差。高效液相色譜-紫外檢測(cè)法所用測(cè)定波長(zhǎng)為195 nm，恰處于乙腈的末端吸收，影響測(cè)定結(jié)果。柱前衍生化-高效液相色譜法操作復(fù)雜，檢測(cè)周期長(zhǎng)，衍生化產(chǎn)物不穩(wěn)定，衍生化試劑產(chǎn)生的信噪比較大。

采用HPLC-ELSD法測(cè)定，專屬性較強(qiáng)，出峰快，縮短分析時(shí)間，降低成本，靈敏度高、準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑：氨糖美辛腸溶膠囊(葵花藥業(yè)集團(tuán)衡水得菲爾有限公司，批號(hào)：20150805、20150806、20150807、201508011、201508012、20150801、20150912及20151103)，鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院, 批號(hào): 140649-201505，供含量測(cè)定，105 ℃干燥至恒重)；乙腈為色譜純(美國(guó))。

1.1.2 儀器：Waters e2695高效液相色譜儀(美國(guó))，在線脫氣、自動(dòng)進(jìn)樣、奧泰蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國(guó))、Empower工作站，KQ-250E超聲波清洗儀(江蘇昆山)，Sartorius BP211電子天平(德國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件：色譜柱：規(guī)格型號(hào)：Inertsil C8柱(250 mm×4.6 mm , 5 μm) ；流動(dòng)相:乙腈:水(70:30);流速:1.0 mL/min；柱溫: 25 ℃；漂移管溫度90 ℃，霧化器空氣流速3.0 L/min。

1.2.2 溶液的制備

① 對(duì)照品溶液制備：精密稱取鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品12.50 mg,置100 mL容量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。濃度為0.125 mg/mL。

② 樣品溶液制備：取本品20粒，內(nèi)容物精密稱定，計(jì)算平均裝量?；靹蜓屑?xì)，取細(xì)粉適量(約相當(dāng)于鹽酸氨基葡萄糖12.5 mg)，精密稱定,置100 mL容量瓶中，加水65 mL超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)10 min，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

③ 陰性樣品溶液的制備：處方中不含鹽酸氨基葡萄糖，其余同樣品，溶液的制備按“②”項(xiàng)下樣品溶液制備。

1.2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

① 專屬性：在上述色譜條件下,將陰性對(duì)照溶液、鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品溶液、供試品溶液分別經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾后,取10 μL進(jìn)樣觀察色譜圖。

② 線性：精密量取“1.2.2①”項(xiàng)下鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣2、5、10、15、20、25 μL。峰面積(y)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，鹽酸氨基葡萄糖質(zhì)量濃度(x, μg/mL)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)作線性回歸。

③ 檢測(cè)限： 取“1.2.2①”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，加水逐步稀釋至所得到色譜圖中鹽酸氨基葡萄糖峰高為噪音的3倍，為最低檢測(cè)限。

④ 精密度：精密吸取“1.2.2①”項(xiàng)下鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品溶液10 μL進(jìn)樣 ,連續(xù)重復(fù)6次，測(cè)得峰面積。取同批樣品6份，照“1.2.2②”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，分別進(jìn)樣10 μL，計(jì)算含量。

⑤ 加樣回收：稱取陰性樣品細(xì)粉適量，共9份，分置25 mL量瓶中，分為3組，每組分別精密加入“1.2.2①”項(xiàng)下鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品溶液12、15、18 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)10 min，加水稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾后取20 μL注入液相色譜儀測(cè)定，計(jì)算回收率。

⑥ 穩(wěn)定性試驗(yàn)：在室溫下取樣品溶液于 0, 3, 6, 9, 12, 18 h分別進(jìn)樣分析。

⑦ 樣品含量測(cè)定：取5批樣品按“1.2.2②”項(xiàng)下制備并測(cè)定。

1.3 相關(guān)物質(zhì)[10-13]

1.3.1 破壞性實(shí)驗(yàn)

① 酸破壞：取“1.2.2②”項(xiàng)下細(xì)粉適量(約相當(dāng)于鹽酸氨基葡萄糖12.5 mg)，精密稱定,置100 mL容量瓶中，加水65 mL溶解，加2 mol/L鹽酸溶液1 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)10 min，用2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至中性，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。

② 堿破壞：取“1.2.2②”項(xiàng)下細(xì)粉適量(約相當(dāng)于鹽酸氨基葡萄糖12.5 mg)，精密稱定,置100 mL容量瓶中，加水65 mL溶解，加2 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)10 min，用2 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH值至中性，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。

③ 加熱破壞：取“1.2.2②”項(xiàng)下細(xì)粉適量(約相當(dāng)于鹽酸氨基葡萄糖12.5 mg)，精密稱定,置100 mL容量瓶中，加水65 mL溶解，水浴加熱15 min，放冷至室溫，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。

④ 光破壞：取“1.2.2②”項(xiàng)下細(xì)粉適量(約相當(dāng)于鹽酸氨基葡萄糖12.5 mg)，精密稱定,置100 mL容量瓶中，加水65 mL溶解，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)10 min，用強(qiáng)光(4500 LX)照射12 h以上，搖勻，濾過(guò)，即得。

1.3.2 自身對(duì)照：取“1.2.2②”項(xiàng)下細(xì)粉適量(約相當(dāng)于鹽酸氨基葡萄糖12.5 mg)，精密稱定,置100 mL容量瓶中，加水65 mL溶解，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)10 min，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，作為供試品溶液；精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，作為對(duì)照溶液。

按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件，精密量取上述溶液(經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過(guò))各10 μL，分別注入液相色譜儀。

另取樣品3批，批號(hào)：20150801、20150912、20151103，分別檢測(cè)相關(guān)物質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 專屬性：陰性圖譜中未出現(xiàn)色譜峰，樣品圖譜中鹽酸氨基葡萄糖色譜峰保留時(shí)間與對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間一致，并且與相鄰色譜峰分離度符合要求。說(shuō)明處方中其他成分對(duì)鹽酸氨基葡萄糖檢測(cè)無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

圖1 各組分色譜圖Fig.1 Chromatogram of each substance

2.1.2 線性：回歸方程為: lgy=1.846lgx+2.119，相關(guān)系數(shù)r=0.9991(n=6),表明鹽酸氨基葡萄糖在25～312.5 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.3 檢測(cè)限與精密度：鹽酸氨基葡萄糖的檢測(cè)限為2.5 μg/mL。對(duì)照品溶液連續(xù)重復(fù)6次測(cè)得峰面積，RSD為0.6%，儀器精密度良好。同批樣品6份計(jì)算含量，RSD為0.9%，重現(xiàn)性良好。

2.1.4 加樣回收：回收率結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率(n=9)

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)：結(jié)果顯示樣品溶液在0, 3, 6, 9, 12, 18 h進(jìn)樣得到的色譜圖，峰面積無(wú)明顯改變 , RSD為 0.9%，表明樣品溶液室溫放置18 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 樣品含量測(cè)定：結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 含量測(cè)定(n=5)

2.2 相關(guān)物質(zhì)檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果 酸破壞在11.5 min出現(xiàn)新的雜質(zhì)峰，但峰型小，堿破壞在0.3和9 min產(chǎn)生了較大的新的雜質(zhì)峰，加熱破壞在5.8 min出現(xiàn)較大的新的雜質(zhì)峰，強(qiáng)光破壞在0.4 min和9 min產(chǎn)生了較大的新的雜質(zhì)峰，說(shuō)明樣品對(duì)酸較穩(wěn)定，對(duì)堿、加熱、強(qiáng)光破壞不穩(wěn)定，且各破壞條件下，降解產(chǎn)物均能與鹽酸氨基葡萄糖峰呈良好分離。

另取樣品3批，批號(hào)：20150801、20150912、20151103，分別測(cè)定，均未檢出雜質(zhì)。

3 討論

流動(dòng)相：試用甲醇-水、乙腈-水流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果乙腈-水易平衡，且噪音低，比較不同配比的乙腈-水(70:30)，峰型良好，故選用乙腈-水(70:30)為流動(dòng)相。

色譜柱：流動(dòng)相確定后，比較了離子交換色譜柱、C18譜柱、C8色譜柱。離子交換色譜柱，產(chǎn)生的噪音大，基限漂移。C18和C8柱在相同色譜條件下，C8柱峰型更優(yōu)，且重復(fù)性強(qiáng)，故選用C8柱。

柱溫：Rune Slimestad[14]對(duì)柱溫進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)葡萄糖測(cè)定含量影響較大較，一般控制在20 ℃～30 ℃為宜，故選擇柱溫25 ℃。

制備樣品溶劑：用流動(dòng)相為溶劑，樣品出現(xiàn)2個(gè)成分峰，且分離度不理想。通過(guò)驗(yàn)證，后1個(gè)色譜峰為吲哚美辛峰，嘗試調(diào)整流動(dòng)相比例，始終不能分開?？疾爝胚崦佬恋娜芙庑?，水中幾乎不溶[15]，而鹽酸氨基葡萄糖易溶于水，故選用水為溶劑。

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(編校：王儼儼)

Determination of glucosamine hydrochloride and related substances in glucosamine and indometacin enteric-coated capsules by HPLC-ELSD

WANG Tai-liang1Δ, WANG Zi-qin2

(1.Tangshan Institute for Food and Drug Control, Tangshan 063000, China; 2.Shanghai Normal University, Shanghai 200235, China)

ObjectiveTo establish an high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector (HPLC-ELSD) method for determination of glucosamine hydrochloride and its related substances in glucosamine and indometacin enteric-coated capsules.MethodsSeparation was carried out on a Inertsil C8Column (250 mm×4.6 mm,5 μm) with a mobile phase composed of acetonitrile-water(70:30) at a flow rate of 1.0 mL/min and the column temperature was 25 ℃.ResultsThe linear ranges of calibration curve was 25-312.5 μg/mL(r=0.9991,n=6).The average recovery was 98.0%, and the relative standard deviation was 1.3%(n=5).The glucosamine hydrochloride was stable with acid destruction, but unstable with alkali, heat and strong light destruction.ConclusionThe method is simple, accurate and reproducible for determination of glucosamine hydrochloride and related substances.

glucosamine hydrochloride; HPLC-ELSD; content determination; related substances

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.06.59

唐山市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計(jì)劃項(xiàng)目(09130244b)

王太亮，通信作者，男，本科，副主任藥師，研究方向：藥物分析與檢驗(yàn)，E-mail：wangtailiang2006@163.com。

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