周 娜 黃 莉 董 梅 吳遠(yuǎn)菲 殷潛生 盧小娟 羅 銘 咼慶慶 李 荔

廣東省婦幼保健院生殖健康與不孕癥科(廣州，511442)

·臨床研究·

層流潔凈手術(shù)室環(huán)境對(duì)體外受精-胚胎移植結(jié)局的影響

周 娜 黃 莉 董 梅 吳遠(yuǎn)菲 殷潛生 盧小娟 羅 銘 咼慶慶 李 荔*

廣東省婦幼保健院生殖健康與不孕癥科(廣州，511442)

目的：對(duì)比本院生殖中心層流潔凈手術(shù)室改進(jìn)前后體外受精-胚胎移植結(jié)局的差異，以期為臨床工作提供理論依據(jù)。方法：層流潔凈手術(shù)室改進(jìn)前3267個(gè)生殖周期為A組，改進(jìn)后的3370個(gè)生殖周期為B組。按本中心常規(guī)輔助生殖方案進(jìn)行體外受精和胚胎移植，分析兩組的年齡、不孕年限、受精率、2PN卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率等指標(biāo)的差異。結(jié)果：A組受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率與B組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩組多胎率和流產(chǎn)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。校正年齡與不孕年限的影響后，B組受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率和多胎率仍顯著高于A組(P<0.05)，流產(chǎn)率低于A組(P<0.05)。結(jié)論：層流潔凈手術(shù)室的建立對(duì)于提高臨床妊娠結(jié)局具有重要意義，值得在生殖中心和醫(yī)院中推廣。

層流潔凈手術(shù)室；體外受精；胚胎植入

現(xiàn)代輔助生殖技術(shù)(ART)已廣泛應(yīng)用于不孕癥的治療，盡管數(shù)十年來(lái)ART技術(shù)已有了很大提高，但妊娠率仍有待提高[1]。在ART和胚胎移植(ET)過(guò)程中，除胚胎質(zhì)量、移植技術(shù)、子宮內(nèi)膜等主要因素影響外，客觀(guān)物理?xiàng)l件也對(duì)妊娠結(jié)局有影響。既往有研究發(fā)現(xiàn)外環(huán)境，如季節(jié)對(duì)胚胎種植率和妊娠率有顯著的影響，春季的妊娠成功率顯著高于夏秋季節(jié)[2]，實(shí)驗(yàn)室的微環(huán)境對(duì)胚胎質(zhì)量與著床也有重要影響。2013年5月，本院生殖中心將普通門(mén)診手術(shù)室(雅士AHU-1恒溫恒濕潔凈室內(nèi)機(jī)，ISO 7級(jí))改進(jìn)為層流潔凈手術(shù)室(德國(guó)WOLF衛(wèi)生型潔凈空氣凈化系統(tǒng)，ISO 8級(jí))。本研究對(duì)比分析手術(shù)室改進(jìn)前后，體外受精-胚胎移植胚胎質(zhì)量及其妊娠結(jié)局的差異，以期為臨床工作提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

2011年1月～2015年5月本院生殖中心共6637個(gè)體外受精-胚胎移植周期，按照手術(shù)室改進(jìn)前后的時(shí)間，分為A組和B組。其中A組為2011年1月～2013年5月共3902個(gè)周期，其中635例因故取消胚胎移植，故最終A組有3267個(gè)周期。B組為2013年6月～2015年5月共5357個(gè)周期，其中1987個(gè)周期因故取消胚胎移植，故最終B組有3370個(gè)周期。兩組共計(jì)6637個(gè)周期。取消胚胎移植的原因包括：卵巢過(guò)度刺激綜合征、胚胎質(zhì)量差、卵巢低反應(yīng)、異常受精或不受精、自然妊娠及個(gè)人原因等因素。

1.2 研究方法

1.2.1 手術(shù)室日常潔凈環(huán)境管理 研究期間均使用丹麥K-system公司生產(chǎn)的超凈工作臺(tái)，Thermo Scientific Forma CO2培養(yǎng)箱，使用美國(guó)AIM公司的HTF液、美國(guó)IS公司的10%SSS液、美國(guó)AIM公司的IVCONE液、10%SSS液作為序列培養(yǎng)基，層流潔凈手術(shù)室和胚胎培養(yǎng)室的新風(fēng)機(jī)組每日檢查一次，濾網(wǎng)定期進(jìn)行更換清洗，高效濾網(wǎng)每2年更換一次；中效濾網(wǎng)每周檢查一次，每半年更換一次；粗效濾網(wǎng)每2天清洗一次，每3個(gè)月更換一次。排風(fēng)機(jī)組的中效、高效過(guò)濾器每年更換一次。回風(fēng)口過(guò)濾器每年更換一次。每年由廣東省疾病與預(yù)防控制中心對(duì)手術(shù)室和胚胎培養(yǎng)室進(jìn)行一次全面的環(huán)境衛(wèi)生和消毒效果監(jiān)測(cè)，包括懸浮粒子、沉降菌、溫濕度、壓差、噪音、光照、換氣次數(shù)、甲醛、苯、TVOC等。科室每月定期對(duì)手術(shù)室和胚胎培養(yǎng)室進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)監(jiān)測(cè)，且胚胎培養(yǎng)室凈化系統(tǒng)一直保持為ISO 7級(jí)。生殖中心近年來(lái)無(wú)明顯人員流動(dòng)，可忽略人員技術(shù)熟練度的影響。

1.2.2 ART流程和妊娠結(jié)局評(píng)估 所有患者均行本院生殖中心的常規(guī)治療方案，包括控制性超排卵，卵子采集與孵育，體外受精顯微操作，胚胎培養(yǎng)與植入等。其中控制性超排卵采用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑黃體期方案或短方案調(diào)節(jié)與促性腺激素/人絨毛促性腺激素方案。通過(guò)陰道B超檢測(cè)卵泡發(fā)育情況，待其成熟后取卵并孵育、受精。受精后第3天觀(guān)察胚胎卵裂數(shù)，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)分級(jí)。選擇1～3個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎植入，并給予黃體支持。胚胎移植后2周測(cè)血hCG，7周后行B超檢查，見(jiàn)到孕囊即診斷為臨床妊娠。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，連續(xù)型變量(如年齡、不孕年限等)采用均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述，組間比較采用t檢驗(yàn)；分類(lèi)變量(如受精率、臨床妊娠率等)采用百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用logistic回歸和一般線(xiàn)性模型多因素分析，校正混雜因素后分析改進(jìn)層流潔凈手術(shù)室對(duì)各項(xiàng)妊娠指標(biāo)的影響。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較

A組共有3267個(gè)周期接受胚胎移植，患者年齡32.0±4.5歲，不孕年限4.7±3.4年；B組共3370個(gè)周期接受胚胎移植，患者年齡32.0±4.6歲，不孕年限4.6±3.2年。兩組年齡與不孕年限無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-0.71,P=0.475；t=1.61,P=0.1081，P>0.05)，具有可比性。

2.2 層流潔凈手術(shù)室改進(jìn)前后生育指標(biāo)的比較

比較層流潔凈手術(shù)室改進(jìn)前后的生育指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，改進(jìn)環(huán)境后(A組)的受精率(IVF)為78.5%，顯著高于改進(jìn)前(B組)66.3%；同時(shí)改進(jìn)后卵裂率、2PN卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率均顯著優(yōu)于改進(jìn)前；兩組多胎率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2.3 校正年齡與不孕年限后的各種指標(biāo)比較

既往研究發(fā)現(xiàn)年齡與不孕年限是影響體外授精妊娠成功率的影響因素。因此本次研究采用多變量logistic回歸分析控制年齡與不孕年限的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在控制了年齡與不孕年限的影響后，與改進(jìn)前相比，手術(shù)室改進(jìn)后妊娠率、多胎率和流產(chǎn)率校正后OR分別為1.61、1.15和0.64，對(duì)應(yīng)回歸系數(shù)分別為0.476、0.14和-0.446，存在邊際顯著性，說(shuō)明手術(shù)室環(huán)境的改善對(duì)于妊娠結(jié)局的影響基本獨(dú)立于孕婦的年齡及不孕年限。采用一般線(xiàn)性模型做協(xié)方差校正孕婦年齡與不孕年限的影響后發(fā)現(xiàn)，手術(shù)室環(huán)境改善后受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率均有明顯改善，見(jiàn)表2。

表1 手術(shù)室改進(jìn)前后的體外受精-胚胎種植結(jié)局比較(%)

*一般線(xiàn)性模型校正邊際估計(jì)值△校正年齡、不孕年限OR值

3 討論

本研究對(duì)比分析了升級(jí)為層流潔凈手術(shù)室前后的體外受精-胚胎種植結(jié)局指標(biāo)，以6000多個(gè)生殖周期的大樣本數(shù)據(jù)說(shuō)明改善手術(shù)室空氣質(zhì)量對(duì)于改善胚胎質(zhì)量，提升妊娠結(jié)局具有顯著作用。臨床胚胎實(shí)驗(yàn)室和手術(shù)室是體外受精-胚胎移植技術(shù)中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)IVF結(jié)局具有重要影響。良好的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境應(yīng)包括空氣質(zhì)量、溫度、培養(yǎng)液成分和pH值及光線(xiàn)等多項(xiàng)指標(biāo)，以期為胚胎提供接近生理?xiàng)l件的發(fā)育環(huán)境。而手術(shù)室環(huán)境，特別是其空氣質(zhì)量對(duì)于提高體外受精、胚胎種植成功率有著尤為重要的作用[3]。早在1993年，Johnson等[4]就已報(bào)告了實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的不穩(wěn)定性與鼠類(lèi)胚胎發(fā)育的關(guān)系。其后各種科技條件的成熟與進(jìn)步，包括使用高效分子空氣過(guò)濾、化學(xué)氣體過(guò)濾等方法，都促進(jìn)了胚胎種植實(shí)驗(yàn)室與手術(shù)室條件的穩(wěn)定改善。Voorhis等[5]于2010年報(bào)道了美國(guó)70%的高效輔助生殖中心均使用層流潔凈手術(shù)室，這一結(jié)果極大促進(jìn)了該技術(shù)在全球范圍的發(fā)展與推廣應(yīng)用。本生殖中心2013年6月以前采用的是雅士AHU-1恒溫恒濕潔凈室內(nèi)機(jī)，僅能過(guò)濾塵埃和細(xì)菌，無(wú)法凈化室內(nèi)有害物質(zhì)。改進(jìn)后的凈化系統(tǒng)為德國(guó)WOLF衛(wèi)生型潔凈空氣凈化系統(tǒng)，其QUATTRO管道式UVC殺菌空氣凈化裝置可瞬間殺滅流動(dòng)空氣中霉菌、芽孢、病毒和細(xì)菌，可達(dá)99.9%以上的殺滅率；同時(shí)，新潔凈系統(tǒng)的等離子動(dòng)態(tài)殺菌除化學(xué)污染裝置-靜電吸附凈化器，能有效去除揮發(fā)性有機(jī)成份及化學(xué)污染物、消除塵粒。因?yàn)樾〉碾x子與離子團(tuán)有更多機(jī)會(huì)與空氣中的雜質(zhì)和氣體發(fā)生碰撞反應(yīng)，使較小的微粒凝結(jié)成較大的氣溶膠微粒被高中效過(guò)濾器攔截，或在重力的作用下自由落體并沉淀，由此達(dá)到去除有機(jī)揮發(fā)物、消除塵粒、凈化空氣的目的。本研究首先對(duì)比分析了改為層流潔凈手術(shù)室前后6000多個(gè)生殖周期的胚胎培養(yǎng)及妊娠結(jié)局，發(fā)現(xiàn)受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、種植率、妊娠率等各項(xiàng)指標(biāo)均有了顯著性的改善，說(shuō)明了層流潔凈手術(shù)室對(duì)輔助生殖技術(shù)的顯著影響。與本研究的結(jié)果一致，Esteves，F(xiàn)orman，Munch，Karagouga等[6-9]另外至少4項(xiàng)研究也在不同種族和地區(qū)得到了類(lèi)似的結(jié)果。

既往研究發(fā)現(xiàn)年齡與不孕年限會(huì)影響人工授精胚胎發(fā)育與妊娠結(jié)局，因此本研究通過(guò)多因素分析的方法控制了年齡與不孕年限的混雜因素影響。結(jié)果顯示受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率在校正了混雜因素的影響后，潔凈手術(shù)室環(huán)境對(duì)于指標(biāo)的改善仍然存在顯著性?xún)?yōu)勢(shì)。但是，另一方面，種植率的優(yōu)勢(shì)在校正混雜因素影響后不再顯著了，分析原因可能是年齡與不孕年限對(duì)子宮內(nèi)環(huán)境影響較大造成[10]。通過(guò)層流的方法對(duì)手術(shù)室內(nèi)的空氣進(jìn)行改造，對(duì)進(jìn)入孵箱的氣體進(jìn)行過(guò)濾可高效改善妊娠率和種植率。除手術(shù)室內(nèi)空氣質(zhì)量的改善對(duì)于提高輔助生殖技術(shù)成功率有顯著改善外，既往研究發(fā)現(xiàn)維持手術(shù)室內(nèi)穩(wěn)定的環(huán)境溫度也有重要的作用。既往有研究報(bào)道季節(jié)變化所致的溫度改變雖然沒(méi)有顯著影響妊娠率的改變，但對(duì)于胚胎質(zhì)量卻有顯著影響[11]。卵細(xì)胞在24℃的環(huán)境下會(huì)在較短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)紡錘絲變性，如果暴露時(shí)間超過(guò)4h，超過(guò)半數(shù)的染色體結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生不可逆性分解，最終對(duì)胚胎存活產(chǎn)生影響。在臨床實(shí)踐中，技術(shù)人員在打開(kāi)孵育箱進(jìn)行觀(guān)察和操作的過(guò)程中可能會(huì)引起胚胎環(huán)境的顯著變化。因此，臨床胚胎實(shí)驗(yàn)室不僅要保證良好的空氣質(zhì)量，還要保證溫度穩(wěn)定性。

綜上，本研究數(shù)據(jù)說(shuō)明改善輔助生殖手術(shù)室環(huán)境對(duì)于提高體外受精-胚胎種植妊娠率的改善作用。層流潔凈手術(shù)室的建立對(duì)于提高臨床療效具有重要意義，值得在生殖、診療機(jī)構(gòu)中推廣應(yīng)用。

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[責(zé)任編輯：董 琳]

Influence of environment of laminar flow surgery room on IVF-ET outcome

ZHOU Na, HUANG Li, DONG Mei, WU Yuanfei, YIN Qiansheng, LU Xiaojuan, LUO Ming, GUO Qingqing, LI Li*

DepartmentofReproductiveHealthandInfertility,GuangdongWomenandChildrenCareHospital,Guangdong, 511442

Objective: To compare the outcome of IVF-ET before and after improving the environment of laminar flow surgery room. Method: The data of 6637 fresh IVF/ICSI-ET cycles from 2011 to 2015 were retrospectively analyzed. The cycles were divided into group A (before improving environment, n=3267) and group B (after improving environment, n=3370). The pregnancy outcomes including age, infertility duration, fertilization rate, cleavage rate, good quality embryo rate, implantation rate, and clinical pregnancy rate were compared between the two groups. Result: The fertilization rate, cleavage rate, good quality embryo rate, implantation rate, and pregnancy rate in group B was significantly higher than those in group A (P<0.05), but the multiple pregnancy rate and abortion rate were not significantly different (P>0.05). After adjusting the effect of age and infertility duration, the rates of fertilization, cleavage, good quality embryo, implantation, clinical pregnancy and multiple pregnancy in group B were significantly higher than those in group A, while abortion rate in group B was significantly lower than that in group A (P<0.05). Conclusion: Improvement of the environment of laminar flow surgery room can significantly improve the outcomes of IVF-ET, which is worth of promotion in other assisted reproductive technology center.

Lamina flow; In vitro fertilization and embryo transfer (IVF-ET)

廣州市科技創(chuàng)新委員會(huì)項(xiàng)目(201510010290)

2015-12-07

2016-08-23

10.3969/j.issn.1004-8189. 2016.10

*通訊作者：lili-1406@163.com

*Correspondingauthor:LILi,Email:lili-1406@163.com