韓蕾 李俊林 蘇彥華

摘要：對(duì)擬南芥kea突變體表型分析的結(jié)果表明，在黑暗條件下，單個(gè)KEA缺失后下胚軸和主根伸長(zhǎng)與野生型相比沒(méi)有明顯差異，而多個(gè)KEA缺失導(dǎo)致幼苗出現(xiàn)去黃化現(xiàn)象，表現(xiàn)為下胚軸伸長(zhǎng)受到抑制，子葉完全打開(kāi)，真葉開(kāi)始出現(xiàn)，主根發(fā)育良好。qRT-PCT結(jié)果表明，呈現(xiàn)去黃化現(xiàn)象的kea多突變體內(nèi)生長(zhǎng)素合成基因[WTBX][STBX]IAA1、IAA3、IAA17[WTBZ][STBZ]的表達(dá)下調(diào)，而生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)基因[WTBX][STBX]AUX1、PIN1、PIN3、PIN7[WTBZ][STBZ]的表達(dá)沒(méi)有明顯變化。外源施加生長(zhǎng)素類(lèi)似物NAA能夠恢復(fù)kea多突變體去黃化現(xiàn)象。上述結(jié)果暗示KEA在調(diào)控?cái)M南芥光調(diào)控發(fā)育的某些方面發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：擬南芥；去黃化；生長(zhǎng)素；暗形態(tài)建成

中圖分類(lèi)號(hào)： Q945.12文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）06-0030-03

植物在光照下和黑暗中表現(xiàn)為不同的生長(zhǎng)特性；光照下萌發(fā)的幼苗表現(xiàn)為：下胚軸伸長(zhǎng)受抑制、主根伸長(zhǎng)、子葉展開(kāi)、葉綠素累積，稱(chēng)為光形態(tài)建成（photomorphogenesis）。在黑暗中，植物的生長(zhǎng)呈現(xiàn)出多種黃化特征，稱(chēng)為暗形態(tài)建成（skotomorphogenesis）[1]。黃化苗主要特點(diǎn)為迅速生長(zhǎng)和伸長(zhǎng)的下胚軸、發(fā)育遲緩的主根、閉合的子葉形成頂端彎鉤（apical hook）[2]。在自然界中，種子發(fā)芽起始于暗形態(tài)建成過(guò)程：種子萌發(fā)后，大部分營(yíng)養(yǎng)資源流向下胚軸，用于下胚軸伸長(zhǎng)而不是子葉和根系的發(fā)育，這種快速伸長(zhǎng)的方式為幼苗更早的接收光照提供了物理支持。此外，子葉通過(guò)緊閉形成頂端彎鉤以保護(hù)地上部分生組織在幼苗破土而出時(shí)免遭傷害。這一生長(zhǎng)策略能夠保證幼苗在光合作用之前種子中貯備的有限營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更有效利用[3]。

暗形態(tài)建成過(guò)程受多種植物激素如生長(zhǎng)素、脫落酸、細(xì)胞分裂素、油菜素內(nèi)酯、赤霉素和乙烯的調(diào)控[2，4-7]。生長(zhǎng)素能夠促進(jìn)多種植物器官的伸長(zhǎng)，例如：下胚軸、胚芽鞘和根，其機(jī)理早在20世紀(jì)70年代由酸生長(zhǎng)理論所解釋[8-9]。此理論表明在數(shù)分鐘內(nèi)，通過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜H+-ATPase生長(zhǎng)素促進(jìn)質(zhì)子外排，此過(guò)程降低了質(zhì)外體間pH值，促進(jìn)細(xì)胞壁松弛[10]。本研究篩選到幾個(gè)kea突變體，其暗形態(tài)過(guò)程發(fā)生改變，通過(guò)分析下胚軸、主根的表觀特征，并利用基因表達(dá)和藥理學(xué)試驗(yàn)初步研究了其去黃化特征對(duì)生長(zhǎng)素響應(yīng)的改變，以期探討KEA基因在擬南芥發(fā)育過(guò)程中的功能，為進(jìn)一步闡述擬南芥光發(fā)育的相關(guān)機(jī)制提供良好的試驗(yàn)材料。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1[JP2]植物材料擬南芥野生型Col-0，單突變體[WTBX][STBX]kea3、kea4、kea5、kea6[WTBZ][STBZ]；雙突變體[WTBX][STBX]kea4/5[WTBZ][STBZ]和[WTBX][STBX]kea4/6[WTBZ][STBZ]，多突變體體[WTBX][STBX]kea4/5/6[WTBZ][STBZ]。其中[WTBX][STBX]kea3、kea4、kea5、kea6[WTBZ][STBZ]單突變體種子從ABRC擬南芥種子資源庫(kù)購(gòu)得。雙突變體和多突變體通過(guò)雜交方法得來(lái)。[JP]

1.1.2生長(zhǎng)條件和培養(yǎng)基光照培養(yǎng)箱（MMM，Germany）的培養(yǎng)條件為：溫度23 ℃，相對(duì)濕度70%，連續(xù)黑暗培養(yǎng)。培養(yǎng)基修改自Pilot 等的配方[11]，成分包括：1 mmol/L CaSO4，2 mmol/L NH4NO3，1 mmol/L KH2PO4，1 mmol/L MgSO4，50 μmol/L NaFe-EDTA，50 μmol/L H3BO3，12 μmol/L MnCl2，1 μmol/L CuCl2，1 μmol/L ZnCl2，30 nmol/L （NH4）6Mo7O24，2.4 mmol/L MES（2-嗎啉己磺酸），10 g/L蔗糖，8 g/L瓊脂，用1 mmol/L KOH調(diào)至pH值5.7，121 ℃，100 kPa 滅菌20 min。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1擬南芥種子消毒和播種擬南芥種子，先用70%乙醇沖洗30 s，再用含有體積分?jǐn)?shù)1%次氯酸鈉和5 g/L SDS （十二烷基硫酸鈉）的消毒液沖洗，并且劇烈振蕩5 min，然后用無(wú)菌水沖洗5次，最后再加少量無(wú)菌水，4 ℃冰箱放置 48 h。播種于培養(yǎng)基，用醫(yī)用膠帶密封后豎直放置在生長(zhǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2激素處理試驗(yàn)配制10 mmol/L 生長(zhǎng)素類(lèi)似物NAA，待培養(yǎng)基滅菌冷卻至65 ℃左右，在超凈工作臺(tái)中，將NAA母液按照一定的稀釋倍數(shù)添加到培養(yǎng)基。

1.2.3下胚軸和主根長(zhǎng)測(cè)量擬南芥野生型和突變體在正常培養(yǎng)基或含有不同濃度NAA的培養(yǎng)基黑暗培養(yǎng)8 d后，以直尺為參照進(jìn)行拍照（Cannon G8），使用ImageJ軟件按照直尺比例分析下胚軸和主根長(zhǎng)。

1.2.4擬南芥RNA提取及反轉(zhuǎn)錄采用Trizol（TaKaRa）分別提取野生型和突變體總RNA，并且用DNA酶去除基因組DNA污染。取2份RNA，一份用于測(cè)定在260 nm和 280 nm 處的吸光度，通過(guò)D260 nm/D280 nm的值得出總RNA的純度，此比值介于1.8～2.2之間為佳；另一份通過(guò)變性膠檢測(cè)RNA完整性，如果28S和18S清晰無(wú)拖尾，而且亮度比值約為 2 ∶[KG-*3]1，說(shuō)明提取的總RNA無(wú)降解且完整性較高。取2 μg RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA）合成cDNA。

1.2.5實(shí)時(shí)定量熒光PCR采用熒光染料SYBR Green I （TaKaRa） 進(jìn)行分析。本研究所用引物見(jiàn)表1。定量PCR加樣量：2 × SYBR green Ⅰ Premix 10 μL，PrimerF （10 μmol/L） 0.4 μL，PrimerR （10 μmol/L）0.4 μL，cDNA模板（稀釋4倍）2.5 μL，去離子水補(bǔ)充至20 μL。PCR程序如下：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，45個(gè)循環(huán)；熔解曲線從 65 ℃ 到95 ℃，每0.5 ℃進(jìn)行記錄；最后16 ℃。PCR結(jié)束后先分析熔解曲線，每對(duì)引物的溶解曲線一致，說(shuō)明該P(yáng)CR特異，數(shù)據(jù)可信。另外分析擴(kuò)增曲線，我們用Actin2為內(nèi)參，以2-ΔΔCT相對(duì)定量的方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。cDNA模板的CT值基本保證在15～30之間，超出此范圍，數(shù)據(jù)不可信。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，一般稀釋4倍。

1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與作圖所得統(tǒng)計(jì)結(jié)果用Microsoft Excel軟件進(jìn)行計(jì)量，用Sigmaplot 10.0軟件進(jìn)行計(jì)算和作圖。

2結(jié)果與分析

2.1KEA多突變體黃化苗出現(xiàn)去黃化現(xiàn)象

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在黑暗條件下生長(zhǎng)5 d，與野生型（WT）相比，KEA單突變體的下胚軸長(zhǎng)度略長(zhǎng)或者沒(méi)有差別（圖1-A）；而KEA多突變體，除了[WTBX][STBX]kea4/5[WTBZ][STBZ]外，[WTBX][STBX]kea4/6[WTBZ][STBZ]和[WTBX][STBX]kea4/5/6[WTBZ][STBZ]與單突變體或野生型相比，下胚軸長(zhǎng)度較小，主根較長(zhǎng)，特別是[WTBX][STBX]kea4/5/6[WTBZ][STBZ]，其下胚軸長(zhǎng)度比野生型減小了2/3（圖1-B、圖1-C）。另外還發(fā)現(xiàn)，除了[WTBX][STBX]kea4/5[WTBZ][STBZ]，大多數(shù)多突變體[WTBX][STBX]kea4/6[WTBZ][STBZ]和[WTBX][STBX]kea4/5/6[WTBZ][STBZ]子葉已經(jīng)完全展開(kāi)，而野生型和單突變體子葉還處于彎鉤（hook）狀態(tài)（圖1-B）。

為了更進(jìn)一步了解多突變體黃化苗發(fā)育狀況，連續(xù)測(cè)量黃化苗在生長(zhǎng)3 d至8 d的生長(zhǎng)情況。如圖2-A、圖2-B所示，從生長(zhǎng)4 d開(kāi)始，多突變體就開(kāi)始表現(xiàn)為根伸長(zhǎng)量增加而下胚軸伸長(zhǎng)量減少。具體到生長(zhǎng)8 d時(shí)，野生型和雙突變[WTBX][STBX]kea4/5[WTBZ][STBZ]表現(xiàn)為典型的黃化現(xiàn)象（etiolated），即較長(zhǎng)的下胚軸，較短的主根；而多突變體則表現(xiàn)出明顯的去黃化現(xiàn)象（de-etiolated），除了主根和下胚軸外，子葉完全展開(kāi)，真葉開(kāi)始冒出，呈現(xiàn)出類(lèi)似于光照下的表型（圖2-C）。

2.2kea突變體內(nèi)生長(zhǎng)素合成基因表達(dá)下調(diào)

通過(guò)定量PCR，發(fā)現(xiàn)突變體內(nèi)生長(zhǎng)素合成相關(guān)基因下調(diào)，如[WTBX][STBX]IAA1、IAA3、IAA17[WTBZ][STBZ]，而生長(zhǎng)素運(yùn)輸基因[WTBX][STBX]AUX1[WTBZ][STBZ]或PIN等表達(dá)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯變化（圖3），因此推斷，突變體的去黃化表型可能是與生長(zhǎng)素的合成有關(guān)，而與生長(zhǎng)素運(yùn)輸關(guān)系不大。

2.3生長(zhǎng)素類(lèi)似物NAA能夠恢復(fù)kea突變體去黃化現(xiàn)象

為了驗(yàn)證kea突變體去黃化現(xiàn)象是否與生長(zhǎng)素合成有關(guān)，向培養(yǎng)基添加一系列濃度 （0.01、0.1、1 μmol/L） 生長(zhǎng)素類(lèi)似物萘乙酸NAA，如圖4所示，黑暗條件下，低濃度NAA （0.01、0.1 μmol/L）對(duì)野生型和突變體[WTBX][STBX]kea4/5[WTBZ][STBZ]下胚軸生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的抑制作用，當(dāng)NAA濃度達(dá)到1 μmol/L時(shí)，其下胚軸生長(zhǎng)明顯受到抑制，抑制率約為17%、21%。[JP2]而對(duì)于突變體[WTBX][STBX]kea4/6[WTBZ][STBZ]和[WTBX][STBX]kea4/5/6[WTBZ][STBZ]，NAA對(duì)其下胚軸生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用，[JP]

[FK（W30][TPHL4.tif；S+1mm][FK）]

特別是對(duì)[WTBX][STBX]kea4/5/6[WTBZ][STBZ]，1 μmol/L NAA使其下胚軸伸長(zhǎng)增加約82%。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，NAA（0.01、0.1 μmol/L）對(duì)野生型和突變體根系都有明顯抑制作用，尤其是當(dāng)濃度達(dá)到 1 μmol/L，所試株系的主根伸長(zhǎng)均被抑制。

總之，NAA處理后，去黃化突變體[WTBX][STBX]kea4/6[WTBZ][STBZ]和[WTBX][STBX]kea4/5/6[WTBZ][STBZ]恢復(fù)或部分恢復(fù)黃化苗特征：較長(zhǎng)的下胚軸，較短的主根，子葉保持彎鉤狀態(tài)或部分展開(kāi)。

3討論

在正常生長(zhǎng)條件下，不同于單突變，kea多突變體[WTBX][STBX]kea4/6[WTBZ][STBZ]和[WTBX][STBX]kea4/5/6[WTBZ][STBZ]呈現(xiàn)出明顯的發(fā)育表型：下胚軸較短，主根較長(zhǎng)，彎鉤消失，子葉完全展開(kāi)，真葉開(kāi)始出現(xiàn)，這說(shuō)明KEA基因在控制擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育的某些方面發(fā)揮重要作用。同樣作為雙突變體，[WTBX][STBX]kea4/5[WTBZ][STBZ]的表型明顯不同于[WTBX][STBX]kea4/6[WTBZ][STBZ]，這可能是由于[WTBX][STBX]KEA4[WTBZ][STBZ]和[WTBX][STBX]KEA5[WTBZ][STBZ]之間存在功能冗余。生長(zhǎng)素在植物地上部和根系發(fā)育過(guò)程起著重要的調(diào)控作用，kea多突變體內(nèi)生長(zhǎng)素合成基因表達(dá)變化，暗示KEA基因突變可能影響了擬南芥體內(nèi)的生長(zhǎng)素相關(guān)路徑。外源添加一定濃度的生長(zhǎng)素類(lèi)似物NAA，kea多突變體下胚軸長(zhǎng)度能夠恢復(fù)到野生型的水平。生長(zhǎng)素也促進(jìn)植物根系的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)素促進(jìn)根系生長(zhǎng)的最適濃度比促進(jìn)下胚軸生長(zhǎng)的最適濃度要低，稍高濃度的生長(zhǎng)素就會(huì)抑制根系的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。在本研究所使用的NAA濃度下，野生型和突變體主根均被抑制。此外，黑暗條件下萌發(fā)的幼苗，頂端彎鉤的作用在于，降低其地上部頂端分生組織在沖破泥土接收光照過(guò)程中所受的傷害[13]。如果在地上部沖破泥土前彎鉤過(guò)早打開(kāi)，其子葉和分生組織會(huì)遭到破壞；此外，黑暗條件下，下胚軸快速生長(zhǎng)能夠加速地上部沖破泥土的進(jìn)程。以上結(jié)果顯示，KEA參與了擬南芥暗形態(tài)建成過(guò)程。[JP]

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