熊宏++陳海濤++宋健++余進德++丁勇

摘要：分離克隆麻風樹油質蛋白基因家族成員JcOle16.6基因的DNA序列（GenBank序列號為JX073622.1）。JcOle16.6基因全長601 bp，沒有內含子，轉錄的JcOle16.6 mRNA具有468 bp的完整開放閱讀框，編碼含155個氨基酸殘基、分子量為16.6 ku、等電點為9.99的JcOle16.6蛋白（GenBank序列號為AFP19884），屬于植物油體結合蛋白油質蛋白家族的新成員。JcOle16.6屬于穩(wěn)定的兩性蛋白質，具有3個結構域，即N端約30個氨基酸殘基組成的含1個α-螺旋的親水性結構域，肽鏈中間約78個氨基酸殘基組成的含3個α-螺旋的高度疏水性跨膜結構域，C端約47個氨基酸組成的含1個α-螺旋的兩親性結構域。N端親水性結構域和C端兩親性結構域分布于油體朝向胞漿一面，中間疏水跨膜結構域分布于油體半單位膜內，存在于中間疏水跨膜結構域中的由3個脯氨酸和1個絲氨酸組成的Pro-Knot高度保守結構域在JcOle16.6蛋白與油體半單位膜準確定位和穩(wěn)定維持油體結構方面起著重要作用。研究結果為JcOle16.6基因表達調控和生理功能等研究奠定了基礎。

關鍵詞：麻風樹；種子；油體；油質蛋白；基因克??；序列分析

中圖分類號： Q785文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0084-06

收稿日期：2015-10-28

基金項目：國家自然科學基金（編號：31460076）；云南省高校優(yōu)勢特色重點學科建設項目（編號：50097505）；云南省高校林下生物資源保護及利用科技創(chuàng)新團隊項目。

作者簡介：熊宏（1994—），男，江西宜春人，碩士研究生，研究方向為代謝途徑與分子生物學。E-mail：1570530221@qq.com。

通信作者：丁勇，高級實驗師，碩士生導師，研究方向為分子生物學。E-mail：dingyong@swfu.edu.cn?？勺鳛楝F(xiàn)代生物質能源的植物油廣泛存在于植物種子中[1-2]，植物油是植物種子最有效的能量儲備形式，其主要以三酰甘油（triglycerides，TAGs）液態(tài)基質形式存在于植物亞細胞器顆粒-油體中，可為隨后的代謝過程和其他生命活動提供能量和碳水化合物[3-4]。研究認為，TAGs位于油體內部，油體外部為由磷脂單分子層（phospholipids，PL）和油體結合蛋白組成的半單位膜結構[5]。油體結合蛋白包括大量的油質蛋白和微量的油體鈣蛋白、油體固醇蛋白Steroleosin-A和Steroleosin-B[6-9]。研究推測油質蛋白作為最豐富的油體結合蛋白在油體的發(fā)生到分解消失過程中起著重要的生物學功能[1，10-11]。目前在油桐（Verniciafordii）[12]、油菜（Brassica campestris）[13-16]、芝麻（Sesamumindicum）[17-18]和擬南芥（Arabidopsis thaliana）[19]等物種中油質蛋白基因已被克隆，其生物學功能也得到了一定研究，同時發(fā)現(xiàn)在各物種中油質蛋白以多個異構體蛋白形式存在。

麻風樹（Jatropha curcas L.）別稱小桐子或膏桐，是大戟科（Euphorbiaceae）多年生落葉灌木或小喬木，其果實采摘期長達50年，種仁的含油率高達60%～70%[20-21]，麻風樹已經作為生物質能源植物得到了一定的開發(fā)與利用[22-24]。研究麻風樹油質蛋白及其基因將有助于揭示麻風樹種子油體形成與穩(wěn)定機制，并可為麻風樹種子在新型生物能源及植物生物反應器方面深入開發(fā)與利用提供理論依據。本研究從 GenBank 數據庫中搜索得到已知登錄的麻風樹油質蛋白家族基因mRNA全長序列（GenBank序列號為EU234462.2、EU234463.2、EU234464.2），但有關麻風樹油質蛋白基因DNA序列克隆和序列分析的相關報道還未發(fā)現(xiàn)。筆者所在課題組根據EU234464.2序列設計特異性引物，克隆了麻風樹油質蛋白家族基因JcOle14.3在染色體上的DNA序列（GenBank序列號為JX073623.1）。本研究根據EU234463.2序列設計特異性引物，克隆麻風樹油質蛋白家族基因JcOle16.6在染色體上的DNA序列（GenBank序列號為JX073622.1），并對該基因序列及其推測編碼的JcOle16.6蛋白進行生物信息學分析。

1材料與方法

1.1材料與試劑

試驗材料為三年生麻風樹植株，取其未成熟種子和幼葉于液氮中速凍后置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

植物總RNA提取試劑盒（RNAiso Plus）、M-MLV反轉錄試劑盒和pMD18-T載體均為TaKaRa產品，植物基因組DNA提取試劑盒為北京天根生物技術有限公司產品，膠回收試劑盒為Omega產品，大腸桿菌DH5α為實驗室保存菌種，其他化學試劑均為生工生物工程（上海）股份有限公司產品。

1.2試驗方法

1.2.1總RNA提取與檢測麻風樹幼葉基因組DNA提取按照植物基因組DNA提取試劑盒說明書完成，麻風樹種子總RNA提取參照丁勇等方法[25]完成；DNA完整性和純度分別采用1.0%瓊脂糖凝膠糖電泳和紫外分光光度計檢測，RNA完整性和純度分別采用1.2%瓊脂糖凝膠糖電泳和紫外分光光度計檢測。

1.2.2麻風樹JcOle16.6基因克隆在已知麻風樹油質蛋白基因mRNA全長序列（GenBank序列號為EU234463.2）的ORF區(qū)外側設計引物，上游引物為JcOle16.6F：5-CTTTCTCACACTTATCATCAAC-3，下游引物為JcOle16.6R：5-TAAACCAACTCAACTACCTCAA-3，并由生工生物工程（上海）股份有限公司完成序列合成。以提取的總RNA為模板，采用反轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA，取第一鏈cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，建立25μL的RT-PCR反應體系，克隆目的基因cDNA序列，反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取2 μL DNA為模板，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，建立25 μL的PCR反應體系，克隆目的基因在染色體上的DNA序列，反應條件為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.3PCR產物檢測、回收、T/A克隆與測序應用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，目的片段回收后連接到pMD18-T載體上，將重組子轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，轉化復蘇后的菌液涂布在含有Amp、IPTG和X-Gal的LB固體培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)后隨機篩選白色菌落，將陽性克隆菌液送往生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序。

1.2.4序列的生物信息學分析生物信息學分析參照已知文獻報道的方法[15，26-27]進行，包括mRNA及推導的蛋白質氨基酸序列相似性搜索，mRNA開放閱讀框查找，蛋白理論分子量、等電點、氨基酸含量和穩(wěn)定性分析，系統(tǒng)發(fā)生樹構建，蛋白質親水/疏水性特性、跨膜結構、信號肽及功能域預測，目的蛋白二級、三級結構預測。

2結果與分析

2.1麻風樹油質蛋白JcOle16.6基因克隆

本研究以提取的總RNA和基因組DNA為模板分別進行RT-PCR和普通PCR試驗，均獲得1條位于500～750 bp區(qū)間的特異性cDNA和DNA條帶（圖1），將目的cDNA和DNA條帶進行膠回收、TA克隆和測序，結果表明，本研究克隆到的麻風樹油質蛋白基因cDNA序列長601 bp，序列與GenBank數據庫中登錄的麻風樹油質蛋白基因mRNA序列EU234463.2具有100%的相似性，本研究克隆到的麻風樹油質蛋白基因DNA序列也為601 bp，序列與601 bp的cDNA序列完全一致。根據生物信息學分析結果，本研究將該目的基因命名為麻風樹油質蛋白JcOle16.6基因，其601 bp的DNA序列登錄GenBank的序列號為JX073622。表明JcOle16.6基因只包含1個外顯子，沒有內含子。

2.2序列分析

本研究克隆獲得麻風樹JcOle16.6基因601 bp的基因組DNA序列，其轉錄的601 bp的mRNA具有完整的ORF，位于第25至第492 bp區(qū)域，第1至第24 bp區(qū)域為5′UTR，第493至第601 bp區(qū)域為3′UTR。ORF推測編碼的麻風樹油質蛋

白JcOle16.6（GenBank序列號為AFP19884）由155個氨基酸殘基組成，相對分子質量為16.6 ku，帶負電荷的氨基酸殘基（天冬氨酸+谷氨酸）為9個，帶正電荷的氨基酸殘基（精氨酸+賴氨酸）為16個，pI為9.99，推測JcOle16.6在生理條件下為堿性蛋白。除谷氨酰胺和半胱氨酸之外，JcOle16.6含有其他18種常見的氨基酸殘基，色氨酸含量最低，為0.6%，天冬氨酸、酪氨酸含量也較低，均為1.3%，亮氨酸含量最高，為12.9%，其他氨基酸含量在2.6%～10.3%之間。因其具有38.97的不穩(wěn)定系數值，推測JcOle16.6為穩(wěn)定性蛋白質。

蛋白質相似性分析結果見（圖2）顯示，麻風樹JcOle16.6含有“油質蛋白”保守結構域，屬于油質蛋白超家族蛋白之一。JcOle16.6蛋白與油桐（Vernicia fordii）的油質蛋白Ⅱ、胡楊（Populus euphratica）的油質蛋白18.2 ku-like、毛果楊（P. trichocarpa）油質蛋白家族蛋白、蓖麻（Ricinus communis）的油質蛋白1、川桑（Morus notabilis）的油質蛋白5、愛玉子（Ficus pumila var.）的油質蛋白高分子量異構體、醉蝶花（Tarenaya hassleriana）的油質蛋白 5異構體、亞麻（Linum usitatissimum）的油質蛋白高分子量異構體、胡蘿卜（Daucus carota）的脂質體膜蛋白、油茶（Camellia oleifera）的Ole Ⅳ蛋白、煙草（Nicotiana sylvestris）的油質蛋白 5-like、甜橙（Citrus sinensis）的油質蛋白 18.2 ku-like等都具有較高的相似性，E值從9×10-75～3×10-56，一致性60%～83%，相似度74%～91%（表1）。但JcOle166蛋白與該課題組克隆的另一個麻風樹油質蛋白家族基因JcOle14.3（GenBank序列號為JX073623）編碼的異構體JcOle14.3蛋白（GenBank登錄號為AFP19885）之間的相似度較低，以致分析結果未能顯示出。表明本研究克隆的JcOle16.6基因編碼的JcOle16.6蛋白屬于麻風樹油質蛋白異構體之一。

將13種不同植物的油質蛋白進行序列比對分析，結果見圖3，顯示麻風樹JcOle16.6蛋白與其他的油質蛋白在肽鏈中間序列具有較高的一致性，而在肽鏈兩端序列卻存在較大差異性。1個絲氨酸和3個脯氨酸組成的脯氨酸結（Pro-Knot）

為已知植物油質蛋白序列的標志性結構[12，28]，該保守結構域也存在于麻風樹JcOle16.6和其他參比的油質蛋白序列中。

油質蛋白進化樹分析結果見圖4，大戟科麻風樹JcOle 166和大戟科油桐油質蛋白Ⅱ（ADB03185.1）親緣關系最近，聚為一支，和大戟科蓖麻油質蛋白1（EEF40948.1）聚為一個大支；同樣來自麻風樹的JcOle14.3（AFP19885.1）和油質蛋白1-like（NP_001295613.1）聚為一支，二者與愛玉子（Ficus pumila var.）的油質蛋白高分子量異構體（ABQ57396.1）、醉蝶花（Tarenaya hassleriana）的油質蛋白5異構體（XP_010524296.1）屬于一個大分支，但與JcOle166的系統(tǒng)發(fā)育進化距離較遠。推測來自不同植物的同一種油質蛋白異構體基因具有較近的進化關系，而來自同一植物的不同油質蛋白異構體基因具有較遠的進化關系。

信號肽分析結果未發(fā)現(xiàn)可能的信號肽序列存在于JcOle16.6蛋白中，表明該蛋白為非分泌性蛋白。疏水性分析結果見圖5，顯示JcOle16.6蛋白質肽鏈在N端1～31位和C端109～155位氨基酸殘基區(qū)域都表現(xiàn)為高度親水性，而中間32～108位氨基酸殘基區(qū)域表現(xiàn)為高度疏水性，表明麻風樹JcOle16.6蛋白為兩親性蛋白質，即蛋白的兩末端區(qū)域為親水

性，中間區(qū)域為疏水性。蛋白質跨膜結構分析結果見圖6，顯示JcOle16.6蛋白在中間疏水區(qū)域存在2個潛在的跨膜螺旋結構域，第49～72位的24個氨基酸殘基形成第1個跨膜螺旋結構域，方向為從膜外到膜內螺旋；第80～101位的22個氨基酸殘基形成第二個跨膜螺旋結構域，方向為從膜內到膜外螺旋。表明麻風樹JcOle16.6蛋白質為含有2個跨膜螺旋結構域的兩親性蛋白質，中間高度疏水區(qū)域位于油體半單位膜內，N-末端和C-末端2個高度親水區(qū)域位于油體半單位膜外，即位于胞質內。

功能蛋白質分子在生物體內都會執(zhí)行特定的生命活動，其多肽鏈翻譯后通常折疊和盤曲成比較穩(wěn)定的二級結構，并進一步形成高級結構，完成活性功能域構象的構建。二級結構分析結果見圖7，顯示麻風樹JcOle16.6蛋白可能含有3種二級結構類型，分別為α-螺旋占72.26%、隨機卷曲占2387%，少量延伸鏈占3.87%。可見α-螺旋為JcOle16.6蛋白主要二級結構，約占整個肽鏈的3/4，分別位于18～22位（α1）、31～42位（α2）、45～68位（α3）、75～93位（α4）、

98～152位（α5）氨基酸殘基區(qū)域。推測JcOle16.6蛋白α-helix的形成可能與預測的2個跨膜螺旋結構域的形成及與油體半單位膜的定位結合有著密切的關系。JcOle16.6蛋白二級結構，尤其是α-螺旋結構在應用I-TASSER程序預測的高級結構（圖8）中可清晰顯示出。GO功能分類結果顯示JcOle16.6與磷脂單分子層膜的油脂儲藏體（GO：0012511）相關，并能整合到單分子層膜上（GO：0016021）。因此，根據蛋白質疏水性、跨膜結構、二級結構、高級結構和功能分析結果，推測JcOle16.6蛋白在結構上可分為3個部分：（1）N端約30個氨基酸殘基組成的親水性區(qū)域，分布于油體朝向胞漿一面，α1位于此結構域；（2）C端約47個氨基酸組成的α-螺旋兩親性結構域，也分布于油體朝向胞漿一面，α5位于此結構域；（3）肽鏈中間約78個氨基酸殘基組成的高度疏水性跨膜區(qū)域，分布于油體半單位膜內，α2、α3、α4位于此結構域，α3、α4之間存在著由3個脯氨酸和1個絲氨酸組成的Pro-Knot高度保守結構域（圖8），這與JcOle16.6蛋白向油體半單位膜的正確定位和油體結構的穩(wěn)定維持密切相關。

3結論與討論

油質蛋白是與植物油體特異性結合的主要蛋白質，在油料植物種子中普遍存在[29]，在植物種子成熟過程中油質蛋白幾乎覆蓋整個油體表面，使得油體雖以互相積壓形式充滿整個細胞但從不相互聚合，推測油質蛋白與植物油體的形成和穩(wěn)定有著密切的關系[30-32]。油質蛋白及其基因已在多種植物中得到了一定的研究[33-37]。本研究分離克隆了麻風樹油質蛋白基因家族成員JcOle16.6基因長601 bp的DNA序列（GenBank序列號為JX073622.1），JcOle16.6基因在染色體水平上沒有內含子，轉錄的JcOle16.6 mRNA具有468 bp 的完整開放閱讀框，編碼含155個氨基酸殘基、分子量為 16.6 ku 的JcOle16.6蛋白（GenBank序列號為AFP19884），屬于植物油體結合蛋白油質蛋白家族的新成員。

不同植物來源的油質蛋白在分子量上具有較大的變化。研究表明，特異性存在于植物種子中的油質蛋白分子量在 15～26 ku 之間變化[2]。本研究從麻風樹種子中分離克隆的JcOle16.6基因表達的JcOle16.6蛋白分子量也在此范圍之內，為16.6 ku，符合Anthony和Huang的分析結果。在蛋白質結構上JcOle16.6可分為3個結構區(qū)域，即N端約30個氨基酸殘基組成的含1個α-螺旋的親水性結構域，肽鏈中間約78個氨基酸殘基組成的含3個α-螺旋的高度疏水性跨膜結構域，C端約47個氨基酸組成的含1個α-螺旋的兩親性結構域。N端親水性結構域和C端兩親性結構域均分布于油體朝向胞漿一面，中間疏水跨膜結構域分布于油體半單位膜內，存在于中間疏水跨膜結構域中的由3個脯氨酸和1個絲氨酸組成的Pro-Knot高度保守結構域在JcOle16.6蛋白與油體半單位膜準確定位和穩(wěn)定維持油體結構方面起著重要作用。與相關研究關于油質蛋白結構和功能的論述[35]一致，表明油質蛋白基因在不同植物中表達的油質蛋白能形成類似的結構特性并發(fā)揮相同的生物學功能。

油質蛋白基因常以為數不多的基因家族形式存在。在裸子植物中只發(fā)現(xiàn)1種油質蛋白[36]，在已研究的被子植物中發(fā)現(xiàn)在同一植物中存在氨基酸序列和分子量大小都明顯不同的多種油質蛋白異構體[37-38]。劉玉君等對麻風樹種子油體蛋白進行電泳分析，發(fā)現(xiàn)分子量分別為20、24 ku的2種油質蛋白異構體可能存在于麻風樹種子油體中[39]。本研究從麻風樹種子中分離克隆的JcOle16.6基因產物推測為16.6 ku的油質蛋白，同時筆者從麻風樹種子中成功克隆的JcOle14.3基因產物推測為14.4 ku的油質蛋白。推測麻風樹油質蛋白基因也以基因家族形式存在，其表達產物可能以不同分子量油質蛋白異構體形式同時存在于同一油體中。

油質蛋白作為植物油體中發(fā)現(xiàn)最早、含量最豐富的油體結合蛋白被認為是需要長期貯藏的油體所必需的[40]，推測從油體的發(fā)生到分解消失過程中發(fā)揮重要的生物學功能。研究推測油質蛋白在植物種子發(fā)育及成熟過程中直接影響油體的形成、穩(wěn)定性以及大小[41]，在種子萌發(fā)、油體動員與解體過程中可作為酯酶識別并結合油體的特殊信號[42-43]。但JcOle16.6及其他異構體蛋白在麻風樹種子油體的發(fā)生到分解消失過程中的具體生物學功能還有待于進一步研究闡明。

本研究分離克隆了麻風樹油質蛋白基因家族成員JcOle16.6基因長601 bp的DNA序列（GenBank序列號為JX073622.1），JcOle16.6基因沒有內含子，轉錄的JcOle16.6 mRNA具有468 bp的完整開放閱讀框，編碼含155個氨基酸殘基、分子量為16.6 ku的JcOle16.6蛋白（GenBank序列號為AFP19884），屬于植物油體結合蛋白油質蛋白家族的新成員。JcOle16.6具有3個結構域，即N端約30個氨基酸殘基組成的含1個α-螺旋的親水性結構域，肽鏈中間約78個氨基酸殘基組成的含3個α-螺旋的高度疏水性跨膜結構域，C端約47個氨基酸組成的含1個α-螺旋的兩親性結構域。N端親水性結構域和C端兩親性結構域分布于油體朝向胞漿一面，中間疏水跨膜結構域分布于油體半單位膜內，存在于中間疏水跨膜結構域中的由3個脯氨酸和1個絲氨酸組成的Pro-Knot高度保守結構域在JcOle16.6蛋白與油體半單位膜準確定位和穩(wěn)定維持油體結構方面起著重要作用。

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