郝榮華++張曉元++劉飛++朱希強++凌沛學+王桂蘭

摘要：以綠豆為材料，采用一定濃度不同分子量的γ-聚谷氨酸對綠豆種子進行處理，研究了不同分子量的γ-聚谷氨酸對綠豆種子萌發(fā)及幼苗生長的影響。結果表明：不同分子量的γ-聚谷氨酸能夠不同程度地提高種子的發(fā)芽率，增加幼苗的株高、根長、鮮質量等生理指標，相應地，種子的淀粉酶、過氧化氫酶和過氧化物酶活性也有不同程度的提高。其中相對分子質量為120 ku的γ-聚谷氨酸處理種子的效果最好。

關鍵詞：聚谷氨酸；綠豆；相對分子質量；生理指標；酶活性

中圖分類號： S184；S522.01文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0169-03

收稿日期：2015-02-15

基金項目：山東省自主創(chuàng)新成果轉化專項（編號：2014GGZH1306）；山東省濟南市自主創(chuàng)新產業(yè)化重大專項（編號：201403009）。

作者簡介：郝榮華（1983—），女，山東泰安人，博士，助理研究員，主要從事基因工程藥物研究。Tel：（0531）81213080；E-mail：ronghua34@163.com。

通信作者：朱希強，博士，研究員，主要從事生物技術藥物研究。Tel：（0531）81213080；E-mail：xistrong@sina.com。γ-聚谷氨酸是一種水溶性的可生物降解的高分子聚合物，最早于1937年由Lvanovics等人從炭疽芽孢桿菌的莢膜中發(fā)現(xiàn)的[1]，隨后Bovarnick的研究發(fā)現(xiàn)有些芽孢桿菌屬細菌在胞外積累可以獲得γ-聚谷氨酸[2]。近年來，國內外對γ-聚谷氨酸的微生物發(fā)酵的研究也越來越多，采用不同菌株和不同發(fā)酵工藝生產的γ-聚谷氨酸分子量也會不同，其分子量大約為10～2 000 ku。 γ-聚谷氨酸是由D-谷氨酸和L-谷氨酸以α-胺基和γ-羧基之間經(jīng)酰胺鍵聚合而成，其結構式如圖1。

γ-聚谷氨酸具有極佳的成膜性、可塑性、黏結性、保濕性和可生物降解等獨特的理化和生物學特性，具有保鮮、增稠、乳化、凝膠、保濕等功效，是一種對人和環(huán)境無毒害的新型天然高分子，因此被廣泛應用于農業(yè)、化妝品、制藥等領域[3]。在醫(yī)藥領域，γ-聚谷氨酸可以作為藥物的緩釋、靶向載體及外科手術的黏膠劑、止血劑和密封劑等[4-5]，這是由于γ-聚谷氨酸作為生物降解型高分子，其降解產物能通過正常的新陳代謝或被機體吸收利用或被排出體外。在化妝品工業(yè)領域，γ-聚谷氨酸高保濕性能使得其用于提升皮膚水分的保水量，有效減少水分散失，增強皮膚彈性。另外，聚谷氨酸還可抑制體內酪氨酸酶活性，從而抑制皮膚黑色素的生成，具有皮膚美白效果[6-8]。在農業(yè)領域，γ-聚谷氨酸良好的生物可降解性和高吸水性已被開發(fā)應用于植物種子的包衣材料，增強土壤的吸水性，從而使沙漠及缺水干旱地區(qū)的綠化及固沙有了可靠的保障[9]。另外，γ-聚谷氨酸還可作為土壤的增肥劑，促進作物吸收養(yǎng)分，減少肥料使用，增加作物產量，改良作物品質，提高作物的抗病能力[10-13] 。同時，γ-聚谷氨酸在土壤中具有很強的保水性，是種子萌發(fā)的促進劑，有明顯的抗旱促苗效應，可以有效地提高作物的發(fā)芽率和種子活力[14-15] 。γ-聚谷氨酸的成膜性還可以作為保鮮劑用來延長鮮花和蔬菜的保鮮時間[16]。這些研究都充分展示了聚谷氨酸在農業(yè)應用領域的巨大潛質，使其在農業(yè)領域有著廣泛的應用前景，在農業(yè)領域將發(fā)揮更重要的作用。綜合γ-聚谷氨酸在農業(yè)領域中的應用及研究成果，γ-聚谷氨酸對植物的抗旱促苗效應已有報道，但不同分子量的γ-聚谷氨酸對植物種子的萌發(fā)及幼苗生長是否具有不同作用還未得到深入研究。本試驗采用不同分子量的γ-聚谷氨酸處理綠豆種子，研究其對綠豆種子萌發(fā)及幼苗生長的影響。

1材料和方法

1.1材料

以市售綠豆種子為試驗材料，γ-聚谷氨酸（分子量分別為10、70、120、1 200、2 000 ku），山東福瑞達生物科技有限公司生產。

1.2方法

1.2.1種子萌發(fā)試驗選擇籽粒飽滿、大小均勻一致、完好無損的綠豆種子，用γ-聚谷氨酸溶液浸種6 h，然后將種子擺放在直徑為15 cm培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿放置400粒種子，種臍向下，分別加入20 mL相應的γ-聚谷氨酸溶液，各設置3次重復。γ-聚谷氨酸質量分數(shù)設為0.02%，γ-聚谷氨酸相對分子質量分別為0、10、70、120、1 200、2 000 ku。種子在室溫（溫度為28±1 ℃）下萌發(fā)。

1.2.2指標測定種子萌發(fā)指標的計算公式如下：

發(fā)芽勢=發(fā)芽初期（前5 d）發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；

發(fā)芽率=發(fā)芽終期（前8 d）發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

種子萌發(fā)試驗結束后，從每個處理中分別隨機取10株幼苗，測量其株高、根長、地上部分鮮質量、地下部分鮮質量。種子萌發(fā)的1～2 d測定淀粉酶、過氧化氫酶及過氧化物酶活性，分別采用DNS法、愈創(chuàng)木酚法及高錳酸鉀滴定法。

1.3數(shù)據(jù)分析

測定數(shù)據(jù)均用Excel進行統(tǒng)計，用Graph Pad Prism 5.0進行數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計作圖比較。

2結果與分析

2.1不同分子量的γ-聚谷氨酸對綠豆種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

2.1.1不同分子量的γ-聚谷氨酸對綠豆種子萌發(fā)的影響由表1可知，不同分子量的γ-聚谷氨酸處理對綠豆種子萌發(fā)有明顯的差異。γ-聚谷氨酸相對分子質量為10～120 ku 時，隨著γ-聚谷氨酸相對分子質量的升高，發(fā)芽勢和發(fā)芽率逐漸提高，其中用120 ku的γ-聚谷氨酸處理綠豆種子，其發(fā)芽勢最高，達到81.85%，較對照提高了21.25百分點，發(fā)芽率達到了98.15%。 用1 200 ku的γ-聚谷氨酸處理綠豆種子，種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率均呈下降趨勢，但仍比對照略高。當γ-聚谷氨酸的相對分子質量提高至 2 000 ku 時，綠豆種子的萌發(fā)受到了抑制，發(fā)芽勢較對照減少了11.03百分點，發(fā)芽率也有所降低。由此可見，低分子量的γ-聚谷氨酸對綠豆種子的萌發(fā)起促進作用，而高分子量的γ-聚谷氨酸對綠豆種子萌發(fā)起抑制或延緩作用。

2.1.2不同分子量的γ-聚谷氨酸對綠豆幼苗生長的影響從圖2可知，10～1 200 ku的γ-聚谷氨酸處理綠豆幼苗時，主根長、株高以及鮮質量均有顯著提高，其中120 ku的 γ-聚谷氨酸處理綠豆幼苗主根最長，達到14.25 cm，相應地，120 ku的γ-聚谷氨酸處理綠豆幼苗的株高、地上部分鮮質量和地下部分鮮質量也最大，差異均達到顯著水平。這與其主根最長有很大的相關性，因為根是植物最重要的吸收水分和運輸養(yǎng)料的器官，根系的生長直接影響到幼苗的生長發(fā)育狀況。2 000 ku的γ-聚谷氨酸處理綠豆主根長、株高以及鮮質量較對照值小，相比差異不明顯。由此可見，10～1 200 ku 的γ-聚谷氨酸處理對綠豆萌發(fā)期幼苗的主根長、株高和鮮重均有不同程度的促進作用，說明低分子量的γ-聚谷氨酸處理對綠豆幼苗的地上部分和地下部分的生長發(fā)育都有很好的促進作用，而高分子量的γ-聚谷氨酸可能使幼苗生長受到抑制。

2.2不同分子量的γ-聚谷氨酸對綠豆萌發(fā)期淀粉酶、過氧化氫酶及過氧化物酶活性的影響

種子內部的一切生理生化反應都是在特定酶的催化下進行的，酶的活性高低與種子的活力密切相關。由圖3可知，10～120 ku 的γ-聚谷氨酸處理綠豆種子時，種子萌發(fā)后的淀粉酶活性、過氧化氫酶活性及過氧化物酶活性均顯著增強，與對照相比差異較顯著。而1 200 ku和2 000 ku高分子量的γ-聚谷氨酸處理綠豆種子時，種子的淀粉酶活性、過氧化氫酶活性及過氧化物酶活性均呈下降趨勢。由此可見，低分子量的γ-聚谷氨酸處理綠豆種子時，隨著γ-聚谷氨酸相對分子質量的提高，種子萌發(fā)期的淀粉酶活性、過氧化氫酶活性及過氧化物酶活性逐漸增強，其中120 ku的γ-聚谷氨酸處理，除了過氧化氫酶，其余各種酶活性達到最大，淀粉酶活性、過氧化氫酶活性及過氧化物酶活性分別是對照的2.29倍、1.41倍和1.87倍。

3結論與討論

植物種子發(fā)芽指標是反映種子活力大小的最可靠指標，也是反映種子萌發(fā)耐逆性能的最直接指標。種子在適宜條件下萌發(fā)時，淀粉酶活性隨萌發(fā)時間延長迅速提高，將胚乳中的淀粉分解成糖類供幼苗生長發(fā)育。種子的萌發(fā)狀態(tài)與淀粉酶的活性有關，酶活性越高，種子活力越高。綠豆經(jīng)γ-聚谷氨酸處理后，種子的淀粉酶活性提高，這與種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和幼苗的根長、株高及鮮質量提高具有一致性。種子活力的提高，能夠促進種子發(fā)芽，促進幼苗的生長發(fā)育，因此，γ-聚谷氨酸在種子萌發(fā)及苗期生長過程中具有重要的作用。

低分子量的γ-聚谷氨酸（10～1 200 ku）促進了綠豆萌發(fā)和幼苗的生長，而高分子量的γ-聚谷氨酸（2 000 ku）可能使種子萌發(fā)和幼苗生長處于受脅迫的狀態(tài)，這種脅迫可導致植物代謝系統(tǒng)紊亂，產生大量的活性氧，使脂質過氧化并導致細胞膜損傷，而植物為避免活性氧對膜的損害，將啟動抗氧化機制。生物體中的過氧化氫酶和過氧化物酶是活性氧的主要消除系統(tǒng)，植物體靠增加抗氧化酶的生成量來消除活性氧，保護植物細胞膜系統(tǒng)免受傷害。經(jīng)γ-聚谷氨酸處理的綠豆種子，過氧化氫酶和過氧化物酶活性明顯提高，這樣可以更有利地保護膜免受活性氧傷害，使種子在一定程度上免受自由基侵害。

在正常生理條件下，植物在代謝過程中超氧化物自由基等活性氧的產生及其消除存在一個平衡，因此植物不會累積活性氧。在低分子量（10～1 200 ku）的γ-聚谷氨酸誘導下，綠豆通過提高保護酶的活性增強植物的抗氧化能力，而高分子質量（2 000 ku）的γ-聚谷氨酸可能使種子萌發(fā)和幼苗生長處于受脅迫狀態(tài)而產生更多的活性氧，隨著活性氧的增加，超過抗氧化酶系統(tǒng)的自我清除能力，從而引起過氧化氫酶和過氧化物酶活性降低。

已有研究表明，γ-聚谷氨酸具有提高作物種子對逆境的耐受性，在以PEG-6000模擬干旱脅迫的條件下，施用外源γ-聚谷氨酸可提高小麥和黑麥草的發(fā)芽率，減緩干旱脅迫下鉀離子含量降低的速率，參與植物的滲透調節(jié)作用，從而增強植物耐旱性[14-18]。2013年，張言芳等研究表明，低溫脅迫下，γ-聚谷氨酸處理水稻種子可以提高抗氧化酶活性，降低膜脂過氧化程度，提高水稻的耐冷性[19]。2007年Jaleel等發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫條件下長春花體內聚谷氨酸激酶活性會顯著提高[20]。這些研究都表明γ-聚谷氨酸具有抗旱保水的潛力，植物體內抗氧化酶的活性直接決定了其抗逆性能的強弱。

γ-聚谷氨酸廣闊的發(fā)展前景和巨大的開發(fā)潛力使其成為2l世紀氨基酸工業(yè)的發(fā)展趨勢之一。聚谷氨酸的生物可降解性、增肥效應及抗旱促苗作用已成為農業(yè)研究和應用的熱點。我們的研究也表明，γ-聚谷氨酸能夠有效地促進綠豆種子的萌發(fā)和幼苗的生長發(fā)育。γ-聚谷氨酸溶液浸種對植物生長發(fā)育的影響可能是個長期而復雜的過程，它對植物生長發(fā)育的作用能否持續(xù)到后期，是否可以提高產量和改良品質，還有待于進一步深入研究。

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