唐蕊+張雪輝+徐立實

摘要：針對從土壤中篩選出的抑菌譜較廣的生防菌XM-10進(jìn)行了培養(yǎng)基的優(yōu)化研究，旨在為其應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)進(jìn)行生物防治藥劑的開發(fā)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。采用單因素和正交試驗相結(jié)合的方法，主要對培養(yǎng)基中的碳源、氮源和初始pH值進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：在供試的材料中，培養(yǎng)生防菌XM-10的最佳碳源是全麥粉，最佳氮源是大豆粉，最佳初始pH值是8.5，即其最優(yōu)的培養(yǎng)基配方是全麥粉30 g、大豆粉11 g、K2HPO4·3H2O 0.5 g、MgSO4 0.5 g、FeSO4 001 g、NaCl 0.5 g、水 1 000 mL，初始pH值 8.5。

關(guān)鍵詞：生防菌；培養(yǎng)基；正交試驗；碳源；氮源

中圖分類號： S476.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0215-02

收稿日期：2015-05-08

基金項目：河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究青年基金（編號：QN2014323）。

作者簡介：唐蕊（1976—），女，河北秦皇島人，碩士，教授，從事微生物教學(xué)與研究工作。E-mail：xtxytr@126.com。隨著人們環(huán)保意識的加強，對生態(tài)環(huán)境的保護(hù)日益重視，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)成為當(dāng)今農(nóng)業(yè)發(fā)展的主流，對農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量提出了更高的要求，由于植物病害的生物防治具有安全、無殘留、無污染等優(yōu)點，已成為重要的防治手段。而其中利用生防菌對植物病害進(jìn)行生物防治研究是當(dāng)前的一大熱點，并且一些抑菌效果顯著的生防菌已經(jīng)開發(fā)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。如美國用于防治大豆、麥類、棉花等作物多種病害的有4株枯草芽孢桿菌獲得環(huán)保局商品化或有限商品化生產(chǎn)應(yīng)用許可[1]；德國開發(fā)了用于防治萵苣的核盤菌菌核病的商品制劑ContansWG[2]；意大利研制了用于防治鐮刀菌屬病害的Biofox C[2]；澳大利亞開發(fā)了用于防治麥類和胡蘿卜等作物土傳病害的枯草芽孢桿菌A-13[3]；南京農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)了用來防治小麥紋枯病的“麥豐寧”[4]和用于防治白菜軟腐病的“菜豐寧”[5]，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)和云南農(nóng)業(yè)大學(xué)合作研發(fā)了對小麥、白菜、煙草等作物的土傳病害均有良好防治效果的“百抗”[6]等。本試驗針對從土壤中篩選出的抑菌譜較廣的生防菌XM-10進(jìn)行了培養(yǎng)基的優(yōu)化研究[7]，旨在為其應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)進(jìn)行生物防治藥劑的開發(fā)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

生防菌XM-10（邢臺學(xué)院微生物實驗室分離保存）。

1.2方法

1.2.1碳源的篩選以高氏1號液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別以15、20、25、30 g/L不同的單一碳源（葡萄糖、蔗糖、玉米粉和全麥粉[8]）和混合碳源[9]（葡萄糖+玉米粉、葡萄糖+全麥粉，其中葡萄糖含量設(shè)置為2 g/L）代替高氏一號液體培養(yǎng)基中的碳源（20 g/L可溶性淀粉），其他成分不變，設(shè)3個重復(fù)，在相同培養(yǎng)條件下，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)5 d后，測定菌體干質(zhì)量。

1.2.2氮源的篩選以最佳碳源為基礎(chǔ)，以硫酸銨、硝酸鈉、大豆粉和蛋白胨[8-9]代替高氏一號液體培養(yǎng)基中的氮源（硝酸鉀1.0 g/L），濃度如表1，其他成分不變，設(shè)3個重復(fù)，在相同培養(yǎng)條件下，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)5 d后，測定菌體干質(zhì)量。

表1不同氮源梯度設(shè)置

水平

梯度（g/L）

硫酸銨硝酸鈉蛋白胨大豆粉

10.50.53.03.0

21.01.05.05.0

31.51.57.07.0

42.02.09.09.0

1.2.3初始pH值采用高氏一號液體培養(yǎng)基，在其他培養(yǎng)條件不變的情況下，將培養(yǎng)液初始pH值分別調(diào)至3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，設(shè)3個重復(fù)，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)5 d后，測定菌體干質(zhì)量。

1.2.4正交試驗根據(jù)單因素試驗結(jié)果選取碳源、氮源、pH值3因素設(shè)置3個水平（表2），選擇正交表L9（34），進(jìn)行液體菌種培養(yǎng)基優(yōu)化試驗。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)5 d后，測定菌體干質(zhì)量。

2結(jié)果與分析

2.1碳源的篩選

在不同的碳源條件下，生防菌XM-10的生長狀況不同。由圖1可見，生防菌XM-10在蔗糖中生長量最低，而在全麥粉中，在不同濃度下，其菌體生長量水平均高于其他幾種碳源，由此可知全麥粉對生防菌XM-10生長最有利。由于全麥粉在圖1中菌體干質(zhì)量呈增長趨勢，為找出其最高點，增設(shè)35、40 g/L這2個梯度重復(fù)試驗，結(jié)果見圖2。從圖2可以得知生防菌XM-10在全麥粉添加量為 30 g/L 時，菌體生長量最大，為19.104 mg/mL，故30 g/L為全麥粉添加量的最佳值。

2.2氮源的篩選

在不同的氮源條件下，生防菌XM-10的生長狀況差異顯著。由圖3可知，生防菌XM-10在硫酸銨和硝酸鈉中生長量較低，且曲線比較平緩，在蛋白胨和大豆粉中，隨著濃度3～7 g/L時其生長量呈直線增長，7～9 g/L時增長趨勢不明顯，但在各濃度下，在大豆粉中的菌體生長量均高于蛋白胨，由此可知在上述幾種氮源中，大豆粉對生防菌XM-10生長最有利。由于隨著大豆粉濃度增大菌體干質(zhì)量呈增長趨勢，為找出其最高點，增設(shè)11、13 g/L重復(fù)試驗，結(jié)果見圖4。從圖4可以得知在大豆粉添加量為7～9 g/L時，菌體生長量有一定的增幅，而由9 g/L增至11g/L和13 g/L時，菌體生長量基本持平，甚至呈現(xiàn)略微下降趨勢，故得出9 g/L為大豆粉添加量的最佳值。

2.3初始pH值

在不同初始pH值條件下培養(yǎng)5 d后，測量各組菌體干質(zhì)量。由圖5可知，當(dāng)pH值為3.0～9.0時菌體生長量呈增上升趨勢，當(dāng)pH值為9.0～11.0時菌體生長量呈下降趨勢，pH 值9.0為最大值。在此基礎(chǔ)上，設(shè)置7.0、7.5、80、8.5、9.0、9.5幾種pH值（圖6），當(dāng)pH值為8.0時菌體生長量為最大，故其培養(yǎng)基初始pH值最佳為8.0。

2.4正交試驗

根據(jù)正交表L9（34），將表中各因素水平的試驗結(jié)果進(jìn)行處理分析（表3），通過計算極差的方法確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的配方。極差越大，該因子對試驗結(jié)果的影響越大，從而可以按極差的大小來決定因子的主次順序。由表3的極差分析可看出，本試驗配方因子的主次順序是全麥粉（碳源）>大豆粉（氮源）>初始pH值。通過k值對比可知，全麥粉（碳源）的k2水平最佳，為30 g/L，大豆粉（氮源）的k3水平最佳，為110 g/L，培養(yǎng)基初始pH值的k3水平最佳，為8.5。故依據(jù)上述正交試驗結(jié)果得出的最佳配方為全麥粉30 g/L、大豆粉11.0 g/L、初始pH值為8.5。

3討論

生防菌既可在植物和其根際定植生長，形成生物屏障，保護(hù)作物免受病原菌侵害，亦可修復(fù)土壤生物多樣性，成為當(dāng)今研究和開發(fā)的熱點[10]。同時應(yīng)用生防菌的活體制劑，會避免由于單一大量使用抗生素造成的諸如破壞自然界微生物的平衡、造成自然選擇壓力等弊端，應(yīng)用前景較為廣闊。通過培養(yǎng)原料的選擇和培養(yǎng)基質(zhì)的優(yōu)化，改進(jìn)發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)，可以有效降低生產(chǎn)成本，提高生物活體制劑的生產(chǎn)效率，使其具有更加

廣闊的市場前景[11]。生防菌XM-10可以抑制多種植物病原菌，具有較為廣泛的抑菌譜[7]，有希望開發(fā)成廣譜的活體制劑。但需在其田間的定殖能力、抗藥能力、菌種穩(wěn)定性等方面做進(jìn)一步的研究，為該菌株開發(fā)為安全、有效、環(huán)境友好型的生物活體制劑打下堅實的基礎(chǔ)。

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