錢(qián)文昊， 蘇儉生

1.上海市牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔修復(fù)學(xué)教研室，上海　200072 2.上海市徐匯區(qū)牙病防治所，上?！?00032

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·綜述·

納米氧化石墨烯控釋載藥體系研究現(xiàn)狀

錢(qián)文昊1,2， 蘇儉生1*

1.上海市牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔修復(fù)學(xué)教研室，上海200072 2.上海市徐匯區(qū)牙病防治所，上海200032

[摘要]納米氧化石墨烯(NGO)具有生物相容性好、抗菌、促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化等特性，有望作為一種新型的涂層材料應(yīng)用于疾病預(yù)防和治療，因此是目前研究的熱點(diǎn)之一。本文綜述了近年來(lái)NGO用于載藥及其生物安全性方面的研究進(jìn)展。

[關(guān)鍵詞]納米氧化石墨烯；涂層；載藥

石墨烯(graphene)于2004年由英國(guó)曼徹斯特大學(xué)Geim和Novoselov研究小組發(fā)現(xiàn)。石墨烯是由碳原子以sp2雜化連接的單層，厚度僅0.35 nm，是世界上最薄的新型二維納米材料。石墨烯優(yōu)異的電學(xué)、力學(xué)和熱學(xué)性質(zhì)使其成為復(fù)合材料、傳感器、能源等領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[1]。納米氧化石墨烯(nano-graphene oxide，NGO)具有大的比表面積，并且其2個(gè)基面都可用來(lái)負(fù)載藥物，可以與芳香環(huán)類(lèi)藥物通過(guò)較強(qiáng)的物理吸附作用非共價(jià)結(jié)合。NGO能運(yùn)輸多種水溶性較差的藥物，對(duì)大部分難溶性藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)具有重要意義。NGO具有生物相容性好、抗菌、促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化等特性，是目前研究的熱點(diǎn)之一。本文綜述了近年來(lái)NGO在載藥及其生物安全性方面的最新研究進(jìn)展。

1NGO的腫瘤靶向藥物傳遞潛能及抗菌效能研究

NGO通過(guò)化學(xué)方法氧化天然石墨而得到，結(jié)構(gòu)與石墨烯基本相同，僅在由碳原子構(gòu)成的二維空間無(wú)限延伸的平面上連有-OH、-COOH、-O-、C=O等含氧官能團(tuán)。這些功能性基團(tuán)賦予氧化石墨烯(graphene oxide，GO)分散性、親水性等特性，同時(shí)有利于化學(xué)功能化修飾接枝不同的化合物(或共價(jià)負(fù)載藥物)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域表現(xiàn)出很大的應(yīng)用潛力[2]。NGO具有較強(qiáng)的增強(qiáng)滯留與滲透(enhanced permeability and retention，EPR)效應(yīng)和腫瘤被動(dòng)靶向性[3]。sp2雜化碳原子使NGO具有高比表面積和大π共軛結(jié)構(gòu)，其兩面都可通過(guò)共價(jià)、非共價(jià)作用與藥物結(jié)合，因此藥物負(fù)荷量較高。此外，NGO制備簡(jiǎn)便、成本低[4]?？傊?，NGO具有多重優(yōu)勢(shì)，是腫瘤靶向藥物傳遞潛在的理想納米載體材料。

目前，GO作為納米藥物傳輸載體的研究[5-15]已經(jīng)很多。Yun等[16]通過(guò)改變連接碳鏈的長(zhǎng)度，合成一系列不同的銀納米粒子修飾石墨烯的復(fù)合材料(GO-Cx-Ag，HS-(CH2)x-SH﹦Cx，x﹦0、2、4)，見(jiàn)圖1。該研究中，透射電鏡(transmission electron microscopy，TEM)和X射線(xiàn)光電子能譜(X-ray photoelectron spectroscopy，XPS)顯示，GO-C2-Ag中銀納米粒子粒徑最小且能均勻負(fù)載在石墨烯片層表面上；抗菌試驗(yàn)表明，對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌(Salmonellatyphimurium)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)及金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，GO-C2-Ag比GO-C0-Ag和GO-C4-Ag表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗菌性能。

圖1　GO-CX-Ag合成示意圖(x﹦0、2、4)

Li等[17]設(shè)計(jì)了1種用胍基聚合物(polyhexa-

methylene guanidine hydrochloride，PHGC)和聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)共修飾GO(GO-PEG-PHGC)的簡(jiǎn)便方法(圖2)。結(jié)果顯示，GO-PEG-PHGC對(duì)大腸桿菌(Escherichiacoli)和Staphylococcusaureus均表現(xiàn)出很好的抗菌效果；同GO、GO-PEG和GO-PHGC相比，GO-PEG-PHGC具有更好的抗菌效果，提示PEG使GO-PEG-PHGC具有更好的分散性。

Huang等[18]通過(guò)在聚乳酸中添加一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的負(fù)載氧化鋅納米粒子的GO，制備出1種新型納米復(fù)合材料薄膜。該薄膜具有較強(qiáng)的機(jī)械強(qiáng)度、抗紫外線(xiàn)和抗菌性能，在光照條件下抗菌率尤其高，可達(dá)97%。Chen等[19]采用十六烷基三甲基溴化銨輔助的水熱合成法，合成由鎢酸鉍(bismuth tungstate，Bi2WO6)與GO組成的層狀納米復(fù)合材料(BWO/GO)，見(jiàn)圖3。該復(fù)合材料除了具有較強(qiáng)的吸附能力和較高的光催化性能外，在可見(jiàn)光照射條件下還表現(xiàn)極好的抗菌效果。BWO/GO受到光照時(shí)產(chǎn)生的氧自由基能有效破壞細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)使其增殖終止，從而達(dá)到抗菌效果。

圖2　GO-PEG-PHGC的合成示意圖

Zhang等[20]通過(guò)原位同時(shí)還原GO和銀離子一步法制備出銀米粒子修飾的石墨烯片層，再通過(guò)熱驅(qū)動(dòng)自組裝得到石墨烯/銀納米粒子雜化材料薄膜(RGO/AgNP hybrid film)。該薄膜具有很高的抗菌活性和生物相容性。同銀納米粒子相比，該雜化材料中銀納米粒子得到充分均勻的分散，提高了銀納米粒子同細(xì)菌接觸的有效面積，從而有效提高其抗菌能力。Qi等[21]則將還原氧化石墨烯(reduced graphene oxide，rGO)與硼摻雜金剛石(boron-doped diamond，BDD)陽(yáng)極一同用于三電極電化學(xué)氧化體系(圖4)，發(fā)現(xiàn)兩者具有很好的協(xié)同抗菌效果。其通過(guò)TEM觀(guān)測(cè)不同條件下大腸桿菌的形態(tài)后認(rèn)為，rGO片層具有萃取細(xì)菌細(xì)胞膜上磷脂使其失活進(jìn)而刺穿細(xì)胞膜的作用，而B(niǎo)DD則能在電解過(guò)程中腐蝕細(xì)菌的細(xì)胞膜，由此，兩者發(fā)揮協(xié)同抗菌作用。

He等[22]研究發(fā)現(xiàn)，GO對(duì)引起牙科疾病的病原體有很好的殺滅效果，用GO的水溶液對(duì)變形鏈球菌(Streptococcusmutans)、具核梭桿菌(Fusobacterium

nucleatum)和牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)進(jìn)行處理，結(jié)果表明，當(dāng)GO濃度高時(shí)，其殺菌效果也提高；用TEM對(duì)病原體進(jìn)行觀(guān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜GO納米片層破壞，細(xì)胞質(zhì)外泄。故其認(rèn)為在牙科臨床治療中，GO是一種非常有應(yīng)用前景的滅菌材料。Shahnawaz Khan等[23]在同1只小鼠背部皮膚同時(shí)制造3個(gè)傷口并用Staphylococcusaureus進(jìn)行感染，發(fā)現(xiàn)同時(shí)用近紅外激光熱療和GO處理的傷口愈合速度和愈合效果優(yōu)于兩者單獨(dú)應(yīng)用，說(shuō)明兩者具有良好的協(xié)同抗菌效果。

圖3　BWO/GO納米復(fù)合材料的設(shè)計(jì)

圖4　BDD-rGO抗菌機(jī)制示意圖

A：促進(jìn)大腸桿菌向rGO表面遷移；B：大腸桿菌3個(gè)死亡機(jī)制，a：電荷轉(zhuǎn)移；b：細(xì)胞膜被rGO鋒利的邊緣破壞；c：被·OH氧化

2NGO作為藥物載體的生物安全性研究

作為醫(yī)藥載體的石墨烯及其衍生物應(yīng)用于臨床的生物安全性十分關(guān)鍵[24]。目前已有大量的實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平，包括細(xì)菌、不同類(lèi)型人源細(xì)胞系(肺上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等)，對(duì)其毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，石墨烯和GO可能通過(guò)破壞細(xì)胞質(zhì)膜、產(chǎn)生超氧、誘導(dǎo)凋亡等破壞細(xì)胞。但是，研究表明，表面被PEG[5-8]、殼聚糖[9]、透明質(zhì)酸[10]等多聚物修飾、功能化的GO幾乎沒(méi)有細(xì)胞毒性。

石墨烯及其衍生物在體的內(nèi)毒性研究得到與細(xì)胞毒性分析相似的結(jié)果。用188Re標(biāo)記無(wú)修飾的NGO經(jīng)靜脈注射后主要在肺部組織長(zhǎng)時(shí)間滯留[11,25]，引起肺組織炎癥反應(yīng)[12]；但表面適當(dāng)?shù)墓δ芑?，如PEG、葡聚糖(dextran，DEX)或羧基化等可提高石墨烯的生物相容性，而消除石墨烯引起的的不良反應(yīng)[13-15,26]。例如，PEG修飾的GO在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性較好，靜脈注射后未引起小鼠明顯不良反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)和肺組織的蓄積減少；而在無(wú)靶肽段存在的情況下，腫瘤被動(dòng)靶向效果明顯增加[13]。用125I標(biāo)記的NGO-PEG和NGO-DEX經(jīng)靜脈注射后早期在肝、腎等器官短暫蓄積，隨后逐漸經(jīng)尿和大便排泄[13,15]。上述研究為NGO功能化修飾的必要性、在體內(nèi)的生物安全性研究提供了依據(jù)。然而，目前NGO及表面修飾后的衍生物與機(jī)體各系統(tǒng)之間的相互關(guān)系仍不明確，如何優(yōu)化功能化修飾并確保復(fù)合體的腫瘤靶向富集依然值得探討。

Matsumura等[27]于1986年首次報(bào)道，67Ga標(biāo)記的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在實(shí)體瘤組織具有被動(dòng)富集的EPR效應(yīng)。腫瘤細(xì)胞屬于無(wú)序生長(zhǎng)，腫瘤組織內(nèi)部非常致密，壓力也隨著深度越來(lái)越大，因此，一般的藥物傳輸系統(tǒng)只能在腫瘤表面起作用，很難深入腫瘤組織內(nèi)部發(fā)揮療效；而50～200 nm的脂質(zhì)體、高分子材料、納米粒子對(duì)腫瘤組織具有EPR效應(yīng)，可滲入到腫瘤組織內(nèi)部并聚集，具有被動(dòng)靶向性，這一原則也被作為高分子和納米藥物制劑研制的首要準(zhǔn)則[3,28]。NGO具有石墨烯的特有性質(zhì)，比如單個(gè)原子厚度、大型二維平面結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定、大小可控制(50～200 nm)，且具有較強(qiáng)的EPR效應(yīng)和腫瘤被動(dòng)靶向性[29]。

3總結(jié)和展望

當(dāng)前的NGO體系主要是通過(guò)非共價(jià)物理吸附載藥，載藥量不穩(wěn)定，在體內(nèi)的載藥穩(wěn)定性更值得探討；而在腫瘤被動(dòng)靶向性基礎(chǔ)上增加主動(dòng)靶向也應(yīng)成為NGO研究的重點(diǎn)。葉酸受體在多種細(xì)胞表面高表達(dá)，而葉酸具有病灶主動(dòng)靶向能力，能夠提高納米材料的靶向性。因此，可用葉酸對(duì)NGO進(jìn)行生物靶向基團(tuán)修飾，使其具有更強(qiáng)的靶向性。此外，通過(guò)優(yōu)化NGO的大小、PEG的接入量等條件，進(jìn)一步改善NGO體系的體內(nèi)行為，最大程度地降低在正常組織的滯留，以期為病灶靶向治療提供理想的NGO藥物載體?？傊?，石墨烯及其衍生物在納米生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景良好，但作為病灶靶向制劑載體的研究仍處于探索階段，還需要進(jìn)一步提高其生物相容性、安全性。

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[本文編輯]姬靜芳

[收稿日期]2016-01-13[接受日期]2016-05-08

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金(81371949、81572114),上海市生物醫(yī)藥科技重點(diǎn)項(xiàng)目(13411951200). Supported by the National Natural Science Foundation of China ( 81371949, 81572114) and Shanghai Scientific Technological Innovation Project (13411951200).

[作者簡(jiǎn)介]錢(qián)文昊, 博士生, 副主任醫(yī)師. E-mail: pingyanlaoto@163.com *通信作者(Corresponding author). Tel: 021-56032686, E-mail: sjs@#edu.cn。

[中圖分類(lèi)號(hào)]R 988.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

Research status of controlled release drug delivery system of nano graphene oxide

QIAN Wen-hao1,2, SU Jian-sheng1*

1. Shanghai Engineering Research Center of Tooth Restoration and Regeneration, Department of Prosthodontics, School of Stomatology, Tongji University, Shanghai200072, China 2. Shanghai Xuhui District Dental Center, Shanghai200032, China

[Abstract]Nano graphene oxide (NGO) has the characteristics of good biocompatibility, antibacterial activity, and promoting the osteogenic differentiation of stem cells. As a new type of coating material it is expected to be used in the prevention and treatment of diseases, so it is one of the hot spots in present study. This paper summarizes the latest research progress of NGO application in drug delivery and its biological safety.

[Key Words]nano graphene oxide; coating; drug delivery