杜凱麗 梁 鋼 康繼輝 米小芳 王宏坤 肖 虹 梁建芳 鄭繪霞

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RACK1對肺腺癌A549細(xì)胞生物學(xué)行為及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

杜凱麗 梁 鋼 康繼輝 米小芳 王宏坤 肖 虹 梁建芳 鄭繪霞

【摘要】目的 研究RACK1基因沉默對A549細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，探究其對VEGF、Bcl-2表達(dá)的影響。方法 轉(zhuǎn)染RACK1 shRNA至A549細(xì)胞，分別設(shè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的實驗組、陰性對照組和空白對照組。Western blot檢測各組細(xì)胞RACK1、VEGF、Bcl-2的表達(dá)，平板克隆實驗檢測各組細(xì)胞的增殖情況，劃痕愈合實驗觀察細(xì)胞運動遷移的改變，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率的變化。結(jié)果 實驗組細(xì)胞增殖能力下降，遷移能力減弱，凋亡率增高，VEGF、Bcl-2表達(dá)下調(diào)（P＜0．05）。結(jié)論 RACK1基因沉默能抑制A549細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)其凋亡，下調(diào)VEGF、Bcl-2的表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】RACK1；shRNA干擾；流式細(xì)胞術(shù)

Objective To investigate the effect of silencing RACK1 on A549 cell proliferation and VEGF，Bcl-2 expression． Methods The shRNA was transfected into A549 cells as the experiment group． The expression level of RACK1，VEGF，Bcl-2 were measured by western blot，cell proliferation was detected by plate colony forming assay． scratch healing experiment was used to detet migration capacity． Cell apoptosis was measured by flow cytometry． Results The ability of proliferation and the migration ability of the cells in the experimental group was weakened． The apoptotic rate was increased． The expression level of VEGF and Bcl-2 were decreased． Conclusion Targeting to inhibit RACK1 expression in A549 cells could inhibit proliferation and induce apoptosis，specifically decreased the expression level of VEGF and Bcl-2．

【Key words】 RACK1，ShRNA interference，F(xiàn)low cytometry

肺腺癌發(fā)病隱匿，多數(shù)患者常以轉(zhuǎn)移灶為首發(fā)癥狀，生存率極低［1］。RACK1在肺腺癌中表達(dá)增高，與患者的病理分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況有相關(guān)性［2］。本研究通過沉默肺腺癌A549細(xì)胞中RACK1的表達(dá)，觀察干擾前后細(xì)胞的生長、遷移、細(xì)胞周期及凋亡狀況，探討RACK1在肺腺癌細(xì)胞中發(fā)揮的作用及其與VEGF和Bcl-2之間可能存在的關(guān)系。

1 實驗方法

1.1 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

待細(xì)胞達(dá)到60%～70%融合時，轉(zhuǎn)染RACK1 shRNA至A549細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒作為陰性對照組，以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為空白對照組。

1.2 Western blot檢測各組細(xì)胞RACK1、VEGF、Bcl-2的表達(dá)

取轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞蛋白樣品經(jīng)1電泳分離后轉(zhuǎn)膜，封閉后一抗、二抗4℃孵育，發(fā)光顯影。目的蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值標(biāo)比后的比值為其相對蛋白表達(dá)量。

1.3 平板克隆形成實驗

將各組細(xì)胞在6 cm培養(yǎng)皿中連續(xù)靜置培養(yǎng)14 d。4%多聚甲醛固定，姬姆薩染液染色，自來水沖洗、晾干，顯微鏡下記錄克隆數(shù)。

1.4 體外遷移實驗

待細(xì)胞生長達(dá)到90%左右融合時進(jìn)行劃痕處理，于劃痕后0 h、24 h、48 h觀察拍照，劃痕愈合率（%）=（1-各時間點劃痕面積/開始的劃痕面積）×100%，愈合率反應(yīng)各組細(xì)胞的體外遷移能力。

1.5 細(xì)胞凋亡率檢測

將各組細(xì)胞用PBS液洗滌后200目篩網(wǎng)過濾，按照Annexin-V說明書滴加試劑，30 min內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

經(jīng)比較，實驗組細(xì)胞RACK1蛋白相對表達(dá)量降低（P＜0.05），增殖、遷移能力減弱，凋亡率增高，VEGF、Bcl-2表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），見表1。

表1 RACK1對A549細(xì)胞增殖、遷移、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

有學(xué)者認(rèn)為RACK1是肺腺癌特異的分子生物學(xué)標(biāo)記物［2］，其表達(dá)水平的改變可能直接影響到肺腺癌的進(jìn)展情況。我們前期研究通過分析RACKl和VEGF在肺腺癌組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白在肺腺癌的浸潤轉(zhuǎn)移過程中可能以相互協(xié)同促進(jìn)的方式發(fā)揮作用［3］。本次研究發(fā)現(xiàn)，沉默RACK1基因后A549細(xì)胞的增殖能力和遷移能力均下降，同時VEGF的表達(dá)也降低，這說明RACK1可能通過某種途徑發(fā)揮了對VEGF的調(diào)控，從而調(diào)控了肺腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。同時沉默RACK1基因后A549細(xì)胞的凋亡率增加，Bcl-2的表達(dá)降低，因此我們推測RACK1可能在Bcl-2上游發(fā)揮了一定的調(diào)控作用，通過上調(diào)Bcl-2而抑制細(xì)胞凋亡。有學(xué)者證實RACK1參與了SHH和STAT3信號通路的激活［4］，從而導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化，而VEGF、Bcl-2均為STAT3和SHH信號通路下游的靶基因，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)STAT3的激活可以誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)和活性增強［5］，在肺腺癌中STAT3的活化能增強Bcl-2的表達(dá)，從而顯示出其抗凋亡效應(yīng)［6］，有文獻(xiàn)報道SHH信號通路與VEGF的表達(dá)存在相關(guān)性［7］，Yang等［8］學(xué)者發(fā)現(xiàn)SHH過表達(dá)的肺腺癌細(xì)胞增殖能力增強且凋亡水平降低，且Bcl-2的表達(dá)水平也上調(diào)。由此我們猜測在肺腺癌中RACK1可能通過對SHH和STAT3信號通路的調(diào)控而影響了VEGF、Bcl-2的表達(dá)，但具體分子機制如何，尚待進(jìn)一步研究說明。

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The Effect of RACK1 on the Biological Behavior of Lung Adenocarcinoma Cells A549 and VEGF，Bcl-2 Expression

DU Kaili LIANG Gang KANG Jihui MI Xiaofang WANG Hongkun XIAO Hong LIANG Jianfang ZHENG Huixia Basic Medical College of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

【Abstract】

作者單位：030001 太原，山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 基金項目：山西省科技攻關(guān)項目（項目編號：20140313011-13）

通訊作者：鄭繪霞，E-mail：huixiazheng62@126．com

【中圖分類號】R361

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1674-9316（2016）05-0178-03

doi:10．3969/j．issn．1674-9316．2016．05．130