范 磊 李 誠 李 堂

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抗CD20單克隆抗體與IL-10基因聯(lián)合應(yīng)用對NOD鼠肝臟PDX-1的影響

范 磊 李 誠 李 堂

【摘要】目的 察抗CD20單克隆抗體與IL-10基因聯(lián)合應(yīng)用于已發(fā)病的NOD鼠，觀察對其肝臟中PDX-1表達(dá)的影響。方法 17-20周齡雌性發(fā)病的NOD小鼠24只，隨機(jī)分為A、抗CD20單克隆抗體組（于發(fā)病第1 d尾靜脈注射Anti-CD20 500 μg，并于第3、6、9 d尾靜脈注射Anti-CD20 250 μg）；B、抗CD20單克隆抗體+IL-10基因組（第1 d尾靜脈注射Anti-CD20 500 μg + IL-10基因0．1 ml，后相同時(shí)間尾靜脈注射Anti-CD20 250 μg + IL-10基因0．1 ml）；C、IL-10基因組（IL-10基因0．1 ml）；D生理鹽水對照組（生理鹽水0．1 ml）。發(fā)病后每周監(jiān)測2次體重；每天同一時(shí)間監(jiān)測血糖，若血糖≥25 mmol/L，按20 U/kg皮下注射來得時(shí)。觀察6周后行免疫組化檢測肝臟中PDX1蛋白相對表達(dá)量，并行PCR了解PDX-1基因表達(dá)情況。結(jié)果 聯(lián)合治療組肝臟中PDX-1基因表達(dá)及蛋白表達(dá)水平高于其他組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。結(jié)論 抗CD20單克隆抗體與IL-10基因組聯(lián)合干預(yù)可提高可促進(jìn)PDX-1的表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】抗CD20單克隆抗體；白細(xì)胞介素10；胰腺-十二指腸同源框1；肝臟；1型糖尿病

Objective To observe the influence of liver PDX-1 expression in NOD mice after interfered by anti-CD20 monoclonal antibody combined with inter-leukin10． Methods Twenty-four female NOD mice（17-20weeks old）were randomly divided into four groups：A Anti-CD20，B Anti-CD20+IL-10，C IL-10 and D Normal Control（NC）groups． The first time group A and B were respectively injected of 500 μg Anti-CD20 antibody，combined 500 μg Anti-CD20 antibody． After the 3、6、9 day，group A、B、C、D were injected of 250 μg Anti-CD20 antibody，combined 250 μg Anti-CD20 antibody，0．1 ml IL-10 and 0．1 ml physiological saline． All mice were twice weekly monitored for weight，and monitored for blood glucose at the same time everyday． After 6weeks，the local expression of PDX-1 were observed by immunohistochemistry． The gene expression of PDX-1 were observed by PCR． Results After combined Anti-CD20 and IL-10 intervention，the liver PDX1 expression was upregulated（P＜0．05）．Conclusion The combined administration of Anti-CD20 and IL-10 increased increased the expression of PDX1 in the liver．

【Key words】 Anti-CD20 antibody，Interleukin 10，PDX-1，Liver，T1DM

1型糖尿?。═1DM）是一種嚴(yán)重危害青少年健康一種自身免疫性疾病，且發(fā)病率呈上升趨勢。目前終生胰島素注射治療仍為治療的主要手段，即使胰島素制劑及用法不斷改善，仍給患兒的生活帶來很大不便，因此尋求胰島β細(xì)胞的再生，延緩胰島炎的進(jìn)程，保護(hù)殘存胰島β細(xì)胞功能，成為研究T1DM治療的熱點(diǎn)之一。目前認(rèn)為1型糖尿病病情進(jìn)展過程與Th1/Th2失衡有關(guān)［1］，且β細(xì)胞在發(fā)病過程中亦發(fā)揮著重要作用。NOD鼠因遺傳學(xué)特征和免疫學(xué)特征與人類近似被認(rèn)為是1型糖尿病的最佳實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。NOD鼠通常于4～5周開始出現(xiàn)胰島炎，并進(jìn)行性破壞，于12周齡時(shí)開始出現(xiàn)糖尿病癥狀，到30周齡時(shí)累計(jì)發(fā)病率可高達(dá)80%［2］。

在胚胎發(fā)育時(shí)期，胰腺和肝臟來源于相鄰區(qū)域的內(nèi)胚層，肝臟被認(rèn)為是產(chǎn)胰島素細(xì)胞的潛在來源［3］。其中胰腺-十二指腸同源框1（PDX-1）在胰腺的發(fā)育以及胰島素分泌過程中都扮演了重要的角色。有研究發(fā)現(xiàn)［4］利用轉(zhuǎn)分化技術(shù)，在肝實(shí)質(zhì)中表達(dá)修飾過的PDX-1基因，可使肝臟細(xì)胞分化成為具有內(nèi)分泌和外分泌活性的胰腺細(xì)胞。本課題組前期實(shí)驗(yàn)表明［5］，抗CD20單克隆抗體與IL-10聯(lián)合應(yīng)用可以減輕胰島β細(xì)胞的凋亡和損傷。由于肝臟對機(jī)體糖脂代謝起著重要作用，所以本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用抗CD20單克隆抗體與IL-10基因作用于NOD鼠觀察其對肝臟中PDX-1表達(dá)的影響。由于IL-10半衰期極短，不適合直接應(yīng)用，本課題組前期已經(jīng)成功構(gòu)建了攜帶有鼠IL-10基因的重組腺病毒載體［6］，并發(fā)現(xiàn)其感染胰島素分泌細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)可有效表達(dá)IL-10。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康雌性NOD鼠24只，17～20周齡，由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司，SPF級，飼養(yǎng)于青島大學(xué)附屬醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心，12 h明暗交替，溫度23℃左右，濕度60%左右，不限飲食。飼養(yǎng)期間每周固定時(shí)間監(jiān)測隨機(jī)血糖2次，隨機(jī)血糖連續(xù)2次＞13.9 mmol/L時(shí)，即診斷為糖尿病。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組腺病毒擴(kuò)增及滴度測定 當(dāng)80%左右的HEK293細(xì)胞（美國ATCC細(xì)胞庫）貼壁時(shí)感染腺病毒，棄細(xì)胞原培養(yǎng)液，加入2 ml培養(yǎng)液、200 μl攜有IL-10基因的重組腺病毒液，于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，倒置顯微鏡下觀察到＞80%細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光時(shí)收獲病毒液，離心棄上清，加入PBS液，反復(fù)離心、凍融后留取上清。96孔培養(yǎng)板中接種HEK293細(xì)胞，并根據(jù)腺病毒感染性滴度試劑盒（快速檢測）說明操作，測定重組腺病毒滴度。

1.2.2 分組 將24只NOD鼠經(jīng)隨機(jī)分為：A、抗CD20單克隆抗體組，B、抗CD20單克隆抗體 + IL-10基因組，C、IL-10基因組，D、NC組。第1 d，組A、B經(jīng)尾靜脈注射的抗CD20單克隆抗體首次計(jì)量加倍為500 μg，后分別于第3、6、9 d尾靜脈給予抗CD20單克隆抗體250 μg、抗CD20單克隆抗體250 μg + IL-10基因0.1 ml，IL-10基因0.1 ml、生理鹽水0.1 ml，抗CD20單克隆抗體首次計(jì)量加倍。發(fā)病后每周監(jiān)測2次體重；發(fā)病后每天同一時(shí)間測量血糖，血糖≥25 mmol/L，按20 U/kg皮下注射來得時(shí)。觀察6周后，腹腔注射水合氯醛麻醉，將老鼠斷頸處死，無菌剪剪開腹腔，分離出肝臟。

1.2.3 PDX-1 mRNA檢測 采用RT-PCR法，用超純RNA提取試劑提取組織樣本中總RNA。取5 μl RNA用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以檢測RNA的完整性。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的gDNA Eraser對RNA中殘留的基因組DNA進(jìn)行消化處理。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)體系為：2×SYBR Premix Ex Taq 12.5 μl、上游引物0.5 μl、下游引物0.5 μl、cDNA 10倍稀釋后取2 μl、滅菌雙蒸水4.5 μl（總體積20 μl）。PCR擴(kuò)增的溫度條件：95℃ 30 s，（95℃ 5 s，60℃ 34 s）×40個(gè)循環(huán)。引物序列：上游：5，-GGAGGAGAATAAGAGGAC-3，，下游：5，-GAACCAGATTTTGATGTG -3，，PCR產(chǎn)物為154 bp。內(nèi)參序列：上游：5，-CGTATCGGACGCCTGGTT-3，，下游：5，-GTGCCGTTGAACTTGCCG-3，，PCR產(chǎn)物為140 bp。取5 μl RNA，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，根據(jù)Real-Time PCR原始檢測結(jié)果，按照2-△△ct相對定量計(jì)算公式，計(jì)算出各樣品的目的基因相對定量結(jié)果，即其他各個(gè)樣品相對于對照樣品，目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異

1.2.4 免疫組化檢測肝臟中PDX-1的相對量的表達(dá) 將肝臟石蠟切片依次行抗原修復(fù)、滅活酶、封閉、抗原-抗體反應(yīng)、加增強(qiáng)劑、一抗二抗反應(yīng)、顯色、終止顯色、復(fù)染、脫水封固等系列操作后于光學(xué)顯微鏡下觀察組織細(xì)胞中的表達(dá)情況。選取5個(gè)高表達(dá)區(qū)域拍照保存。陽性細(xì)胞為胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒沉積。評分標(biāo)準(zhǔn)：A為陽性細(xì)胞數(shù)分級0%～1%=0、1%～10%=1、10%～50%=2、50%～80%=3、80%～100%=4；B為陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級0（陰性）、1（弱陽性）、2（陽性）、3（強(qiáng)陽性）。IHS=A×B［8］。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以（x-±s）表示，對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，對不符合正態(tài)性檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)予數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化，多組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析和LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝臟免疫組化檢測PDX-1表達(dá)水平

與對照組相比，Anti-CD20組、Anti-CD20+IL-10組、IL-10 組PDX-1蛋白表達(dá)均較高，且P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與Anti-CD20組相比，IL-10組、Anti-CD20+IL-10組PDX-1基因表達(dá)較高，且P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但Anti-CD20+IL-10組與IL-10組相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PDX-1免疫組化染色產(chǎn)物位于胞漿，呈棕褐色顆粒，（具體見圖1、表1）。

圖1 Anti-CD20與IL-10聯(lián)合治療對NOD鼠肝臟PDX-1表達(dá)水平的影響（免疫組化染色，×400）

表1 各組免疫組化肝臟PDX-1的相對量的表達(dá)（±s，mmol/L）

表1 各組免疫組化肝臟PDX-1的相對量的表達(dá)（±s，mmol/L）

注：與NC組相比，*P＜0．05；與Anti-CD20組，#P＜0．05；與IL-10組，△P＞0．05

組別　鼠數(shù)　PDX-1 Anti-CD20組Anti-CD20+IL-10組IL-10組NC組6666 42．5±14．167*117．5±11．912*#△118．5±10．173*#11．8±3．601

2.2 Real-Time PCR檢測肝臟中PDX-1基因表達(dá)量

與對照組相比，Anti-CD20組、Anti-CD20+IL-10組、IL-10 組PDX-1基因表達(dá)均較高，且P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；較Anti-CD20組、IL-10組，聯(lián)合組PDX-1基因表達(dá)較高，且P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但Anti-CD20組與IL-10組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（具體見表2，圖2）。

表2 各組PCR檢測肝臟PDX-1基因表達(dá)量（±s，mmol/L）

表2 各組PCR檢測肝臟PDX-1基因表達(dá)量（±s，mmol/L）

注：與NC組相比，*P＜0．05；與Anti-CD20組，#P＜0．05；與IL-10組，△P＞0．05

組別　鼠數(shù)　PDX-1 Anti-CD20組Anti-CD20+IL-10組IL-10組NC組6666 1．319±0．242*1．727±0．202*#△1．307±0．243*0．706±0．346

圖2 PCR檢測肝臟PDX-1基因擴(kuò)增曲線

3 討論

1型糖尿病是在多種遺傳因素和環(huán)境因素相互作用下，引發(fā)自身免疫功能紊亂，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞進(jìn)行性損傷和胰島素分泌絕對不足為基礎(chǔ)的自身免疫性疾病。人們普遍認(rèn)為輔助性T淋巴細(xì)胞在1型糖尿病的發(fā)病中起中心性作用，Th1/Th2細(xì)胞亞群的失衡是該病發(fā)病的關(guān)鍵［9］。IL-10主要由Th2細(xì)胞分泌，作為一種多效性細(xì)胞因子，具有抗炎及免疫抑制特性，可抑制自身免疫反應(yīng)過程中炎性因子釋放，抑制抗原提呈等多個(gè)環(huán)節(jié)，并可促進(jìn)β細(xì)胞分化［10］。實(shí)際上β細(xì)胞在1型糖尿病的發(fā)生及發(fā)展過程中也起著重要作用。最近有研究表明存在β細(xì)胞缺陷的NOD鼠給予抗體治療后，NOD小鼠不會發(fā)生胰島炎及1型糖尿?。?1］。CD20 是β細(xì)胞細(xì)胞膜表面特異性的細(xì)胞因子之一，它表達(dá)于pre-β細(xì)胞階段，并參與β細(xì)胞活化過程?？笴D20單克隆抗體是針對β淋巴細(xì)胞表面CD20分子的單克隆抗體，能夠與細(xì)胞表面CD20分子高親和力結(jié)合，可導(dǎo)致被結(jié)合的β淋巴細(xì)胞清除，使體內(nèi)β淋巴細(xì)胞的數(shù)量減少［12-13］。2009年11月公布的一項(xiàng)Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)中表明，應(yīng)用抗CD20單克隆抗體（利妥昔單抗）可使β細(xì)胞耗竭，在1年內(nèi)胰島素需求量和HbA1c比對照組降低［14］。但是由于抗CD20單克隆抗體對體內(nèi)β淋巴細(xì)胞的清除作用，使得機(jī)體在一定時(shí)期內(nèi)β淋巴細(xì)胞的數(shù)量維持在較低水平，從而對免疫功能造成一定的影響。最近就有研究指出，消除調(diào)節(jié)性β細(xì)胞可引起潰瘍性結(jié)腸炎急性發(fā)作，與局部IL-10產(chǎn)生降低有關(guān)［15］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，IL-10通過抑制β細(xì)胞表面Fas表達(dá)而起到抗凋亡作用［15］。將IL-10與CD20單克隆抗體聯(lián)合使用，盡可能規(guī)避抗CD20單克隆抗體的副作用。

肝臟是三大物質(zhì)代謝的主要場所，也是胰島素作用的三大臟器之一，且胰島素又反饋性調(diào)節(jié)肝臟的糖脂和氨基酸的代謝方向，因此糖尿病肝臟胰島素信號通路的改變可能是肝臟參與糖尿病發(fā)病機(jī)制的重要方式。在胚胎發(fā)育至第4周時(shí)，形成原始腸管，即前腸、中腸和后腸。在前腸尾端腹側(cè)靠近卵黃囊管處，內(nèi)胚層增厚，稱肝憩室，即肝和膽道的原基。由于胰腺和肝臟均來源于相鄰區(qū)域的內(nèi)胚層，肝臟被認(rèn)為是產(chǎn)胰島素細(xì)胞的潛在來源［3］。人們早在發(fā)生肝硬化的肝臟組織中發(fā)現(xiàn)了類似胰腺外分泌細(xì)胞的腺泡細(xì)胞，間接證明了肝臟向胰腺自然轉(zhuǎn)化的存在。肝臟內(nèi)有類胰腺內(nèi)分泌前體細(xì)胞，可以表達(dá)與胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的胰島素轉(zhuǎn)錄因子如PDX-1，ngn3等。PDX-1大多分布于產(chǎn)胰島素的β細(xì)胞及分泌生長抑素的δ細(xì)胞中，也散在分布于十二指腸和發(fā)育的腦中的一些內(nèi)分泌細(xì)胞中。PDX-1在胰腺的發(fā)育中有重要作用，它是胰腺發(fā)育必需的轉(zhuǎn)錄因子，在內(nèi)分泌腺前體細(xì)胞分化為胰島β細(xì)胞過程中起著關(guān)鍵作用。有研究表明在PDX-1基因敲除的小鼠中，未發(fā)現(xiàn)成熟的胰島細(xì)胞，生后很快發(fā)生高血糖癥［16］。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將抗CD20單克隆抗體與IL10聯(lián)合應(yīng)用，可降低NOD鼠的血糖［5,7］，遂本實(shí)驗(yàn)中通過PCR檢測肝臟PDX-1基因表達(dá)及免疫組化檢測PDX-1蛋白的相對表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用可促進(jìn)肝臟中PDX-1的表達(dá)，這或者為外源性胰島素的產(chǎn)生提供新的研究途徑。

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Effect of Combined Application With Anti-CD20 Antibody and Interleukin-10 Gene on Liver PDX-1 Expression in NOD Mice

FAN Lei LI Cheng LI Tang Qingdao University，Qingdao 266071，China

【Abstract】

【中圖分類號】R3

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1674-9316（2016）05-0196-04

doi:10．3969/j．issn．1674-9316．2016．05．143

作者單位：266071 青島大學(xué)

通訊作者：李堂，E-mail：drlitang@hotmail．com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號：81170762）