李國(guó)棟， 尹子麗， 劉小莉*

( 1. 云南中醫(yī)學(xué)院 中藥學(xué)院， 昆明 650500； 2. 云南中醫(yī)學(xué)院 民族醫(yī)藥學(xué)院， 昆明 650500 )

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基于cpDNA trnL-F序列的胡黃連保護(hù)遺傳學(xué)研究

李國(guó)棟1， 尹子麗2， 劉小莉1*

( 1. 云南中醫(yī)學(xué)院 中藥學(xué)院， 昆明 650500； 2. 云南中醫(yī)學(xué)院 民族醫(yī)藥學(xué)院， 昆明 650500 )

摘要：胡黃連為特產(chǎn)中國(guó)-喜馬拉雅特有高山植物，作為常用中、藏藥材，受到滅絕性采挖，作為瀕危和二級(jí)保護(hù)植物亟待科學(xué)的保護(hù)。該研究以云南和西藏7個(gè)野生居群91個(gè)個(gè)體為材料，基于cpDNA trnL-F非編碼序列測(cè)序分析胡黃連的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，分析顯著進(jìn)化單元，確立優(yōu)先保護(hù)居群并提出科學(xué)的保護(hù)策略。結(jié)果表明：胡黃連trnL-F序列長(zhǎng)度為871～876 bp，根據(jù)序列的核苷酸變異共鑒定出5個(gè)單倍型，西藏占有2個(gè)單倍型，云南占有3個(gè)單倍型，西藏和云南2個(gè)地區(qū)的所有單倍型均不共享。胡黃連具有較低的單倍型多樣性(Hd = 0.434 19)和核苷酸多樣性(Dij = 0.004 66)。種群間分化度(Fst=0.864 520)和基因流(Nm=0.04)、居群間的遺傳分化水平(GST=0.916)、AMOVA分析(0.78%的遺傳變異發(fā)生在居群內(nèi)，60.97%的遺傳變異發(fā)生在地區(qū)內(nèi)居群間，38.25%的遺傳變異發(fā)生在地區(qū)間)均表明，胡黃連居群間存在明顯遺傳分化。多數(shù)一致性樹(shù)將胡黃連劃分為3個(gè)進(jìn)化分支(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，這3個(gè)分支均與地理相關(guān)，分支Ⅰ分布于橫斷山區(qū)的4個(gè)居群，分支Ⅱ是分布于東喜馬拉雅的一個(gè)居群，分支Ⅲ是分布于喜馬拉雅中段的2個(gè)居群。3個(gè)分支分屬于3個(gè)“進(jìn)化顯著單元(ESU)”。這3個(gè)ESU中白馬雪山、茨中、定日、波密、聶拉木五個(gè)居群都需要保護(hù)，建議現(xiàn)階段應(yīng)優(yōu)先保護(hù)的居群是云南白馬雪山和西藏波密居群，以就地保護(hù)為主。

關(guān)鍵詞：胡黃連, 瀕危, trn L-F, 單倍型, 保護(hù)遺傳學(xué)

胡黃連(Neopicrorhizascrophulariiflora)為玄參科的單種屬植物，為中國(guó)-喜馬拉雅特有高山植物，分布于我國(guó)云南西北部、西藏，海拔3 600～4 200 m的高山冷涼生境下。胡黃連具有重要的藥用價(jià)值，是常用的中、藏藥材，根狀莖具有清濕熱，除骨蒸、消疳熱的功效(中華人民共和國(guó)藥典，2010)。經(jīng)過(guò)課題組全面調(diào)查發(fā)現(xiàn)，胡黃連資源蘊(yùn)藏量急劇下降，生存受到嚴(yán)重威脅。已被收載在《中國(guó)珍稀瀕危植物名錄》《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生藥材物種名錄》中，目前對(duì)胡黃連研究主要集中在資源調(diào)查(楊少華等，2009)、栽培(楊少華等，2008)、化學(xué)(黃開(kāi)毅等，2008)、藥理(高宏偉等，2011)幾個(gè)方面，對(duì)胡黃連遺傳變異研究?jī)H限于課題組前期基于ISSR分析(Liu et al, 2011)。近年來(lái)，葉綠體DNA (cpDNA)非編碼區(qū)核苷酸序列變異已被經(jīng)常用于分析植物的種群遺傳變異(劉陽(yáng)等，2010; 蘇英娟等，2004)，cpDNA測(cè)序法可以避免其它基于PCR的分子標(biāo)記法經(jīng)常遇到的長(zhǎng)度同塑性問(wèn)題，在估算種群遺傳結(jié)構(gòu)和基因流的能力方面具有較大優(yōu)勢(shì)(Chiang et al, 2001; 蘇應(yīng)娟等，2004)。本研究選擇用于胡黃連近緣種(Picrorhizakurrooa)并且具有很好的位點(diǎn)變異的trnL-F片段對(duì)胡黃連開(kāi)展了保護(hù)遺傳學(xué)研究，旨在檢測(cè)胡黃連基于cpDNA遺傳多樣性水平、遺傳結(jié)構(gòu)并確定優(yōu)先保護(hù)種群，分析位于云南和西藏居群在地區(qū)水平上是否存在顯著分化，劃分顯著進(jìn)化單元，提出保護(hù)建議，其結(jié)果可以為胡黃連這一重要藥用資源的可持續(xù)利用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 研究材料

本研究實(shí)驗(yàn)材料為采集自云南和西藏7個(gè)居群共91個(gè)個(gè)體，基本覆蓋了該物種的所有已知分布點(diǎn)。每個(gè)居群的個(gè)體之間的距離至少5 m以上， 避免采集到同一株的克隆。選擇幼嫩、干凈的葉片，放到硅膠中干燥保存。

表 1　 胡黃連7個(gè)居群的地理分布信息

研究材料采集點(diǎn)詳細(xì)信息見(jiàn)表1，憑證標(biāo)本存放于云南中醫(yī)學(xué)院。

1.2 DNA提取

參考Doyle(1991) CTAB法，針對(duì)胡黃連葉片在研磨過(guò)程中極易褐化的問(wèn)題, 在研磨時(shí)加入適量PVP粉，在65 ℃溫浴過(guò)程中，將2×CTAB溶液與2 μL β-巰基乙醇混合，以有效解決褐化問(wèn)題。

1.3 PCR擴(kuò)增

引物序列為trnL: 5′-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3′；trnF: 5′-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3′，引物由上海生工技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增程序: 94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s, 30個(gè)循環(huán)；末次循環(huán)72 ℃延伸7 min, 4 ℃保存。 PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠檢測(cè),擴(kuò)增成功的樣品送中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司測(cè)序(所有個(gè)體均進(jìn)行雙向測(cè)序)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

將每條序列與chromas 峰圖逐一對(duì)比，結(jié)合Clustal X 1.83軟件對(duì)序列進(jìn)行排列校正。用BioEdit軟件統(tǒng)計(jì)序列信息和核苷酸組成變異。用DnaSP 4.0軟件分析統(tǒng)計(jì)單倍型數(shù)目、單倍型頻率、單倍型多樣度(遺傳多樣度，h)、核苷酸多樣性(Dij)、基因流(Nm)等指標(biāo)。

運(yùn)用HAPLONST程序計(jì)算胡黃連總遺傳多樣性(HT)和居群內(nèi)平均遺傳多樣性 (Hs)以及7個(gè)居群間遺傳分化系數(shù)(GST)。GST和NST的比較采用U統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行。在揭示胡黃連遺傳變異的分布以及分化程度時(shí)，用Arlequin軟件3.01中的分子方差分析AMOVA(Analysis of Molecular Variance)軟件計(jì)算遺傳變異在居群內(nèi)、居群間及云南和西藏2個(gè)地區(qū)間的組成和單倍型分布的FST評(píng)價(jià)。應(yīng)用PAUP*4.0 b10軟件中的最大簡(jiǎn)約性分析法(maximum parsimony, MP)對(duì)單倍型進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析, 選擇Picrorchizakurroa、Wulfensiopsisamherst、短筒兔兒草(Lagotiskongboensis)、Plantagocoronopus作為外類群, 把空位作為缺失，采用啟發(fā)式方式搜索，得到一致性系統(tǒng)樹(shù)。分支的可靠性進(jìn)行Bootstrap分析, 用1 000次的重復(fù)檢驗(yàn)各個(gè)分支的支持率。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 胡黃連trnL-F序列變異分析

對(duì)胡黃連7個(gè)居群 91個(gè)個(gè)體進(jìn)行了cpDNA片段trnL-F序列的雙向測(cè)定，序列長(zhǎng)度在 871～876 bp之間，排序后長(zhǎng)869 bp。共檢測(cè)到5種單倍型(Hap1～Hap5)。單倍型序列比對(duì)后共發(fā)現(xiàn)13處變異位點(diǎn)：12處堿基替換和 1處插入或缺失，其中12處替換包括2處堿基轉(zhuǎn)換，10處堿基顛換(表2)。通過(guò)統(tǒng)計(jì)91個(gè)個(gè)體的序列發(fā)現(xiàn)，堿基A/T含量豐富，占整個(gè)序列的比例為64.93%～65.1%，這與大多數(shù)植物葉綠體DNA堿基組成成分相符(蘇應(yīng)娟等，2004；陳生云等，2008)

2.2 胡黃連單倍型分布、單倍型多樣性、核苷酸多樣性

胡黃連每個(gè)居群?jiǎn)伪缎蛿?shù)目、組成、頻率、多樣性以及核苷酸多樣性指數(shù)見(jiàn)表3。胡黃連共有5個(gè)單倍型，分別是H1、H2、H3、H4、H5,單倍型H1、H3、H4、H5占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，單倍型H4的頻率最高，在DR居群和NLM2個(gè)居群中出現(xiàn)，有27個(gè)個(gè)體，占總個(gè)體數(shù)的30%, 而單倍型H2的分布頻率最低，僅在居群BM中有2個(gè)個(gè)體。H3在CZ居群、SN居群和YZ居群中出現(xiàn)。西藏3個(gè)居群共有2個(gè)單倍型即H4、H5，云南4個(gè)居群共有3個(gè)單倍型即H1、H2、H3，西藏和云南2個(gè)地區(qū)的所有單倍型均不共享，均為各自獨(dú)特的單倍型，這也為胡黃連藥材的產(chǎn)地鑒定提供了可能。由單倍型地理分布可見(jiàn)，胡黃連在云南和西藏2個(gè)地區(qū)間存在一定程度的隔離。

表 2　胡黃連葉綠體DNA trnL-F片段5個(gè)單倍型間的序列變異位點(diǎn)

▲=TCAAA

表 3　胡黃連7個(gè)居群葉綠體DNA單倍型的遺傳多樣度、組成和頻率

胡黃連具有較低的單倍型多樣性(Hd= 0.434 19)和核苷酸多樣性(Dij= 0.004 66)。各個(gè)居群中，只有BM居群的單倍型多樣性較高(Hd= 0.327 27), 其余居群的單倍型多樣性均較低，其中SN和YZ居群均為同源組成。地區(qū)水平上，云南的單倍型多樣性(Hd= 0.543 96)高于西藏(Hd= 0.000 0)。

2.3 遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)

胡黃連7個(gè)居群cpDNAtrnL-F多樣性在居群間的分化程度，兩種中性檢驗(yàn)法檢驗(yàn)的結(jié)果均為正值(Fu and Li′s D*=1.470 34和Tajima′s=1.896 02)，并且均呈顯著水平(0.10>P>0.05)。同時(shí)，對(duì)胡黃連居群trnL-F片段序列數(shù)據(jù)的歧點(diǎn)分布分析顯示觀測(cè)值和期望值兩者比較得到的是一個(gè)非單峰分布圖(圖1)，此圖明顯偏離了群體擴(kuò)張模型，結(jié)果表明胡黃連可能未曾經(jīng)歷過(guò)居群擴(kuò)張。

根據(jù)胡黃連cpDNAtrnL-F序列變異(gap as the fifth state)采用Nei(1973)的算法估算出的居群間分化度(Fst)為0.864 52，基因流(Nm)為0.04，表明胡黃連各個(gè)居群間存的分化較大。在云南和西藏2個(gè)地區(qū)內(nèi)，云南居群間的Fst為0～0.904 38,Nm為0.08，西藏居群間的Fst為0～1.000,Nm為0，說(shuō)明2個(gè)地區(qū)內(nèi)居群間的基因交流也近乎為零。

胡黃連總的遺傳多樣性HT(se)、居群內(nèi)平均遺傳多樣性HS(se)、7個(gè)居群間遺傳分化GST(se)和NST(se)值分別為0.861 (0.0443)、0.073 (0.0496)、0.916 (0.057 5)和0.987 (0.013 3)。使用U統(tǒng)計(jì)法檢驗(yàn)胡黃連所有單倍型變異的地理結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NST>GST(P<0.01)，以上分析結(jié)果均表明胡黃連在整個(gè)中國(guó)-東喜馬拉雅分布區(qū)內(nèi)，居群間的遺傳分化水平非常高(GST=0.916)，單倍型的親緣關(guān)系越相近越傾向于分布于同一居群中，并且有著明顯的親緣地理結(jié)構(gòu)存在。將胡黃連按照地區(qū)分為云南和西藏2個(gè)組后, AMOVA分析也表明，胡黃連居群只有0.78%的遺傳變異發(fā)生在居群內(nèi)，而60.97%遺傳變異發(fā)生在地區(qū)內(nèi)居群間，38.25%遺傳變異發(fā)生在地區(qū)間(表4), 這也揭示了胡黃連的遺傳變異主要存在于居群間，而且具有相當(dāng)高的居群分化水平。

表 4　胡黃連2個(gè)地區(qū)之間的cpDNA AMOVA分析

圖 1　胡黃連cpDNA序列的失配分布圖實(shí)線Exp-預(yù)期值；虛線Obs-觀測(cè)值。Fig. 1　Mismatch distribution for cpDNA sequence data of N. scrophulariiflora　Solid line represents the expected value; dotted line represents the observed value.

2.4 “顯著進(jìn)化單元”的劃分

用粗筒兔兒草等做外類群對(duì)5個(gè)單倍型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育多數(shù)一致性樹(shù)，通過(guò)啟發(fā)式搜索得到一棵多數(shù)一致性樹(shù)，得到了3個(gè)進(jìn)化分支(GroupⅠ-Ⅲ)，如圖2。組Ⅰ和組Ⅱ共同構(gòu)成一個(gè)單系，具有54%的支持率。組Ⅰ的單倍型為分布在橫斷山區(qū)的4個(gè)居群(BM、YZ、SN、CZ)，構(gòu)成一個(gè)單系，具有90%的支持率，組Ⅱ的單倍型分布在東喜馬拉雅北端的2個(gè)居群(DR、NLM)，組Ⅲ的單倍型分布在東喜馬拉雅的居群(BMI)，與P.kurrooa聚為一支，具有78%的支持率。因此GroupⅠ、GroupⅡ、GroupⅢ各自劃分為一個(gè)ESU。

遺傳距離計(jì)算的結(jié)果支持3個(gè)ESU的劃分(表5)，3個(gè)ESU內(nèi)兩兩居群間的遺傳距離≤1.182 (對(duì)角線以下，不加粗部分)，ESU之間的兩兩居群間的遺傳距離≥1.399(對(duì)角線以下，加粗部分)。居群內(nèi)平均遺傳距離為0～0.327,ESUⅠ、Ⅱ、Ⅲ內(nèi)平均遺傳距離分別為0.000、0.001、0.000。91個(gè)個(gè)體兩兩的遺傳距離為0.000～0.013。

對(duì)3個(gè)ESUs進(jìn)行AMOVA分析和相應(yīng)的F檢驗(yàn)的結(jié)果(表6)可見(jiàn)，遺傳變異主要存在于ESUs間，所占比例高達(dá)94.22%，ESUs內(nèi)居群間的遺傳變異僅占5.09%，居群內(nèi)的遺傳變異幾乎可以忽略不計(jì)，僅為0.69%，因此，AMOVA的結(jié)果也支持胡黃連3個(gè)ESUs的劃分。

圖 2　胡黃連5個(gè)單倍型的多數(shù)一致性樹(shù)，顯示50%以上的支持Fig. 2　Majority-rule consensus of 5 cpDNA haplotypes of N. scrophulariiflora, showing more than 50% of the support

3討論

3.1 胡黃連遺傳分化程度

胡黃連的cpDNAtrnL-F片段檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在單倍型序列的13個(gè)變異位點(diǎn)中，小片段的插入/缺失僅占了1個(gè)，而點(diǎn)突變占了12個(gè)。由此表明了胡黃連單倍型序列間的分化水平較高，種內(nèi)遺傳分化經(jīng)歷的時(shí)間較長(zhǎng)。

對(duì)胡黃連整個(gè)地理分布區(qū)的7個(gè)居群91個(gè)個(gè)體進(jìn)行的trnL-F基因間區(qū)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，胡黃連總的遺傳多樣性(HT= 0.861)和居群間遺傳分化程度都很高(Gst= 0.916)。這與ISSR分子標(biāo)記的分析結(jié)果一致(liu et al, 2011)。居群間遺傳分化程度較之大多數(shù)物種高，如條紋狹葉龍膽(Metagentianastriata),Gst=0.859(陳生云等，2008)、偏花報(bào)春(Primulasecundiflora), Gst = 0.816(Wang et al, 2008)、肋果沙棘(Hippophaeneurocarpa)，Gst= 0.646(孟麗華等，2008)等。胡黃連的cpDNA多樣性水平高于Petit et al(2005)所統(tǒng)計(jì)的175種種子植物的平均cpDNA多樣性HT= 0.67。AMOVA分析也表明，胡黃連99.22%遺傳變異發(fā)生在居群間，基因流僅為 0.04, 說(shuō)明胡黃連具有很高的遺傳分化水平，而且居群間幾乎沒(méi)有基因交流。Ouborg et al(1999)認(rèn)為種群間一粒種子或一個(gè)花粉粒的交流就會(huì)導(dǎo)致Gst值達(dá)到0.20，這說(shuō)明胡黃連種群間存在極低的花粉或種子交流。根據(jù)cpDNA得出的Gst值反映種子遷移對(duì)基因流的貢獻(xiàn)，而根據(jù)核基因組分子標(biāo)記ISSR計(jì)算出的Gst值既反映了種子遷移對(duì)基因流的貢獻(xiàn)，同時(shí)也反映了花粉運(yùn)動(dòng)對(duì)基因流的貢獻(xiàn)。因此對(duì)于胡黃連而言，花粉運(yùn)動(dòng)對(duì)基因流的貢獻(xiàn)要比種子稍大。

表 5　胡黃連7個(gè)居群間和居群內(nèi)的遺傳距離

注：對(duì)角線下為居群間遺傳距離, 對(duì)角線上為標(biāo)準(zhǔn)誤，下劃線為居群內(nèi)遺傳距離。

Note: Among populations distances are below the diagonal(mean among the ESU). SE values are above diagonal. Within population mean distances are underlined.

表 6　胡黃連7個(gè)居群不同層次AMOVA分析

注：顯著性檢驗(yàn)用1 023次置換。

Note: Significance tests using 1 023 permutations.

胡黃連居群間如此大的遺傳分化和如此低的基因流這可能與喜馬拉雅和橫斷山區(qū)的生境復(fù)雜度有關(guān)。5個(gè)單倍型在2個(gè)地區(qū)中的分布呈現(xiàn)較大差異，所有單倍型在2個(gè)地區(qū)間均不共享，而是為各自獨(dú)有，在西藏地區(qū)，聶拉木(NLM)和定日(DR)共享一個(gè)單倍型(H4)，居群波密 (BMI) 居群獨(dú)有一個(gè)單倍型(H5)，從胡黃連單倍型多數(shù)一致性樹(shù)(圖2)可見(jiàn)西藏的2個(gè)單倍型不構(gòu)成一個(gè)單系，這一結(jié)果顯然也說(shuō)明胡黃連存在分化明顯的遺傳譜系， BMI與P.kurrooa聚為一支，這是否意味著該屬分類地位上存在一定的疑問(wèn)？有待于深入研究。

3.2 顯著進(jìn)化單元的劃分及胡黃連保護(hù)

本研究根據(jù)多數(shù)一致性樹(shù)劃分的3個(gè)ESUs, 從居群間的遺傳距離矩陣也得到很好的支持，所有3個(gè)ESU內(nèi)兩兩居群間的遺傳距離小于ESU之間的兩兩居群間的遺傳距離(分別是≤1.182和≥1.399)，表明ESUs內(nèi)的居群之間遺傳分化程度低，ESUs之間遺傳分化程度高。

ESUⅠ 包括了4個(gè)居群分別是BM、CZ、YZ、SN，占有3個(gè)單倍型(H1、H2、H3), 從單倍型在這個(gè)4個(gè)居群的分布來(lái)看，必須優(yōu)先保護(hù)的是BM和CZ居群。其中BM居群的保護(hù)任務(wù)是最緊迫的，因?yàn)锽M居群具有獨(dú)特的單倍型H2，而CZ包含了H1、H32個(gè)單倍型，因此保護(hù)這2個(gè)居群就等于保護(hù)了所有的遺傳變異。目前BM居群分布于白馬雪山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)，但由于此居群與胡黃連的其它居群相比，交通相對(duì)便利，云南省迪慶州德欽縣的藏醫(yī)日常使用常在此處采挖，保護(hù)區(qū)由于地域廣闊，人力物力限制，對(duì)瀕危植物的保護(hù)相對(duì)較薄弱，因此此居群境況堪憂。按照ESU的保護(hù)原則是種群的遺傳組成越獨(dú)特，越具有優(yōu)先保護(hù)價(jià)值，因而B(niǎo)M居群是需要重點(diǎn)保護(hù)的居群，因?yàn)檫@個(gè)居群的消失會(huì)對(duì)胡黃連的遺傳多樣性造成重大影響。CZ居群離附近的村莊比較遠(yuǎn)，居群附近生境惡劣，鮮有人煙活動(dòng)，受到威脅的可能性較小。

ESUⅡ包括了DR和NLM2個(gè)居群，只有這2個(gè)居群具有單倍型H4，因此也具有獨(dú)特性。NLM居群分布于聶拉木縣城附近，每年都有藥材收購(gòu)商到當(dāng)?shù)厥召?gòu)胡黃連藥材，當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)往往組織成小分隊(duì)的形式進(jìn)行采挖，因此對(duì)NLM居群的干擾特別大，而DR居群是位于日喀則地區(qū)定日縣融霞鄉(xiāng)的一個(gè)居群，多年前被定日縣的藏醫(yī)采收過(guò)，由于資源已嚴(yán)重匱乏，當(dāng)?shù)夭蒯t(yī)已多年未曾來(lái)此地采集，此居群由于地處偏遠(yuǎn)、交通不便受人類干擾相對(duì)較小，但此居群很小，能夠自然復(fù)壯的幾率很低。這2個(gè)居群已經(jīng)處于珠穆朗瑪峰國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)，盡管此保護(hù)區(qū)主要保護(hù)高山、高原生態(tài)系統(tǒng)，但由于地域廣闊，對(duì)胡黃連的保護(hù)沒(méi)有受到足夠重視。綜上所述，DR居群可以采用就地保護(hù)措施，而對(duì)嚴(yán)重受人類干擾的NLM居群的最佳保護(hù)措施則是遷地保護(hù)，由于兩者具有共同的單倍型，因此2個(gè)居群能夠保護(hù)好一個(gè)居群即可。

ESUⅢ 只包含一個(gè)居群即BMI居群，并且具有一個(gè)獨(dú)特的單倍型H5, 結(jié)合ISSR分子標(biāo)記研究結(jié)果，BMI居群是所有居群中遺傳多樣性水平最低的一個(gè)(PPB=4.88)，因而此居群胡黃連具有重要的保護(hù)價(jià)值。在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)此居群胡黃連數(shù)量已非常少，呈零星分布，距離最近的是波密縣城，波密縣以旅游業(yè)為主，未見(jiàn)藏醫(yī)院以及藏醫(yī)，因而此地對(duì)胡黃連的利用很少，但胡黃連為何會(huì)數(shù)量如此之少，原因現(xiàn)無(wú)從得知。從保護(hù)遺傳差異性居群角度，此居群由于遺傳的特異性，需要就地保護(hù)。

由于胡黃連的遺傳多樣性主要分布在居群間，若有條件在高海拔地區(qū)建設(shè)胡黃連種質(zhì)資源圃對(duì)胡黃連進(jìn)行遷地保護(hù)時(shí)，樣品采集應(yīng)該覆蓋盡可能多的居群而避免從一2個(gè)居群采集多個(gè)個(gè)體。

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Conservative genetics ofNeopicrorhizascrophulariiflorabased on cpDNAtrnL-F

LI Guo-Dong1， YIN Zi-Li2， LIU Xiao-Li1*

( 1.CollegeofTraditionalChinesePharmacy,YunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine, Kunming 650500, China;2.CollegeofTraditionalMinorityMedicine,YunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine, Kunming 650500, China )

Abstract:Neopicrorhiza scrophulariiflora (Scrophulariaceae), a monotypic genus perennial species, is endemic to the Eastern Himalayas and the Hengduan Mountains region. It only distributes in Yunnan and Tibet in China, ranging from 3 600 m to 4 200 m in elevation. The long and creep rhizomes (Rhizoma Neopicrorhizae) are of high medicinal value and dysentery by traditional Chinese and Tibetan medicine. Mainly because of large-scale acquisitions activity, natural populations of this species have suffered rapid declines and now it is classified as an endangered species under second category of key protected wild plants in China. In order to protect the decreasing natural genetic resources of N. scrophulariiflora, in this study, the chloroplast DNA (cpDNA) trnL-F noncoding sequence was used to estimate the genetic diversity and genetic structure and the evolutionary significant units (ESU) were proposed. A total of 91 individuals of N. scrophulariiflora were collected from seven populations, covering almost all areas of its distribution ranges. Of these seven populations, four were from Yunnan Province and three populations were from Tibet. The statistical results showed that the haplotype sequences length varied from 871 bp to 876 bp. A total of five haplotypes were detected based on trnL-F nucleotide variation. Yunnan contains three haplotypes and Tibet contains two. However, none of common haplotypes were shared between the populations from Yunnan and Tibet. A normal low level of genetic diversity (Hd = 0.434 19) and nucleotide diversity (Dij = 0.004 66) were identified at the species level. A high level of genetic differentiation (0.96) among populations was revealed. AMOVA results from chloroplast data indicated that 0.78% of the genetic variation was partitioned within population, 60.97% among populations within groups, and 38.25% among groups under the condition that N. scrophulariiflora was divided into two groups including Yunnan and Tibet. The U-statistic test for phylogeographical structure showed that NSTwas significantly higher than GST(NST>GST, P < 0.01), which suggested a distinctly phylogeographical pattern The gene flow (Nm) was extremely low with only 0.04. The higher NSTthan GST(P<0.01) suggested a distinctly phylogeographical pattern. Conjoint Fst (0.864 520), gene flow, GSTand AMOVA results all indicated a significant high level of genetic differentiation among populations, which could be a consequence of the limited gene flow caused by geographic isolation among populations. Phylogenetic analysis of the haplotypes sequences identified three tentative clades (Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ) according to Majority-rule consensus tree. All of which had distinct geographic range: Clade Ⅰ comprised four populations (CZ, YZ, SN, BM) which were located at the Hengduan Mountains region; Clade Ⅱ comprised one population (BMI), which was located at the Eastern Himalayas region; and Clade Ⅲ comprised two populations (DR, NLM) located at the Central Himalayas region. Based on the phylogenetic analyses and uniqueness of the populations, three evolutionary significant units (ESU) were identified and conservation strategies were discussed for this endangered species. Baimaxueshan and Cizhong, Bomi, Nielamu and Dingri populations respectively concluded in the three evolutionary significant units and the five populations all contained special haplotypes. Based on these findings, all the populations should be protected. However, in consideration of the actual distribution of every population, Baimaxueshan population from Yunnan and Bomi population from Tibet should be given priority for conservation and in situ conservation should be the ideal implement.

Key words:Neopicrorhiza scrophulariiflora, endangered, trnL-F, haplotype, conservative genetics

DOI:10.11931/guihaia.gxzw201410004

收稿日期:2014-10-8修回日期：2015-03-29

基金項(xiàng)目：云南省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2010CD073)；國(guó)家科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目(SB2007FY0200)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究青年項(xiàng)目(2014FD035)[Supported by the Natural Science Foundation of Yunnan(2010CD073)； National Science and Technology Basic Special Fund (SB2007FY0200)； Yunnan Youth Program for the Application Foundamental Research (2014FD035)]。

作者簡(jiǎn)介：李國(guó)棟(1984-)， 江西鄱陽(yáng)人，博士，講師，主要從事植物譜系地理學(xué)研究，(E-mail)gammar116@163.com。 *通訊作者：劉小莉，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事藥用植物資源研究，(E-mail)kmxunzi@aliyun.com。

中圖分類號(hào)：Q945

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142(2016)06-0691-07

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