包曙光， 魏情情， 劉智康， 聶　祥， 門淑珍

( 南開大學 生命科學學院 植物生物學和生態(tài)學系， 天津 300071 )

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擬南芥醛還原酶編碼基因At3g04000表達模式分析及過量表達轉基因植株獲得

包曙光， 魏情情， 劉智康， 聶祥， 門淑珍*

( 南開大學 生命科學學院 植物生物學和生態(tài)學系， 天津 300071 )

摘要：植物體內的α,β-不飽和活性醛類化合物對植物細胞具有毒害作用，清除這些α,β-不飽和活性醛類化合物對于植物細胞維持正常的生命活動至關重要。前人研究報道通過體外酶活測定和異源瞬時表達鑒定擬南芥At3g04000基因編碼的蛋白為NADPH依賴的葉綠體醛還原酶(Arabidopsis NADPH-dependent chloroplastic aldehyde reductases, AtChlADRs)，推測其在清除葉綠體中長鏈(≥5)α,β-不飽和醛類物質中具有重要的功能。該研究主要構建了擬南芥At3g04000基因的表達模式分析載體ProAt3g04000:GUS、亞細胞定位分析載體At3g04000-EGFP和過量表達載體At3g04000-OE，并獲得了轉基因擬南芥，并通過實時定量PCR分析了At3g04000基因在擬南芥不同組織中的轉錄水平。結果表明：擬南芥At3g04000基因在幼苗中的轉錄水平最高，在蓮座葉、莖生葉、花序和角果中均有較高的轉錄水平；而在根部和莖稈中的轉錄水平較低。通過對ProAt3g04000:GUS轉基因植株的GUS染色分析可知，At3g04000基因在子葉、蓮座葉和萼片的維管組織和保衛(wèi)細胞中均有較強的表達，在根的維管組織中有較弱的表達。通過共聚焦顯微鏡對At3g04000-EGFP轉基因植株的觀察和分析發(fā)現，At3g04000不是定位于葉綠體中，而是定位在細胞質和細胞核中。該研究結果為深入研究擬南芥醛還原酶編碼基因At3g04000的功能奠定了基礎。

關鍵詞：擬南芥， α,β-不飽和醛， 醛還原酶， At3g04000， 表達模式， 過量表達

活性氧族(Reactive oxygen species，ROS)是植物有氧代謝過程中重要的副產物，對于植物生長發(fā)育過程起雙重功效：低濃度ROS可以促進植物的生長發(fā)育，高濃度ROS對植物有氧化脅迫作用(Bolwell et al，1995；林植芳和劉楠，2012；田敏等，2005)。正常情況下，植物體內ROS產生和清除處于平衡狀態(tài)不會對細胞造成傷害。當外在或內在因素破壞了生物體內ROS含量的動態(tài)平衡狀態(tài)時,生物體內過多的ROS將會損傷生物大分子，主要包括對蛋白質的損傷作用、對DNA和糖類的氧化損傷及脂質過氧化(Potikha et al，1999；Halliwell，2006；張文玲等，2000；李冰冰等，2005)。當植物遭受到外界生物或非生物脅迫時，ROS含量會迸發(fā)(Jackson et al，2001；Fath et al，2002)。ROS中的單線態(tài)氧和羥基自由基能與細胞膜組分中的多聚不飽和脂肪酸發(fā)生作用引發(fā)脂質的過氧化反應，產生大量含有羰基的中間產物(Burcham，1998)。不飽和羰基化合物會擾亂細胞內的代謝平衡造成氧化脅迫，從而引起對細胞的毒害。其中醛類物質能破壞膜的完整性，引起細胞毒害(Esterbauer et al，1991；Millar & Leaver，2000；Yamauchi & Sugimoto，2010)。活性醛參與了植物逆境脅迫下對細胞的毒害作用，影響植物正常的生長發(fā)育(Mano et al，2005；Yin et al，2010)。清除植物體內過多的活性醛類物質將會提高植物抵抗逆境的能力。Chen & Murata(2002)發(fā)現甜菜堿乙醛脫氫酶BADH能使細胞在干旱和高鹽等逆境脅迫下維持滲透平衡從而提高植物抗逆性。張海玲等(2010)發(fā)現轉乙醛脫氫酶基因(ALDH)番茄的抗逆性明顯高于對照，轉基因植物體內的活性醛類物質所造成的氧化脅迫明顯下降。Mano et al(2005)在煙草中過量表達擬南芥的2-烯醛還原酶基因(2-ALKENALREDUCTASE，AER)明顯減少強光誘導的氧化脅迫，提高植物抗逆性。吳茜等(2015)在煙草中過量表達擬南芥AER基因明顯提高了煙草抗旱能力。α,β-不飽和活性醛類物質可以通過與氨基反應形成希夫堿化合物(Schiff baseadducts)，對細胞造成毒害(Yamauchi et al，2008)。因此，去除植物體內α,β-不飽和的活性醛類物質有助于植物解除活性醛造成的氧化損傷。

哺乳動物細胞中去除α,β-不飽和活性醛的代謝途徑已有報道(Uchida，2003；Yamauchi et al，2011)，包括(1)醛脫氫酶，氧化醛類物質轉變?yōu)轸人猁}類化合物(Sellin et al，1991)；(2)醛-酮還原酶，催化醛轉變?yōu)榇碱愇镔|(Kolb et al，1994; Burczynski et al，2001)；(3)谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)途徑(Hartley et al，1995)；(4)NADPH依賴的鏈烯基氧化還原酶，催化含有α,β-不飽和的活性醛類物質的氫化作用(Dick et al，2001)。關于植物體內去除不飽和活性醛類物質代謝途徑的研究相對較少。Yamauchi et al(2011)在擬南芥中篩選到NADPH 依賴的鏈烯基氧化還原酶At1g23740。此外，還在擬南芥中分別篩選到NADPH 依賴且定位于細胞質的醛還原酶(At2g24190和At3g61220)和定位于葉綠體的一個醛-酮還原酶(At2g37770)及2個醛還原酶(At1g54870 和At3g04000)。其中，At3g04000具有去除長鏈(≥5)α,β-不飽和醛和飽和醛的醛還原酶活力，并以紫鴨跖草(Tradescantiareflexa)葉片為材料利用瞬時轉化技術鑒定擬南芥醛還原酶At3g04000定位于葉綠體。然而，關于At3g04000表達模式的分析和在擬南芥穩(wěn)定表達株系中亞細胞定位模式的研究尚未見有報道。本研究通過實時定量PCR檢測了At3g04000基因在擬南芥不同組織的轉錄水平。構建了At3g04000基因的啟動子與GUS報告基因的融合載體，并且獲得了轉基因擬南芥ProAt3g04000:GUS。通過GUS染色分析了擬南芥醛還原酶At3g04000的表達模式。構建了At3g04000全長基因(-927～+933)與GFP基因融合的亞細胞定位分析載體。以At3g04000-EGFP轉基因擬南芥作為材料，檢測了擬南芥醛還原酶At3g04000在擬南芥體內的亞細胞定位模式。另外，構建了擬南芥醛還原酶At3g04000過量表達載體，并且獲得了純合的過量表達轉基因擬南芥。

1材料與方法

1.1 植物材料

所用的擬南芥(Arabidopsisthaliana)為哥倫比亞型(Col-0)，種子由本實驗室保存。擬南芥培養(yǎng)在人工氣候室內，溫度設定為22 ℃，濕度設定為60%，設定光照為16 h、8 h黑暗。分別采集野生型擬南芥的根、幼苗、蓮座葉、莖生葉、莖稈、花序和角果用于At3g04000基因表達模式的分析。采集四周齡的野生型和過量表達植株的蓮座葉用于過量表達植株的轉錄水平分析。植物材料采集后立即于液氮中速凍，-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒和 SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒均購自TaKaRa生物公司。引物訂購和測序反應均由華大生物有限公司完成。限制性內切酶購自Thermo公司。其它試劑購自上海生工生物有限公司。

1.3 主要方法

1.3.1 RNA提取和cDNA的合成擬南芥總RNA 的提取按照TaKaRa生物公司RNA提取試劑盒說明書進行。取2 μg不同組織的的總RNA用于反轉錄反應，合成的cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 At3g04000基因的啟動子、開放閱讀框和全長基因(-927～+933)的克隆通過擬南芥數據庫(www.arabidopsis.org)獲得At3g04000基因的完整信息。選取起始密碼子(ATG)上游927 bp作為該基因的啟動子。采用Premer Premier 5.0軟件設計At3g04000基因的啟動子、開放閱讀框和全長基因序列(-927～+933)的特異引物，附加所需的限制性內切酶位點(表1)。以3周齡擬南芥蓮座葉的DNA為擴增At3g04000基因啟動子和全長基因(-927～+933)的模板。以幼苗總RNA反轉錄合成的cDNA為擴增At3g04000基因開放閱讀框的模板。

1.3.3 表達載體構建和擬南芥轉化通過酶切連接的方法分別構建了At3g04000表達模式分析載體、亞細胞定位分析載體和基因過量表達載體(圖2)。(1)利用KpnⅠ和SpeⅠ限制性內切酶對擴增得到的At3g04000基因的啟動子產物和pGreenⅡ-0229-GUS載體進行酶切反應。通過T4連接酶的連接作用將At3g04000基因的啟動子序列連接到pGreenⅡ-0229-GUS載體中，獲得了At3g04000基因表達模式的分析載體ProAt3g04000:GUS。(2)利用KpnⅠ和SpeⅠ限制性內切酶將擴增得到的At3g04000全長基因(-927～+933)產物和pGreenⅡ-0229-EGFP載體進行酶切反應。通過T4連接酶的連接作用將At3g04000全長基因(-927～+933)連接到pGreenⅡ-0229-EGFP載體中，獲得了At3g04000基因亞細胞定位的分析載體At3g04000-EGFP。(3)利用XbaⅠ和SpeⅠ限制性內切酶對擴增得到的At3g04000基因的開放閱讀框產物和過量表達載體pBA002分別進行酶切反應。通過T4連接酶的連接作用將At3g04000基因的開放閱讀框序列連接到過量表達載體pBA002中，獲得了帶有CaMV35S啟動子的過量表達植物載體At3g04000-OE。

將測序正確的At3g04000基因表達模式分析載體、亞細胞定位分析載體和過量表達載體分別轉入農桿菌菌株C58C1中。采用花苞浸泡法將3個表達載體分別轉化到擬南芥中。

1.3.4 At3g04000基因過量表達植株轉錄水平分析提取4周齡的野生型和過量表達植株蓮座葉的總RNA且反轉錄為cDNA。用半定量RT-PCR方法鑒定過量表達植株中At3g04000基因的轉錄水平。

1.3.5 At3g04000基因表達模式和蛋白質亞細胞定位的分析(1)ProAt3g04000:GUS植株的GUS 染色分析：將ProAt3g04000:GUS轉基因植株的不同組織分別置入配置好的GUS 染色液中，37 ℃保溫過夜。將染色好的植物組織置于固定液(乙醇∶乙酸=3∶1)中固定脫色2 h，然后用透明劑進行透明處理。

表 1　本文中用到的引物

注：下劃線標識引入的酶切位點。Note: Restriction site is underlined.

將透明好的植物材料置于顯微鏡下觀察和拍照。(2)At3g04000基因的實時定量PCR分析：以擬南芥的不同組織總RNA反轉錄得到的cDNA作為模板，以持家基因ACTIN2基因為內參，進行實時定量 PCR反應。用Primer Premier 5.0軟件設計At3g04000基因的特異引物作為擴增引物(表1)。擴增程序如下：預變性 94 ℃ 2 min; 變性94 ℃ 10 s，退火60 ℃ 10 s，延伸 72 ℃ 20 s，40個循環(huán)。每個反應進行3次技術重復。(3)At3g04000蛋白的亞細胞定位分析：以轉基因擬南芥At3g04000-EGFP的T2代幼苗的子葉作為實驗材料，置于共聚焦顯微鏡下觀察和拍照。

2結果與分析

2.1 擬南芥At3g04000基因的啟動子、開放閱讀框和全長基因(-927～+933)的克隆及轉基因植株的獲得

根據擬南芥數據庫中的基因信息，At3g04000基因的開放閱讀框為816 bp, 編碼了272個氨基酸。以野生型擬南芥的DNA為模板，通過PCR擴增分別獲得At3g04000基因的啟動子和全長基因(-927～+933)的擴增產物(圖1)。以野生型擬南芥幼苗總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，通過PCR擴增獲得At3g04000基因開放閱讀框的擴增產物(圖1)。用酶切連接的方法分別構建At3g04000基因的表達模式分析載體ProAt3g04000:GUS、亞細胞定位分析載體At3g04000-EGFP和過量表達載體At3g04000-OE(圖2：A、B、C)。通過花苞浸泡法分別獲得3個表達載體的轉基因植株，并利用PCR對所獲得的轉基因植株進行鑒定，獲得了轉基因陽性植株(圖2：D、E、F)。

圖 1　擬南芥醛還原酶編碼基因At3g04000啟動子、全長基因(-927～+933)和開放閱讀框PCR擴增產物的凝膠電泳結果　M. DNA分子量標準； A. At3g04000啟動子的擴增產物； B. At3g04000全長基因(-927～+933)的擴增產物； C. At3g04000基因開放閱讀框的擴增產物。Fig. 1　PCR products of promoter,genomic sequences (-927-+933) and open reading frame of Arabidopsis aldehyde reductase encoding gene At3g04000 analyzed by agarose gel electrophoresis　M. DNA marker; A. PCR products of At3g04000 promoter; B. PCR products of At3g04000 genomic sequence(-927-+933); C. PCR products of At3g04000 open reading frame.

2.2 At3g04000基因表達模式的分析

為檢測At3g04000基因的表達模式，分別以野生型擬南芥的根、幼苗、蓮座葉、莖生葉、莖稈、花和角果為材料，對擬南芥不同組織中At3g04000基因的表達水平進行實時定量PCR檢測。由圖3可知，At3g04000基因在所有檢測組織中均有表達，但表達水平明顯不同。At3g04000基因在幼苗中的表達水平最高，在蓮座葉、莖生葉、花序和角果中也均有較高的表達水平；At3g04000基因在莖稈中的表達水平最低，在根中的表達水平也較低(圖3)。

為了進一步檢測At3g04000基因在不同組織表達的特異性，通過GUS組織化學染色法分析了ProAt3g04000:GUS轉基因植株的不同組織中At3g04000基因的表達情況。分別將ProAt3g04000:GUS轉基因植株的不同組織材料置于GUS染色液中37 ℃保溫過夜。通過顯微鏡觀察發(fā)現，ProAt3g04000:GUS轉基因植株的幼苗、蓮座葉、花序中都有染色。在幼苗的整個子葉中都有強的染色，尤其在維管組織和保衛(wèi)細胞中，而在根部維管組織中染色較弱；在蓮座葉維管組織和保衛(wèi)細胞中有強的染色；在花序中僅在萼片的維管組織和保衛(wèi)細胞中有強的染色(圖4)。

2.3 At3g04000蛋白亞細胞定位的分析

為了檢測At3g04000蛋白的亞細胞定位模式，以At3g04000-EGFP轉基因擬南芥幼苗的子葉為材料分析At3g04000的亞細胞定位模式。通過共聚焦顯微鏡觀察可知，At3g04000并不定位于葉綠體中，而是定位在細胞質和細胞核中(圖5)。

2.4 At3g04000基因過量表達植株的獲得及相對轉錄水平分析

為了研究At3g04000基因在擬南芥的生長發(fā)育過程中的作用，采用酶切連接的方法構建了At3g04000基因的過量表達載體At3g04000-OE(圖2：C)。通過農桿菌介導法將測序正確的過量表達載體轉入擬南芥中并獲得了At3g04000-OE轉基因擬南芥的T1代種子。由于過量表達載體pBA002中有除草劑抗性基因，因此采用除草劑篩選獲得了T1代抗性植株。通過PCR進行基因型鑒定進一步獲得了轉基因陽性植株(圖2：F)。將不同轉基因株系的T2代擬南芥種子播種于土中，用除草劑進行篩選。選擇抗性苗與非抗性苗比例為3∶1分離的株系作為繼續(xù)篩選的材料。通過除草劑的篩選獲得了純合的At3g04000-OE轉基因單拷貝株系。為了檢驗轉基因植株中At3g04000轉錄水平的變化，采用半定量RT-PCR分析了轉基因植株中At3g04000的相對轉錄水平，表明轉基因株系At3g04000-OE-1 #、5# 和22 #中At3g04000基因的表達量均明顯的高于野生型(圖6)。這表明獲得的純合At3g04000-OE-1 #、5 #和22 #株系是At3g04000基因過量表達轉基因株系。

3討論

植物體內的有氧代謝過程會產生活性氧，此外當植物受到外界環(huán)境脅迫時也會有活性氧在細胞中大量累積(Asada，1999；Thannickal & Fanburg，2000；薛鑫等，2013)。活性氧的過量積累會造成植物體內脂質的過氧化， 從而引起大量醛的累積(Burcham，1998)。在逆境脅迫下植物體內醛的過量積累是引起植物傷害的重要因素之一(Mano et al，2005；Yin et al，2010)。清除植物體內過量累積的醛類物質有利于解除植物所受到的毒害和提高抗逆性(張海玲等，2010；吳茜等，2015)。植物體內的α,β-不飽和的活性醛是一類對細胞產生毒害的醛類物質(Yamauchi et al，2011)。因此清除植物體內的α,β-不飽和的活性醛有利于解除細胞受到的毒害。Yamauchi et al(2011)通過體外酶活測定實驗和瞬時表達技術鑒定了At3g04000是一個NADPH依賴的定位于葉綠體的擬南芥醛還原酶。然而，本研究通過實時定量PCR檢測和GUS 染色分析可知：At3g04000基因不僅在擬南芥的子葉、蓮座葉和萼片中有表達，而且在根部也有明顯的表達。因此推測：At3g04000基因可能并不僅僅定位于葉綠體。

圖 2　擬南芥醛還原酶編碼基因At3g04000載體構建示意圖和轉基因植株PCR鑒定結果　A. 表達模式分析載體構建示意圖； B. 亞細胞定位載體構建示意圖； C. 過量表達載體的構建示意圖； D. ProAt3g04000:GUS轉基因擬南芥PCR鑒定結果，1-9、11-14和16#為轉基因陽性植株； M: DNA分子量標準； P. 陽性對照; N. 陰性對照； E. At3g04000-EGFP轉基因擬南芥PCR鑒定結果，1-6、8-11和13-16為轉基因陽性植株; M: DNA分子量標準; P. 陽性對照; N. 陰性對照； F. At3g04000-OE 轉基因擬南芥PCR鑒定結果，1-25和27-31#為轉基因陽性植株; M. DNA分子量標準; P. 陽性對照; N. 陰性對照。Fig. 2　Schematic diagrams of constructed vector and PCR results of transgenic plants of Arabidopsis aldehyde reductase encoding gene At3g04000　A. Schematic diagram of the vector constructed for analyzing expression pattern of the At3g04000 gene; B. Schematic diagram of the vector constructed for analyzing subcellular of the At3g04000 gene; C. Schematic diagram of the vector for At3g04000 gene overexpression vector. D. PCR results of ProAt3g04000:GUS transgenic Arabidopsis, 1-9, 11-14 and 16 # are positive transgenic plants; M. DNA marker; P. Positive control; N. Negative control; E. PCR results of At3g04000-EGFP transgenic Arabidopsis, 1-6, 8-11 and 13-16 # are positive transgenic plants; M. DNA marker; P. Positive control; N. Negative control; F. PCR results of At3g04000-OE transgenic Arabidopsis, 1-25 and 27-31 # are positive transgenic plants; M. DNA marker; P. Positive control; N. Negative control.

圖 3　擬南芥At3g04000基因在擬南芥不同組織的表達水平　Fig. 3　Expression levels of At3g04000 gene in various Arabidopsis tissues

本研究主要構建了擬南芥醛還原酶編碼基因At3g04000的表達模式分析載體、亞細胞定位載體和過量表達載體。通過農桿菌介導的轉化方法分別獲得了轉基因的擬南芥植株。GUS染色分析和實時定量PCR檢測的結果都表明At3g04000基因在擬南芥的根部有表達。盡管At3g04000在擬南芥根部表達的水平較低，然而表達模式的分析結果卻暗示著At3g04000并不僅僅定位在葉綠體。為了確定At3g04000基因的亞細胞定位，采用酶切連接的方法將At3g04000全長基因(-927～+933)與綠色熒光蛋白(GFP)編碼基因融合構建了亞細胞定位表達載體At3g04000-EGFP。以At3g04000-EGFP轉基因擬南芥幼苗的子葉作為觀察材料分析了At3g04000亞細胞定位模式。本研究表明，At3g04000并不定位于葉綠體中，而是定位于細胞質和細胞核。

Yamauchi et al(2011)是以紫鴨跖草為材料采用瞬時表達技術證明At3g04000定位于葉綠體。他們用于亞細胞定位的表達載體中的啟動子為CaMV35S啟動子， 而且只選擇了At3g04000N 端的124個氨基酸與GFP形成融合蛋白。本研究中用于亞細胞定位分析的載體中的啟動子為At3g04000基因的自身啟動子，而且采用At3g04000完整蛋白與GFP形成融合蛋白，并以穩(wěn)定轉化的轉基因擬南芥作為觀察材料。因此，本研究中的亞細胞定位分析結果更具準確性和科學性。本研究表明，At3g04000不是擬南芥葉綠體醛還原酶(AtChlADRs)，而是擬南芥細胞質醛還原酶(ArabidopsisNADPH-dependent cytosolic ADRs, AtCytADRs)。另外，At3g04000定位于細胞核也暗示著該酶可能存在著其它的功能。

圖 4　ProAt3g04000:GUS 轉基因植株的GUS染色分析　A. 5 d齡幼苗； B. 幼苗子葉的放大圖； C. 幼苗子葉的局部放大圖，顯示保衛(wèi)細胞； D. 幼苗根部的放大圖； E. 3 d齡黑暗培養(yǎng)的幼苗子葉； F. 16 d齡的擬南芥； G. 完全伸展的蓮座葉； H. 花序； I. 花。Fig. 4　GUS staining analysis of ProAt3g04000:GUS transgenic plants　A. Five-day-old seedling; B. Magnified figure of seedling cotyledon; C. Magnified figure of seedling cotyledon, highlight the guard cells; D. Magnified figure of seedling root; E. Three-day-old seedling under dark treatment; F. Sixteen-day-old Arabidopsis; G. Fully extended rosette leaf; H. Inflorescence; I. Flower.

圖 5　At3g04000的亞細胞定位分析　A. At3g04000-綠色熒光蛋白信號； B. 葉綠體自發(fā)熒光信號； C. A和B圖疊加后圖像。Fig. 5　Aanlysis on subcellular localization of At3g04000 protein　A. Green fluorescence protein signal; B. Auto-fluorescence signal of chloroplast; C. Merged image.

圖 6　At3g04000-OE 轉基因植株中At3g04000基因的轉錄水平分析　At3g04000-OE-1#、5# 和22#為At3g04000的過量表達株系；ACTIN2作為內參基因。Fig. 6　Transcription levels of At3g04000 gene　At3g04000-OE-1#, 5# and 22# were overexpression lines of At3g04000. ACTIN2 gene was used as housekeeping gene.

為了更深入研究At3g04000的功能，本研究雖獲得了純合的At3g04000過量表達轉基因擬南芥，但在正常生長條件下過量表達植株與野生型相比未展現出明顯的區(qū)別。對于擬南芥醛還原酶編碼基因At3g04000的功能分析還需要進一步研究才能掌握該基因在植物抗逆中的作用。本文為進一步研究擬南芥醛還原酶在植物抗逆中的功能奠定了基礎。

參考文獻:

ASADA K, 1999. The water-water cycle in chloroplasts: scavenging of active oxygens and dissipation of excess photons [J]. Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 50:601-639.BOLWELL GP, BUTT VS, DAVIES DR, et al, 1995. The origin of the oxidative burst in plants [J]. Free Radic Res, 23(6):517-532.

BURCHAM PC, 1998. Genotoxic lipid peroxidation products: their DNA damaging properties and role in formation of endogenous DNA adducts [J]. Mutagenesis, 13(3):287-305.

BURCZYNSKI ME, SRIDHAR GR, PALACKAL NT, et al, 2001. The reactive oxygen species-and Michael acceptor-inducible human aldo-ketoreductase AKR1C1 reduces the α,β-unsaturated aldehyde 4-hydroacy-2-nonenal to 1, 4-dihydroxy-2-nonene [J]. J Biol Chem, 276(4):2 890-2 897.

CHEN THH, MURATA N, 2002. Enhancement of tolerance of abiotic stress by metabolic engineering of betaines and other compatible solutes [J]. Curr Opin Plant Biol, 5(3):250-257.

DICK RA, KWAK MK, SUTTER TR, et al, 2001. Antioxidative function and substrate specificity of NAD(P)H-dependent alkenal/one oxidoreductase. A new role for leukotriene B-412-hydroxydehydrogenase/15-oxoprostaglandin13-reductase [J]. J Biol Chem, 276(44):40 803- 40 810.

ESTERBAUER H, SCHAUR RJ, ZOLLNER H, 1991. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes [J]. Free Rad Biol Med, 11(1):81-128.

FATH A, BETHKE P, BELIGNI V, et al, 2002. Active oxygen and cell death in cereal aleurone cells [J]. J Exp Bot, 53(372):1 273-1 282.

HALLIWELL B, 2006. Reactive species and antioxidants. Redox biology is a fundamental theme of aerobic life [J]. Plant Physiol, 141(2):312-322.

HARTLEY DP, RUTH JA, PETERSEN DR, 1995. The hepatocellular metabolism of 4-hydroxynonenal by alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase, and glutathione S-transferase [J]. Arch Biochem Biophys, 316(1):197-205.

JACKSON PAP, GALINHA CIR, PEREIRA CS, et al, 2001. Rapid deposition of extensin during the elicitation of grapevine callus cultures is specifically catalyzed by a 40-kilodalton peroxidase [J]. Plant Physiol, 127(3):1 065-1 076.

KOLB NS, HUNSAKER LA, VANDERJAGT DL, 1994. Aldose reductase-catalyzed reduction of acrolein: implications in cyclophosphamide toxicity [J]. Mol Pharmacol, 45(4):797-801.

LI BB, ZHAO Q, ZHANG LF, 2005. Active oxygen and protein oxidative damage [J]. J Pingdingshan Inst of Technol, 14(5):16-17,30. [李冰冰，趙倩，張龍富，2005. 活性氧與蛋白質氧化損傷 [J]. 平頂山工學院學報，14(5)：16-17,30.]LIN ZF, LIU N, 2012. Research progress in the control and regulation of plant growth and development by reactive oxygen species [J]. Chin Bull Bot, 47(1):74-86. [林植芳，劉楠，2012. 活性氧調控植物生長發(fā)育的研究進展 [J]. 植物學報，47(1)：74-86.]

MANO J, BELLES-BOIX E, BABIYCHUK E, et al, 2005. Protection against photooxidative injury of tobacco leaves by 2-alkenal reductase.Detoxication of lipid peroxide-derived reactive carbonyls [J]. Plant Physiol, 139(4):1 773-1 783.MILLAR AH, LEAVER CJ,2000. The cytotoxic lipid peroxidation product, 4-hydroxy-2-nonenal, specifically inhibits decarboxylating dehydrogenases in the matrix of plant mitochondria [J]. FEBS Lett, 481(2):117-121.POTIKHA TS, COLLINS CC, JOHNSON DI, et al, 1999. The involvement of hydrogen peroxide in the differentiation of secondary walls in cotton fibers [J]. Plant Physiol, 119(3):849-858.SELLIN S, HOLMQUIST B, MANNERVIK B, et al, 1991. Oxidation and reduction of 4-hydroxyalkenals catalyzed by isozymes of human alcohol dehydrogenase [J]. Biochemistry, 30(9):2 514-2 518.

THANNICKAL VJ, FANBURG BL,2000. Reactive oxygen species in cell signaling [J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 279(6):1 005-1 028.

TIAN M, RAO LB, LI JY, 2005. Reactive oxygen species (ROS) and its physiological functions in plant cells [J].Plant Physiol Comm, 41(2):235-241. [田敏，饒龍兵，李紀元，2005. 植物細胞中的活性氧及其生理作用 [J]. 植物生理學通訊，41(2)：235-241.]

UCHIDA K, 2003. 4-Hydroxy-2-nonenal: a product and mediator of oxidative stress[J]. Prog Lipid Res, 42(4):318-343.

WU X, WANG SW, CAO D, et al, 2015. Influence of overexpression of 2-alkenal reductase gene on drought resistance in tobacco [J].Acta Bot Boreal-Occident Sin, 35(6):1 166-1 172. [吳茜， 王仕穩(wěn)，曹丹，等，2015. 超表達擬南芥2-烯醛還原酶基因對煙草抗旱性的作用機理分析 [J]. 西北植物學報，35(6)：1 166-1 172.]

XUE X, ZHANG Q, WU JX, 2013. Research of reactive oxygen species in plants and its application on stress tolerance [J]. Biotechnol Bull, (10):6-11. [薛鑫，張芊，吳金霞， 等，2013. 植物體內活性氧的研究及其在植物抗逆方面的應用 [J]. 生物技術通報，0(10)：6-11.]

YAMAUCHI Y, FURUTERA A, SEKI K, et al, 2008. Malondialdehyde generated from peroxidizedlinolenic acid causes protein modification in heat-stressed plants [J]. Plant Physiol Biochem, 46(8-9):786-793.YAMAUCHI Y, HASEGAWA A, TANINAKA A, et al, 2011. NADPH-dependent reductases involved in the detoxification of reactive carbonyls in plants [J]. J Biol Chem, 286(9):6 999-7 009.YAMAUCHI Y, SUGIMOTO Y, 2010. Effect of protein modification by malondialdehyde on the interaction between the oxygen-evolving complex 33 kDa protein and photosystem II core proteins [J]. Planta, 231(5):1 077-1 088.

YIN LN, MANO J, WANG SW, et al, 2010. The involvement of lipid peroxide-derived aldehydes in aluminum toxicity of tobacco roots [J]. Plant Physiol, 152(3):1 406-1 417.

ZHANG HL, SHANG C, LI JK, et al, 2010. Studies on transformation of aldehyde dehydrogenase (ALDH) into tomato [J]. Chin Agric Sci Bull, 26(13):23-29. [張海玲，尚晨， 李佶愷，等，2010. 乙醛脫氫酶基因(ALDH)轉化番茄的研究 [J]. 中國農學通報，26(13)：23-29.]

ZHANG WL, WEI LQ, WANG LS, et al, 2000. Oxidative damage of active oxygen on biomacromolecules [J]. J Henan Norm Univ: Nat Sci Ed, 28(4):69-71. [張文玲，魏麗勤，王林嵩，等，2000. 活性氧對生物大分子的氧化性損傷 [J]. 河南師范大學學報· 自然科學版，28(4)：69-71.]

Expression pattern analysis ofArabidopsisaldehyde reductase encoding gene At3g04000 and generation of overexpression plants

BAO Shu-Guang, WEI Qing-Qing, LIU Zhi-Kang, NIE Xiang, MEN Shu-Zhen*

(DepartmentofPlantBiologyandEcology,CollegeofLifeSciences,NankaiUniversity, Tianjin 300071, China )

Abstract:Reactive aldehyde, especially α,β-unsaturated aldehyde compounds are toxic to plant cells. Therefore, elimination of α,β-unsaturated aldehyde compounds is vital for plant cells to maintain normal life activities. In previous reports, the Arabidopsis At3g04000 gene was identified as encoding a NADPH-dependent chloroplastic aldehyde reductases (AtChlADRs) by enzyme activity assay in vitro and subcellular localization analyse in spiderwort cells. And it was proposed to play important role in scavenging α,β-unsaturated aldehydes with more than 5 carbons (C≥5) in chloroplasts. To further analysis the roles of At3g04000 gene, we generated transgenic Arabidopsis plants expressing a ProAt3g04000:GUS for analysis of its expression pattern, a At3g04000-EGFP translational fusion for subcellular localization analysis, and 35S:At3g04000 for overexpression of At3g04000 gene. We also used quantitative real time PCR to investigate the transcription of At3g04000 gene during the developmental process of Arabidopsis. The results showed that the transcription of At3g04000 gene was detected in all examined tissues. The highest transcription level of At3g04000 gene was detected in Arabidopsis seedlings, relative high level of At3g04000 gene transcripts were also detected in rosette leaf, cauline leaf, inflorescence and silique, while in root and stem the transcription level of At3g04000 gene was very weak. The results of GUS staining in ProAt3g04000: GUS transgenic Arabidopsis plants were in consistency with the results of the quantitative real time PCR analysis. Strong GUS staining was found in vascular tissues and guard cells of cotyledon, rosette leaf and sepal, and weak GUS staining was found in vascular tissues of root. To analyze the subcellular localization of the At3g04000 gene encoded protein, the At3g04000-EGFP transgenic Arabidopsis seedling was observed by confocal microscopy. The results showed that At3g04000 gene encoded protein was not localized in chloroplast, but localized in cytoplasm and nucleus. This study provides tools for further study of the roles of At3g04000 gene in Arabidopsis.

Key words:Arabidopsis, α,β-unsaturated aldehyde, aldehyde reductase, At3g04000, expression pattern, overexpression

DOI:10.11931/guihaia.gxzw201601028

收稿日期:2016-01-18修回日期：2016-03-04

基金項目：國家自然科學基金(31570247, 91417308, 91017009, 31460453)；天津市自然科學基金(12JCZDJC23200)；國家基礎學科人才培養(yǎng)基金南開大學生物學人才培養(yǎng)基地(J1103503) [Supported by the National Science Foundation of China (31570247, 91417308, 91017009, 31460453); the Natural Science Foundation of Tianjin (12JCZDJC23200); Funds for National Basic Science Personnel Training (J1103503)]。

作者簡介：包曙光(1985-)，男(蒙古族)，內蒙古通遼市人，博士研究生，主要從事植物分子生物學研究，(E-mail) mindaguang3906@126.com。 *通訊作者：門淑珍，博士，教授，博士生導師，主要從事植物固醇的研究，(E-mail) shuzhenmen@nankai.edu.cn。

中圖分類號：Q943.2

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142(2016)06-0698-09

包曙光，魏情情，劉智康，等. 擬南芥醛還原酶編碼基因At3g04000表達模式分析及過量表達轉基因植株獲得 [J]. 廣西植物， 2016， 36(6)：698-706

BAO SG, WEI QQ, LIU ZK， et al. Expression pattern analysis ofArabidopsisaldehyde reductase encoding gene At3g04000 and generation of overexpression plants [J]. Guihaia， 2016， 36(6)：698-706