福建部分地區(qū)人和動(dòng)物嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體基因檢測(cè)和序列分析

肖方震，李丹萍，徐國(guó)英，陳　陽(yáng)，鄧艷琴

?

福建部分地區(qū)人和動(dòng)物嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體基因檢測(cè)和序列分析

肖方震1，李丹萍2，徐國(guó)英1，陳陽(yáng)1，鄧艷琴1

1.福建省疾病預(yù)防控制中心，福建省人獸共患病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州350001；2.福建醫(yī)科大學(xué)，福州350004

摘要：目的了解福建省人和動(dòng)物嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體的感染狀況以及基因特征。方法收集永春縣和上杭縣高危人群、家畜的全血，采用巢式PCR擴(kuò)增無(wú)形體16S rRNA片段, PCR產(chǎn)物純化測(cè)序并與序列比對(duì)分析。結(jié)果永春縣牛的無(wú)形體感染率最高為53.85%，羊、狗無(wú)形體感染率分別為24.71%和12.50%。上杭縣羊的無(wú)形體感染率為53.06%，高危人群的無(wú)形體感染率為8.33%。無(wú)形體基因序列與相應(yīng)的參考序列同源性均達(dá)97%～100%。結(jié)論福建省人和動(dòng)物存在嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體感染。

關(guān)鍵詞：無(wú)形體；巢式PCR；16S rRNA；序列分析

Supported by the Subject of Medical Innovation of Fujian Province(No.2012-CXB-12)

人粒細(xì)胞無(wú)形體病(Human Granulocytic Anaplasmosis，HGA)是由嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體(Anaplasmaphagocytophilum) 引起的一種經(jīng)蜱傳播的自然疫源性疾病，臨床表現(xiàn)以發(fā)熱伴白細(xì)胞和血小板減少為主，嚴(yán)重者可進(jìn)展為多臟器功能衰竭、大出血及繼發(fā)感染[1-2]。

福建省森林資源豐富，蜱蟲種類繁多，獨(dú)有地理特征及氣候條件易于蜱傳疾病的傳播，如不注意，人群極易被感染。為了解我省嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體感染情況，根據(jù)我省蜱類分布狀況的歷史資料，選擇位于戴云山脈的永春縣、武夷山脈和博平嶺山脈的上杭縣，對(duì)這兩個(gè)地區(qū)無(wú)形體部分儲(chǔ)存宿主以及高危人群的感染情況進(jìn)行的調(diào)查研究。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源2011—2014年期間我們?cè)诟＝ㄊ∮来嚎h分別采集了65份牛、85份羊和56份狗的全血樣本，同時(shí)在上杭縣采集98份羊及48份林區(qū)工作人員等高危人群的全血樣本，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2DNA提取使用血液基因組DNA提取試劑盒(泰京生物)提取所采集樣本的DNA，所有步驟按照其說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3引物根據(jù)國(guó)家《人粒細(xì)胞無(wú)形體病預(yù)防控制技術(shù)指南(試行)》合成無(wú)形體引物(見表1)，引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。其中Eh-out1、Eh-out2為無(wú)形體16SrRNA基因的外側(cè)引物，HGA1和HGA2為內(nèi)側(cè)引物。

表1　無(wú)形體16S rRNA基因的引物

1.4PCR擴(kuò)增先用外側(cè)引物Eh-out1和Eh-out2進(jìn)行擴(kuò)增，PCR第1輪擴(kuò)增反應(yīng)體系中，含有Premix Taq酶12.5 μL、上下游引物各10 μmol/L、DNA模板5 μL，加無(wú)菌去離子水至總體積25 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min后以94 ℃變性45 s、55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min、循環(huán)40次， 72 ℃總延伸5 min。第2輪反應(yīng)使用內(nèi)側(cè)引物HGA1和HGA2進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系Premix Taq酶12.5 μL、上下游引物20 μmol/L、第1輪產(chǎn)物0.5 μL，加無(wú)菌去離子水至總體積25 μL。反應(yīng)程序除循環(huán)次數(shù)為35次，其余同第1輪擴(kuò)增條件。首份PCR陽(yáng)性標(biāo)本送上海生工生物技術(shù)公司測(cè)序，經(jīng)序列比對(duì)，確定為嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體，其后的標(biāo)本檢測(cè)以此作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.5產(chǎn)物檢測(cè)取3 μL的第2輪產(chǎn)物點(diǎn)樣于1.5%的瓊脂糖80 V凝膠電泳45 min，凝膠呈像系統(tǒng)觀察結(jié)果。隨機(jī)選取陽(yáng)性標(biāo)本純化后送上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6序列分析測(cè)得的序列登陸美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)。序列分析采用BioEdit、MEGA5.1等軟件。

2結(jié)果

2.1巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果無(wú)形體16S rRNA經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增得到389 bp左右的片段(見圖1)，這與預(yù)期的目標(biāo)條帶相符。本次調(diào)查采集福建上杭縣高危人群全血樣本48份，結(jié)果顯示無(wú)形體陽(yáng)性4份，陽(yáng)性率為8.33%。同時(shí)我們也對(duì)這兩個(gè)地區(qū)動(dòng)物感染無(wú)形體進(jìn)行了檢測(cè)分析，結(jié)果見表2。

M為marker(DL2000);1-9為無(wú)形體陽(yáng)性標(biāo)本;N為陰性對(duì)照

結(jié)果表明永春縣家畜動(dòng)物中，牛的無(wú)形體感染率最高為53.85%，其次為羊的感染率為24.71%，狗的感染率最低為12.50%。上杭縣羊無(wú)的形體感染率為53.06%。上杭縣羊的無(wú)形體感染率明顯高于永春縣(χ2= 15.26，P<0.05)。

2.2序列分析我們將測(cè)序的無(wú)形體陽(yáng)性的樣本進(jìn)行同源性分析(見表3)。結(jié)果顯示幾個(gè)樣本的同源性在97%～100%之間。其中上杭縣羊血樣本(SSH068y、SSH031y)、永春縣羊血樣本(SYC001y)以及上杭縣人血樣本(SH028)的無(wú)形體基因序列完全相同，同源性達(dá)到100%。永春縣牛血樣本(SYC002n、SYC095n)序列與羊血樣本的同源性均達(dá)到了98%。但永春地區(qū)的兩份牛的樣本的序列同源性最低為97%。

表2　人、動(dòng)物感染無(wú)形體檢測(cè)結(jié)果

表3　部分無(wú)形體陽(yáng)性樣本基因序列同源性分析

同時(shí)，我們登陸GenBank進(jìn)行Blast同源性比對(duì)，結(jié)果表明本次采集的人及動(dòng)物血樣所攜帶的無(wú)形體，其16S rRNA核酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已注冊(cè)的對(duì)應(yīng)核酸序列具有高度的相似性。其中本次采集羊血樣標(biāo)本SYC001y、SSH068y、SSH031y，人血樣標(biāo)本SH028均與在浙江省無(wú)形體序列(GenBank No.GQ500062)相似度均為100%。SYC002n牛血樣本與北京、新疆等地發(fā)現(xiàn)的無(wú)形體序列(GenBank No.GQ499987、GQ900613)相似度為100%。

我們選取GenBank中國(guó)內(nèi)外多地的無(wú)形體的序列與本實(shí)驗(yàn)測(cè)序樣本一起構(gòu)建世系樹狀圖。采用的是鄰位相連法(Neighbor-joining)構(gòu)建樹狀圖(見圖2)圖中看見羊血樣標(biāo)本SYC001y、SSH068y、SSH031y，人血樣標(biāo)本SH028與浙江省的無(wú)形體序列在同一個(gè)分支，永春的牛血樣標(biāo)本SYC095n相對(duì)獨(dú)立，SYC002n與北京、新疆和浙江等地區(qū)的序列較為接近，同時(shí)我們將序列與韓國(guó)、波蘭和突尼斯等國(guó)家的分離株序列進(jìn)行比對(duì)，樹狀圖顯示這些國(guó)家的分離株序列與我省無(wú)形體序列相差較遠(yuǎn)。

圖2　嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體16s rRNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

Fig.2Phylogenetic tree based on partial 16s rRNA sequences of A. phagocytophilum

3討論

永春縣位于福建的東南部，西部系戴云山脈主體部分，上杭縣地處武夷山脈南麓和博平嶺山脈之間，兩地均屬于亞熱帶氣候，森林資源豐富，蜱蟲種類繁多，兩地的地理特征和氣候特別適合包括無(wú)形體病在內(nèi)的蜱傳疾病傳播。無(wú)形體病作為新發(fā)傳染病，近年日益受到重視。我國(guó)已陸續(xù)從新疆、安徽和浙江等地宿主動(dòng)物和蜱蟲上檢測(cè)出人粒細(xì)胞無(wú)形體[3-8]。其宿主包括白足鼠、山羊、綿羊等家畜動(dòng)物。本研究采集了永春縣、上杭縣的牛、羊和狗的血液以及高危人群中血液進(jìn)行調(diào)查。結(jié)果表明上杭縣羊的無(wú)形體感染率為53.06%，永春縣牛、羊和狗無(wú)形體感染率分別為53.85%、24.71%和12.50%，高危人群中無(wú)形體感染率為8.33%。認(rèn)為我省可能存在無(wú)形體病的自然疫源地，動(dòng)物是我省無(wú)形體的重要宿主，且感染率不低。這為我省今后開展無(wú)形體病的研究提供了重要的基礎(chǔ)。目前相關(guān)病原的分離工作陸續(xù)在開展。本研究結(jié)果也顯示隨著經(jīng)濟(jì)建設(shè)、旅游業(yè)的發(fā)展等因素的影響，我省部分人群存在一定的感染情況，推測(cè)部分的不明原因發(fā)熱的病人可能就是感染無(wú)形體。而對(duì)于兩個(gè)地區(qū)羊的無(wú)形體感染率差異，提示羊的無(wú)形體感染可能存在地區(qū)分布差異。但由于樣本量有限，需要我們進(jìn)一步擴(kuò)大采集范圍以及加大樣本量來(lái)進(jìn)一步分析。另外測(cè)序的結(jié)果顯示隨著地理距離的增加無(wú)形體序列的差異加大，我省無(wú)形體的序列與國(guó)內(nèi)的省份特別是臨近的省份如浙江省的無(wú)形體序列接近，而與韓國(guó)、波蘭和突尼斯等國(guó)家的分離株序列差異較大。

加強(qiáng)對(duì)蜱傳疾病的流行病學(xué)調(diào)查，確定宿主動(dòng)物、蜱以及高危人群的感染情況，對(duì)于我們了解蜱傳疾病的宿主種類、分布以及人群感染情況有著重要價(jià)值，是我省預(yù)防和控制蜱傳自然疫源疾病的基礎(chǔ)，福建處于東南沿海，有著適宜蜱傳疾病存在的地理特征，同時(shí)隨著對(duì)外經(jīng)濟(jì)交流頻繁，人們生產(chǎn)生活活動(dòng)的增加，資源的開發(fā)利用及旅游業(yè)的迅速發(fā)展，人類和蜱的接觸機(jī)會(huì)日益增加，因此加強(qiáng)無(wú)形體病的防控是很有必要的。

參考文獻(xiàn)：

[1]Dumler JS. Anaplasma and Ehrlichia infection[J].Ann N Y Aead Sci, 2005, 1063(12): 361-373.

[2]Chen SM, Dumler JS, Bakken JS, et al. Identification of agranulocytotropicEhrlichiaspecies as the etiologic agent of human disease[J]. J Clin Microbiol, 1994, 32(3): 589-595.

[3]Jiang LP, Zheng SG, Wang ZG, et al. Detection and sequence analysis ofEhrlichiaandAnplasmaDNA from rats in Jindong District[J]. Zhejiang Prev Med, 2008, 20(1): 1-3,6. (in Chinese)

姜理平,鄭壽貴,王志剛,等.金東區(qū)鼠類檢出埃立克體及無(wú)形體DNA 片斷[J].浙江預(yù)防醫(yī)學(xué),2008,20(1):1-3,6.

[4]Bian CL, Gong ZD, Zhang LY, et al. Identification ofAnaplasmaphagocytophilumin small mammals from Hengduan Mountains of Southwest China[J]. Chin J Epidemiol, 2009, 30(12): 1277-1280. (in Chinese)

邊長(zhǎng)玲,龔正達(dá),張麗云,等.中國(guó)西南橫斷山區(qū)小型獸類嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體基因的檢測(cè)及序列測(cè)定[J].中華流行病學(xué)雜志,2009,30(12):1277-1280.

[5]Zhan L, Cao WC, Jiang JF, et al.Anaplasmaphagocytophiluminlivestock and small rodents[J]. Vet Microbiol, 2010, 144(3-4): 405-408.

[6]Shi YL, Wang SW, Hu WF, et al. Genetic identification and sequence analysis of the 16S rRNA Genes ofAnaplasmaphagocytophilumin Anhui Province，China[J]. Anhui J Prev Med, 2013, 19(5): 329-338. (in Chinese)

史永林，王誓聞，胡萬(wàn)富，等.安徽地區(qū)家畜嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體16S rRNA 基因檢測(cè)和序列分析[J].安徽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2013，19(5)：329-338.

[7]Zhao QL, Huang L, Yang X, et al. 16srRNA sequence analysis ofAnaplasmaandEhrlichiain rodents from parts area of Xinjiang[J]. Chin J Zoonoses, 2013, 29(8): 743-747. (in Chinese)

趙慶亮，黃林，楊霞,等. 新疆部分地區(qū)鼠類無(wú)形體和埃立克體的調(diào)查及16srRNA序列分析[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2013,29(8):743-747.

[8]Zheng BF, Ying KM, Zhang MT, et al. Investigation forAnaplasmaphagocytophiluminfection in rodents in Pan’an region, Zhejiang Province[J]. Chin J Zoonoses, 2013, 29(3): 274-277. (in Chinese)

鄭柏福，應(yīng)凱滿，張孟田,等. 浙江磐安地區(qū)嚙齒動(dòng)物嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體感染研究[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2013,29(3):274-277.

DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.03.010

通訊作者：鄧艷琴，Email：fjcdcdyq@163.com

中圖分類號(hào)：R372

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-2694(2016)03-0262-04

Corresponding author:Deng Yan-qin, Email: fjcdcdyq@163.com

收稿日期：2015-06-25；修回日期:2015-10-19

Genetic identification and sequene analysis for high-risk group and animals of Anaplasma phagocytophilum infection in some areas of Fujian Province,China

XIAO Fang-zhen1,LI Dan-ping2,XU Guo-ying1,CHEN-Yang1,DENG Yan-qin1

(1.FujianCenterforDiseaseControlandPrevention/FujianPriorityLaboratoryforZoonoses,Fuzhou350001,China;2.FujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China)

Abstract:To explore the nature infection and gene characteristics of Anaplasma phagocytophilum (A.phagocytophilum) in high-risk groups and animals of Fujian Province, China, blood samples from high-risk groups and animals were collected in Yongchun and Shanghang regions, for which nest polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify the fragments of 16s rRNA gene of A. phagocytophilum. In addition, the positive PCR products were sequenced and compared with the corresponding sequences acquired by biological analysis software. The infection rate of ox, goats and dogs in Yongchun region were determined to be 53.85%, 24.71% and 12.50%, and the infection rates of goats and high-risk groups in Shanghang region were 53.06% and 8.33%, respectively. The nucleotide sequence homologies of partial 16s rRNA gene for both the objective and reference sequences concurrently reached up to 97%-100%. It was concluded that A. phagocytophilum was found in some regions of Fujian Province and it should be paid more attention in the following years.

Keywords:Anaplasma phagocytophilum; nested PCR; 16S rRNA; sequence analysis

福建省醫(yī)學(xué)創(chuàng)新課題(No.2012-CXB-12)資助