胡　藝，方　瑤，毛旭虎

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類鼻疽伯克霍爾德菌胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白BimA的生物學(xué)特性研究進(jìn)展

胡藝，方瑤，毛旭虎

第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系臨床微生物及免疫學(xué)教研室，重慶400038

摘要：類鼻疽伯克霍爾德菌是一種熱帶醫(yī)學(xué)病原體，現(xiàn)被美國CDC提升為I類致病菌嚴(yán)加防范。類鼻疽伯克霍爾德菌所導(dǎo)致的疾病稱為類鼻疽，致死率和復(fù)發(fā)率都很高，廣泛流行于東南亞及我國南海周邊地區(qū)，已成為嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題。作為一種兼性胞內(nèi)菌，類鼻疽伯克霍爾德菌的胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)能力為其逃逸機(jī)體免疫和細(xì)胞間的擴(kuò)散提供了重要基礎(chǔ)。胞內(nèi)動(dòng)力相關(guān)蛋白A(BimA)是一種類鼻疽菌自分泌的、與其胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)相關(guān)的關(guān)鍵分子，它通過操控肌動(dòng)蛋白實(shí)現(xiàn)干預(yù)細(xì)菌的胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)，在類鼻疽菌的感染和致病中發(fā)揮著重要作用。全面、深入地了解BimA在類鼻疽菌感染中的作用機(jī)制對尋找有效預(yù)防和控制該病原的傳播等方面具有重要意義。本文即綜述了BimA蛋白的生物學(xué)特性分析，結(jié)合研究報(bào)道探討其主導(dǎo)細(xì)菌胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)、干擾宿主胞內(nèi)免疫、實(shí)現(xiàn)細(xì)菌胞間傳播的機(jī)制及意義。

關(guān)鍵詞：類鼻疽伯克霍爾德菌(類鼻疽菌)；BimA；肌動(dòng)蛋白

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類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderiapseudomallei)，簡稱類鼻疽菌，是一種革蘭陰性桿菌，兼性胞內(nèi)寄生，廣泛分布于澳洲北部、東南亞和我國的海南、福建和廣東等地。該菌主要存在于疫源地的水或土壤中，極易感染機(jī)體和在環(huán)境中傳播[1]。類鼻疽菌隸屬伯克霍爾德菌屬，其同屬常見的還有致病的鼻疽伯克霍爾德菌(B.mallei)和不致病的洋蔥伯克霍爾德菌(B.cepacia)[2]。類鼻疽菌導(dǎo)致的疾病稱類鼻疽(melioidosis)，是一種熱帶疾病，死亡率達(dá)40%，復(fù)發(fā)率在20%以上，目前已成為全球的一個(gè)重要公共衛(wèi)生問題[3]。類鼻疽發(fā)病一般為散發(fā)且因可長期潛伏感染或僅為輕型病例，故發(fā)病無明顯季節(jié)性?；颊叨嗯c接觸流行區(qū)含有本菌的水和土壤有關(guān)。農(nóng)民、軍人、礦工、探險(xiǎn)者和疫區(qū)原居民是類鼻疽的高危人群?；颊叩拿庖郀顟B(tài)會(huì)影響疾病初期和隨后的病程。由于它的臨床表現(xiàn)多種多樣被比作“高超的模仿者”。急性類鼻疽的死亡率達(dá)90%，慢性主要以臟器炎性瘤為主。急性型類鼻疽一般潛伏期4～5 d，常有嚴(yán)重寒戰(zhàn)、高熱、咳嗽、咯血等癥狀，多因敗血病死亡，亞急性多為局部癥狀，呼吸道癥狀，深部臟器膿腫也很常見；以上表現(xiàn)可轉(zhuǎn)為慢性，而且與其他菌引起的這類疾病難以區(qū)別，常因誤診延誤治療。由于各級(jí)診斷條件限制以及臨床醫(yī)生對該病陌生，臨床診斷極難。由于類鼻疽菌有天然的耐藥性，且耐藥程度又因菌株不同而異，給臨床治療帶來了極大的困難[4]。

類鼻疽菌具有入侵宿主細(xì)胞和逃離吞噬體的能力。已有文獻(xiàn)表明，宿主細(xì)胞里的類鼻疽菌及其同屬的鼻疽伯克霍爾德菌和伯克霍爾德菌均能夠誘導(dǎo)宿主肌動(dòng)蛋白為主要媒介的胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)，通過不同的肌動(dòng)蛋白的聚合機(jī)制介導(dǎo)其在胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)和播散。這些與其自分泌的特殊功能蛋白BimA(Burkholderiaintracellular motilityA，BimA)密切相關(guān)[5]。鑒于類鼻疽菌的特殊性、流行的嚴(yán)峻性及對胞內(nèi)重要病原免疫逃逸機(jī)制了解的必要性，充分認(rèn)識(shí)BimA的生物學(xué)功能、作用機(jī)制，對我們進(jìn)一步研究該菌的胞內(nèi)感染機(jī)制和靶向疫苗的抗原篩選都有重要的理論指導(dǎo)意義。本文將從BimA的發(fā)現(xiàn)、蛋白結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能等幾個(gè)方面進(jìn)行綜述，并結(jié)合本室的研究進(jìn)行小結(jié)和探討。

1BimA的發(fā)現(xiàn)

類鼻疽菌能侵入幾乎所有宿主細(xì)胞，同時(shí)還能快速地逃離吞噬體或其它的束縛其增殖的模性結(jié)構(gòu)，最終進(jìn)入胞漿實(shí)現(xiàn)快速增殖和播散[6]，而類鼻疽菌的毒力因子在該菌的致病中發(fā)揮著重要作用。類鼻疽菌毒力因子眾多，包括莢膜多糖、菌毛、鞭毛、脂多糖、群體感應(yīng)分子、分泌系統(tǒng)、毒素BLF1以及介導(dǎo)其胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)的蛋白等[7]。近年來，隨著類鼻疽菌全基因組測序工作的進(jìn)展以及生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展，類鼻疽菌毒力因子的預(yù)測、分析和研究得到了極大的促進(jìn)，但認(rèn)清各個(gè)毒力因子在病原菌的感染機(jī)制中的作用和具體功能仍是一大難題[8]。2005年Stevens MP等通過對類鼻疽菌進(jìn)行基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)類鼻疽菌能夠自主分泌一種富含脯氨酸的蛋白即BimA(Burkholderiaintracellular motilityA，BimA)。BimA是一種自轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體，呈三聚體功能結(jié)構(gòu)，與福氏志賀菌自分泌的ISCA/VirG蛋白有一定的氨基酸序列相似性。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)它的羧基端保留有一段信號(hào)肽(signal peptide，SP)，而氨基末端暴露在細(xì)菌的外膜表面[5]。為了有助于胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)，類鼻疽菌BimA模擬宿主Arp2/3激活劑或Ena/VASP肌動(dòng)蛋白聚合酶實(shí)現(xiàn)激活宿主肌動(dòng)蛋白的聚合促成肌動(dòng)蛋白介導(dǎo)的伸縮運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而推動(dòng)細(xì)菌穿過宿主細(xì)胞膜擴(kuò)散到胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)免疫逃逸[9-10]。

2BimA蛋白結(jié)構(gòu)

BimA由類鼻疽菌BPSS1492基因編碼，該基因位于類鼻疽菌的2號(hào)染色體上.bimA全長1 780 bp。BimA是一個(gè)假定的自分泌蛋白，由529個(gè)氨基酸組成。其一級(jí)結(jié)構(gòu)如圖1所示。該蛋白編碼的主要基序包括：NIPV基序(NIPVPPPMPGGGA重復(fù)序列)，PRM1(Proline rich motif 1,富含脯氨酸基序)，WH2基序(WASP homology domain 2)和PDAST(預(yù)測假定酪氨酸蛋白激酶2磷酸化位點(diǎn)重復(fù)序列) 。在其C-末端位置上還有一個(gè)假設(shè)的橫跨膜錨點(diǎn)TM。這個(gè)區(qū)域跟小腸耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica)粘附素YadA氨基酸羧基端序列相似[6]。YadA的羧基端上包含了9個(gè)可以改變疏水性的氨基酸通常以苯丙氨酸或色氨酸結(jié)尾。這些氨基酸在革蘭氏陰性菌的外膜組成了特定的基序，對寡聚化起著重要作用[11]

先前研究認(rèn)為BimA含有兩個(gè)WH2基序，序列不同但在特定位置上堿基一致，這表明肌動(dòng)蛋白單體結(jié)合WH2區(qū)域中關(guān)鍵殘基的重要性。2015年，Erin LB等在研究BimA蛋白結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上提出了新的見解。BimA結(jié)構(gòu)中包含3個(gè)WH2，每個(gè)WH2由大約35個(gè)氨基酸組成。通過丙氨酸替代保守的LKKT基序上的兩個(gè)特征序列實(shí)驗(yàn)確定3個(gè)WH2都能與肌動(dòng)蛋白結(jié)合。進(jìn)一步通過肌動(dòng)蛋白聚合裝配實(shí)驗(yàn)研究3個(gè)不同的WH2突變株只有W1和W2具有肌動(dòng)蛋白成核的能力而W3沒有作用。這推翻了先前一些研究表明蛋白結(jié)構(gòu)上只有2個(gè)WH2的結(jié)論。同時(shí)作者在氨基酸430-470的位置上又發(fā)現(xiàn)了對細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)效率有重要作用的三聚化卷曲尾巴[12]。這使我們更加清楚地了解了該蛋白結(jié)構(gòu)并且得到一致性提示BimA可能與蛋白運(yùn)動(dòng)有著密切的關(guān)系。

圖1　類鼻疽菌BimA的結(jié)構(gòu)模式圖

Fig.1Domain schematics of BimA from Burkholderia pseudomallei

3BimA的生物學(xué)功能

類鼻疽菌的運(yùn)動(dòng)包括胞內(nèi)和胞外兩種形式。胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)通常是細(xì)菌體內(nèi)某些蛋白分子形成的肌動(dòng)蛋白尾提供動(dòng)力，而鞭毛和菌毛等結(jié)構(gòu)主要介導(dǎo)細(xì)菌的胞外運(yùn)動(dòng)。前者無疑是關(guān)乎胞內(nèi)菌致病機(jī)制的關(guān)鍵，也是類鼻疽菌胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)的重要研究熱點(diǎn)。正如1990年發(fā)現(xiàn)的胞內(nèi)細(xì)菌病原李斯特氏菌和福氏志賀菌那樣，它們通過自身分泌的蛋白來招募宿主體內(nèi)的單體肌動(dòng)蛋白，推動(dòng)細(xì)菌穿過胞膜。WASP家族蛋白可以激活A(yù)rp2/3復(fù)合體，影響下游肌動(dòng)蛋白聚集[13]。李斯特氏菌分泌蛋白ActA是WASP家族蛋白的一員[14]。福氏志賀菌的外膜蛋白IcsA/VirG11也能與N-WASP發(fā)生相互作用。立克次氏體在早期感染中也能分泌RickA蛋白模擬WASP家族蛋白招募Arp2/3誘導(dǎo)宿主肌動(dòng)蛋白聚集，使細(xì)菌產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)能力[15]。

Benanti EL等通過進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)，包括BimA蛋白的體外測定、突變分析、分子聚合動(dòng)態(tài)分析(共聚焦方法)和噬斑實(shí)驗(yàn)，分析類鼻疽菌如何實(shí)現(xiàn)對宿主肌動(dòng)蛋白的聚集、宿主細(xì)胞間的融合和最終從一個(gè)受感染的宿主細(xì)胞擴(kuò)散到附近的其它細(xì)胞。他們發(fā)現(xiàn)在感染期間細(xì)菌的BimA需要一個(gè)或多個(gè)WH2基序來引導(dǎo)宿主肌動(dòng)蛋白運(yùn)動(dòng)和融合。WH2基序則激活Ena/VASP復(fù)合體，Ena/VASP寡聚體化促使宿主肌動(dòng)蛋白成核。伯克霍爾德菌(B.thailandensis)的BimA只有在Arp2/3存在的情況下才能聚合宿主肌動(dòng)蛋白。而類鼻疽菌和鼻疽菌的BimA蛋白則不依耐于Arp2/3即可聚合肌動(dòng)蛋白并在聚合時(shí)解離CapZ蛋白，去除其抑制聚合的能力。同時(shí)，通過三聚體結(jié)構(gòu)形成更為致密的絲狀結(jié)構(gòu)。

綜上所述，自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BimA促使宿主肌動(dòng)蛋白為主的運(yùn)動(dòng)以及宿主細(xì)胞融合及傳播。BimA同系物模擬不同宿主肌動(dòng)蛋白聚合：類鼻疽菌BimA能插入外膜將N末端伸到細(xì)菌外，雖沒有Arp2/3，類鼻疽BimA仍舊能與帶鉤尾結(jié)合使宿主肌動(dòng)蛋白成核和讓其纖維加長、成束成為其擴(kuò)散的動(dòng)力；鼻疽菌BimA利用僅有的一個(gè)WH2基序以同樣的機(jī)制

圖2　細(xì)菌的肌動(dòng)蛋白運(yùn)動(dòng)機(jī)制示意圖

形成成束纖維；而伯克霍爾德菌BimA必須激活宿主Arp2/3復(fù)合物從而使宿主肌動(dòng)蛋白聚集成核。通過比較伯克霍爾德菌、鼻疽菌和類鼻疽菌三者形成的肌動(dòng)蛋白尾發(fā)現(xiàn)：伯克霍爾德菌的肌動(dòng)蛋白尾是彎曲的，其它兩個(gè)都是直的[12]。雖然它們屬于同一菌屬，具有相似的BimA蛋白序列、類似的肌動(dòng)蛋白成核能力，但是具體BimA蛋白介導(dǎo)細(xì)菌的胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)機(jī)制又不一樣。BimA不同聚合機(jī)制使之有不同的肌動(dòng)蛋白聚集方式和運(yùn)動(dòng)，這是影響感染的重要因素。(見圖2)

4結(jié)語

類鼻疽高發(fā)于東南亞、澳大利亞北部、印度次大陸和中國南部等地。類鼻疽同時(shí)也在西半球蔓延。它在西半球的流行區(qū)域主要在波多黎各和巴西，散發(fā)病例則在美洲中部、南美洲和加勒比海的部分區(qū)域。類鼻疽在美國的病例很少，每年只有0-5例，大多是從該病流行區(qū)域旅游歸來的游客[16]。該疾病的大暴發(fā)通常與天氣有關(guān)比如熱帶風(fēng)暴和特大暴雨。1991年在我國首次由廣東湛江報(bào)告4例病人,隨后海南、廣東、廣西南部的邊緣熱帶和南亞熱帶地區(qū)成為中國類鼻疽疫源地。2005年臺(tái)灣南部地區(qū)由于發(fā)生大雨沖刷導(dǎo)致病原播散，造成了類鼻疽爆發(fā)感染事件[17]。而近年來在青海、重慶等內(nèi)陸地區(qū)也有病例出現(xiàn)[18-19]。

BimA作為為數(shù)不多的研究較清楚的類鼻疽菌毒力因子，對其機(jī)制的探討和認(rèn)識(shí)為我們研究類鼻疽菌的毒力提供了更多的參考和借鑒。BimA類似于汽車“馬達(dá)”，在細(xì)菌傳播中提供動(dòng)力，促進(jìn)多核巨細(xì)胞(multi-nuclear giant cell，MNGC)的形成。通過對類鼻疽BimA蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析及其作用于人體細(xì)胞的分子生物學(xué)機(jī)制研究后發(fā)現(xiàn)病原菌適應(yīng)宿主、逃避宿主免疫逃逸的超凡能力和驚人的進(jìn)化能力。類鼻疽菌已經(jīng)可以通過自身分泌的某些蛋白來模擬不同的宿主肌動(dòng)蛋白成核因子，介導(dǎo)聚合宿主肌動(dòng)蛋白，形成肌動(dòng)蛋白尾，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌在胞內(nèi)運(yùn)動(dòng)，達(dá)到感染播散，拓展生存空間的目的。

另外，類鼻疽菌中除了BimA是否還有其它能控制宿主細(xì)胞重要功能或者模擬、翻轉(zhuǎn)這些功能以實(shí)現(xiàn)感染、促進(jìn)共生的蛋白呢，這當(dāng)然還有待進(jìn)一步的生物信息學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?？傊?，BimA的發(fā)現(xiàn)和研究對尋找預(yù)防和控制類鼻疽菌的手段提供了新的靶點(diǎn)。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.03.015

通訊作者：毛旭虎, Email: maoxh2012@hotmail.com

中圖分類號(hào)：R37

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-2694(2016)03-0286-04

Corresponding author:Mao Xu-hu, Email: maoxh2012@hotmail.com

收稿日期：2015-08-13；修回日期:2016-01-12

Biological characteristics and research progress about Burkholderia pseudomallei intracellular movement associated protein (BimA)

HU Yi,FANG Yao,MAO Xu-hu

(DepartmentofClinicalMicrobiologyandImmunology,CollegeofMedicalLaboratoryScience,SouthwestHospital,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China)

Abstract:Burkholderia pseudomallei, a tropical medicine pathogen, is listed as Titer I’ pathogen by US Centers for Disease Control and Prevention. It is widely spread in Southeast Asia and the surrounding area of the South Sea of China. Its associated disease is melioidosis, with a high mortality and relapse rate, which has become a serious problem for public health. As an intracellular bacteria, its ability for intercellular motility plays a key role in its immunity escape and cell-to-cell diffusion. Burkholderia pseudomallei intracellular movement associated protein (BimA), an auto-secreted protein of B. Pseudomallei, takes part in manipulating intracellular actin function and associates with the pathogenicity of B. Pseudomallei. Comprehensive and in-depth understanding about BimA and associated mechanism would benefit prevention and control of the pathogen. This review focuses on the biological characteristics and research progress about BimA to discuss its roles in B. Pseudomallei intracellular movement, immunity escape and cell-to-cell diffusion.

Keywords:Burkholderia pseudomallei; BimA; actin aggregation

國家自然科學(xué)基金( No.81471914)