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      Orbitrap Fusion Lumos三合一質(zhì)譜技術(shù)分析鱖魚、金鯧魚和鱘魚肌動(dòng)蛋白肽指紋圖譜的差異性

      2021-09-28 03:27:30徐明芳鄭春麗王洋洋白衛(wèi)濱
      食品科學(xué) 2021年18期
      關(guān)鍵詞:鯧魚肌動(dòng)蛋白鱘魚

      徐明芳,鄭春麗,王洋洋,白衛(wèi)濱*,葉 蕾,崔 靜

      (1.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣東 廣州 510632;2.暨南大學(xué)理工學(xué)院,廣東 廣州 510632)

      魚類肌肉蛋白質(zhì)是多種蛋白的復(fù)合體,質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)18%~22%以上,根據(jù)溶解性的不同,魚肉中的蛋白質(zhì)可以分為3 大類:高鹽溶解蛋白如肌原纖維蛋白(55%~60%)、低鹽溶解的肌漿蛋白(25%~35%)和不溶性基質(zhì)蛋白(10%~15%)。其中,肌原纖維蛋白約占魚類總蛋白含量的55%~60%,是魚肌肉中含量最高的蛋白質(zhì),主要包括肌球蛋白(50%~55%)、肌動(dòng)蛋白(20%~25%)、原肌球蛋白(5%~10%)和肌鈣蛋白(5%~10%)4 個(gè)主要蛋白組分[1-2]。肌動(dòng)蛋白存在于所有真核細(xì)胞中,肌動(dòng)蛋白在真核細(xì)胞進(jìn)化過程中相當(dāng)保守[3-4],低等真核生物(例如酵母)只含有一種肌動(dòng)蛋白,而多細(xì)胞生物通常含有多種肌動(dòng)蛋白亞型,在哺乳動(dòng)物和鳥類細(xì)胞中至少有6 種肌動(dòng)蛋白異構(gòu)體由不同的基因編碼,已分離到6 種肌動(dòng)蛋白[5],4 種稱為α-肌動(dòng)蛋白,分別為橫紋?。ê趋兰。?、心肌、血管平滑肌和腸道平滑肌所特有,另2 種為β-肌動(dòng)蛋白和γ-肌動(dòng)蛋白,見于所有肌肉細(xì)胞和非肌肉細(xì)胞質(zhì)中[6]。

      如圖1[7]所示,肌動(dòng)蛋白是一種高度豐富的細(xì)胞內(nèi)蛋白,存在于每個(gè)真核細(xì)胞中,以單體G-肌動(dòng)蛋白和多聚體F-肌動(dòng)蛋白2 種形式存在,是細(xì)胞骨架的關(guān)鍵組成部分[8]。肌動(dòng)蛋白的多聚體構(gòu)成右螺旋的四級(jí)結(jié)構(gòu)即纖維狀[9-10],主要功能是聚合成細(xì)絲的能力,細(xì)絲在細(xì)胞黏附、機(jī)械收縮、定向遷移、肌肉收縮、細(xì)胞分裂和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)然具^程中發(fā)揮重要作用[7]。在非肌細(xì)胞中,肌動(dòng)蛋白G-肌動(dòng)蛋白和F-肌動(dòng)蛋白形式之間的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程,包括細(xì)胞分裂[11]、黏附、運(yùn)動(dòng)和物質(zhì)運(yùn)輸,除細(xì)胞骨架功能外,肌動(dòng)蛋白可通過核輸入直接結(jié)合在許多基因的啟動(dòng)子區(qū)域,調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[12];肌動(dòng)蛋白也與某些疾病的發(fā)生密切相關(guān),例如阿爾茨海默病[13-14]及心肌病[15-16],此外肌動(dòng)蛋白還與衰老相關(guān)[17],對維持心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的正常功能具有重要作用[18-20]。肌動(dòng)蛋白的研究最早可追溯到19世紀(jì),自肌動(dòng)蛋白被發(fā)現(xiàn)以來,對肌動(dòng)蛋白的研究主要以兔[21]、牛[22]、小鼠[23]等哺乳動(dòng)物為主,在進(jìn)化過程中,肌動(dòng)蛋白在蛋白質(zhì)水平上高度保守,各種生物間氨基酸序列的同源性高達(dá)70%以上,但魚類肌動(dòng)蛋白的研究文獻(xiàn)鮮有報(bào)道,魚類肌動(dòng)蛋白是否具有更高同源性及氨基酸序列的差異性值得深入研究。

      圖1 G-肌動(dòng)蛋白(a)和F-肌動(dòng)蛋白(b)的結(jié)構(gòu)[7]Fig.1 Structures of G-actin (a) and F-actin (b)

      肽質(zhì)量指紋譜分析,簡稱肽質(zhì)指紋圖譜,是目前蛋白質(zhì)組學(xué)中鑒定蛋白真實(shí)性的高通量分析方法。在蛋白質(zhì)肽質(zhì)指紋圖譜研究中,基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionizationtime of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)是常用的分析工具。質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀分析鑒定的關(guān)鍵核心部件,目前最常用的質(zhì)量分析器有四極桿、TOF、離子阱、靜電場軌道阱(Orbitrap)等,不同類型的質(zhì)量分析器組合會(huì)構(gòu)成不同功能的質(zhì)譜儀,近年發(fā)展二維線性離子阱組合型傅里葉轉(zhuǎn)換質(zhì)譜(linear trap quadropole orbitrap mass spectrometry,LTQ Orbitrap MS),因其高分辨能力,在特征肽段、未知蛋白的鑒定和差異蛋白質(zhì)組的研究中具有獨(dú)特優(yōu)勢。Orbitrap質(zhì)譜儀器最高分辨率可達(dá)100 000,檢測到亞10-6級(jí),而TOF質(zhì)譜儀分辨率小于3 000[24]。徐明芳等[25-26]利用LTQ Orbitrap MS質(zhì)譜技術(shù)分析鑒定不同奶牛品種乳源如南方水牛奶、荷斯坦牛奶和山羊奶乳清蛋白的特征肽段與精細(xì)結(jié)構(gòu),研究了南方水牛奶酪蛋白和大豆蛋白主要組分肽質(zhì)指紋圖譜及氨基酸序列差異性,為乳源蛋白真實(shí)性檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展提供依據(jù)。Feng Jixing等[27]利用MALDI-TOF-MS分析南美白對蝦45 kDa蛋白的酶解肽段,鑒定為45 kDa蛋白屬于β-肌動(dòng)蛋白,氨基酸序列覆蓋率為28%。近年質(zhì)譜儀在儀器靈敏度,質(zhì)量分辨率和掃描速度方面又有新的突破,Orbitrap Fusion Lumos三合一高分辨質(zhì)譜儀是目前最新型質(zhì)譜儀,如圖2所示。

      圖2 Orbitrap Fusion Lumos三合一質(zhì)譜儀Fig.2 Structure of Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer

      三合一質(zhì)譜儀整合了四極桿質(zhì)量過濾器、超高靜電場軌道阱質(zhì)量分析器與線性離子阱質(zhì)量分析器三位一體同時(shí)運(yùn)行,極大提高了離子采集精度與速度,與上一代LTQ Orbitrap MS相比對低至2 ng的蛋白質(zhì)組樣品的肽段鑒定率增加了3 倍[28],非常適合蛋白質(zhì)組學(xué)中復(fù)雜體系的高通量蛋白檢測。Sathe等[29]采用Orbitrap Fusion Lumos三合一質(zhì)譜儀對腦脊液樣品鑒定了111 個(gè)磷酸酪氨酸肽段及對應(yīng)66 個(gè)蛋白,三合一質(zhì)譜儀因其高靈敏度、高質(zhì)量精確度、超高分辨率和掃描速度的優(yōu)勢倍受關(guān)注,但該技術(shù)用于魚類肌動(dòng)蛋白的研究鮮見報(bào)道。

      本研究將采用Orbitrap FusionTMMS四極桿質(zhì)量過濾器-靜電場軌道阱-線性離子阱三合一高分辨質(zhì)譜技術(shù)對鱖魚、金鯧魚和鱘魚名貴魚類肌動(dòng)蛋白進(jìn)行鑒定,通過對其特征肽段與氨基酸序列差異性進(jìn)行分析,建立肌動(dòng)蛋白肽質(zhì)量指紋圖譜,以期為魚類蛋白真實(shí)性及品質(zhì)屬性鑒定提供技術(shù)方法,為開拓肌動(dòng)蛋白在疾病與健康領(lǐng)域的應(yīng)用研究及魚類蛋白功能食品研發(fā)提供基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      鮮活鱖魚(866±111)g、金鯧魚(700±28)g和鱘魚(1 486±98)g購自暨南大學(xué)菜市場。

      碳酸氫銨、乙腈、三氟乙酸、二硫蘇糖醇、吲哚-3-乙酸、胰蛋白酶均為分析純。

      1.2 儀器與設(shè)備

      Orbitrap Fusion Lumos三合一質(zhì)譜儀、Pico17型微型合成離心機(jī) 美國Thermo Fisher Scientific公司。

      1.3 方法

      1.3.1 待測樣品凍干粉的制備

      肌原纖維蛋白的制備參照Lv Mingchun等[30]的方法,有所修改。取魚肌肉組織50 g破碎,加入5 倍體積緩沖液A,10 000 r/min離心5 min,棄上清液,重復(fù)3~4 次,洗去水溶性蛋白質(zhì)。取沉淀,沉淀加入10 倍體積緩沖液B,攪拌混勻,于4 ℃靜置1 h,10 000 r/min離心10 min,得到的上清液即肌原纖維蛋白溶液。

      雙水相法制備魚肌動(dòng)蛋白凍干粉參照王洋洋等[31]的方法,在異丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)26%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)11%,pH 9.0條件下,制備5 L雙水相體系萃取分離體系,肌原纖維蛋白加入量為體系總質(zhì)量的30%,室溫靜置3 h后分離出上相經(jīng)過35 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20 min,4 ℃靜置過夜,離心收集沉淀,蒸餾水透析去鹽,真空冷凍干燥得到肌動(dòng)蛋白凍干粉存4 ℃保存。

      1.3.2 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

      各稱取1.0 mg凍干粉于1.5 mL離心管中,加入1 mL樣品緩沖液,充分溶解后,沸水浴加熱5 min,冷卻后加樣。參照Laemmli[32]的電泳方法,分離膠10%,濃縮膠5%,電極緩沖液含0.05 mol/L三羥甲基氨基甲烷,0.384 mol/L甘氨酸,0.1%十二烷基硫酸鈉。上樣量為15 μL;開始電泳時(shí)濃縮膠電壓為80 V,待樣品進(jìn)入分離膠后電壓改為120 V。電泳結(jié)束后,取出膠片用考馬斯亮藍(lán)染色,用無水乙醇/冰醋酸脫色至背景清晰。

      1.3.3 蛋白膠內(nèi)酶解

      將獲得的鱖魚、金鯧魚和鱘魚十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳膠酶解,酶解方法與實(shí)施步驟見參考文獻(xiàn)[33]。

      1.3.4 試劑配制方法

      10 mL 100 mmol/L碳酸氫銨溶液:79.06 mg碳酸氫銨溶于超純水中,定容到10 mL。1 mL脫色液:0.5 mL 100%乙腈,0.25 mL 100 mmol/L碳酸氫銨溶液,0.25 mL ddH2O。4 mL還原劑:6.2 mg二硫蘇糖醇,1 mL 100 mmol/L碳酸氫銨溶液,3 mL dd H2O。4 mL烷基化試劑:40.69 mg吲哚-3-乙酸,1 mL 100 mmol/L碳酸氫銨溶液,3 mL ddH2O。2 mL覆蓋液:0.5 mL 100 mmol/L碳酸氫銨溶液,0.2 mL 100%乙腈,1.3 mL ddH2O。酶液儲(chǔ)液:1 mg/mL胰蛋白酶用覆蓋液稀釋至0.02 μg/μL。3 mL萃取液:0.075 mL三氟乙酸,2.01 mL 100%乙腈,0.915 mL dd H2O。1 mL樣品溶解液:0.001 mL甲酸,0.02 mL 100%乙腈,0.979 mL dd H2O。

      1.3.5 質(zhì)譜檢測

      凍干的樣品脫鹽后,加入12 μL樣品溶解液,充分振蕩渦旋,離心,取10 μL上清液用Orbitrap Fusion Lumos三合一質(zhì)譜分析。樣品經(jīng)C18反相柱(100 mm×75 μm,3 μm)分離,肽段在反相柱上洗脫梯度為5%~100%乙腈(含0.1%甲酸)洗脫30 min,流速為600 nL/min。

      質(zhì)譜條件:一級(jí)質(zhì)譜的Orbitrap分辨率為60 000,質(zhì)量掃描范圍m/z350~1 500,最大注入時(shí)間為50 ms;二級(jí)質(zhì)譜檢測器類型Orbitrap,分辨率15 000,使用HCD模式碰撞裂解,碰撞能量31%,最大注入時(shí)間為100 ms。

      1.3.6 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索與分析方法

      根據(jù)樣品物種來源從UniProt下載對應(yīng)物種的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫,數(shù)據(jù)分析使用Xcalibur、MaxQuant等軟件?;谲浖凶詭惴ㄅc圖片可視化功能,根據(jù)設(shè)定參數(shù)將液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)得到的數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配,通過肽段的一級(jí)和二級(jí)碎片的質(zhì)量在數(shù)據(jù)庫中找到匹配的蛋白質(zhì),實(shí)現(xiàn)樣品中的蛋白質(zhì)鑒定。

      質(zhì)譜得到原始數(shù)據(jù)為Raw格式,下載MSFileReader_x86_x64-_3.exe讀數(shù)軟件,打開Xcalibur軟件與MaxQuant 1.6.0.16軟件起始界面,用搜庫軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索,分別在鱖魚、金鯧魚和鱘魚的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(2019年11月15日下載自NCBI Protein數(shù)據(jù)庫,以Siniperca chuatsi、Trachinotus ovatus和Acipenser sinensis為名,搜索結(jié)果分別包含5 186、5 893 條和235 條序列中搜索MS/MS質(zhì)譜。

      以鱖魚為例,鱖魚質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)(Raw文件)通過讀數(shù)軟件MSFileReader_x86_x64-_3.exe后導(dǎo)入MaxQuant 1.6.0.16軟件或Xcalibur軟件中,組特定參數(shù)(groupspecific parameters)Digestion設(shè)置為Trypsin,全局參數(shù)(global parameters)設(shè)置S.chuatsisequence.fasta數(shù)據(jù)庫,執(zhí)行搜庫功能,通過樣品質(zhì)譜中每個(gè)m/z信號(hào)與數(shù)據(jù)庫肽質(zhì)量列表進(jìn)行匹配并對整個(gè)肽段列表進(jìn)行排序,在質(zhì)量容差范圍內(nèi)的所有匹配項(xiàng)將用于計(jì)算分?jǐn)?shù)和鑒定相應(yīng)的蛋白質(zhì)。

      搜索參數(shù)設(shè)置:數(shù)據(jù)庫為NCBInr,酶為胰蛋白酶,允許最大漏切位點(diǎn)為1,固定修飾為Carbamidomethyl(C),可變修飾為Oxidation(M),MS tolerance(容差)為0.15 Da,MS/MS tolerance為0.25 Da,其他參數(shù)均為軟件默認(rèn)值。在Xcalibur4.0軟件平臺(tái)或MaxQuant軟件的可視化窗口下(Viewer)處理一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜圖。搜庫結(jié)果以combined-txt文件夾形式保存,combined-txt文件夾包含所有鑒定和定量的全部結(jié)果。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 肌動(dòng)蛋白的一級(jí)質(zhì)譜與二級(jí)質(zhì)譜

      鱖魚、金鯧魚和鱘魚肌動(dòng)蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解的多肽混合物分別經(jīng)Orbitrap Fusion Lumos三合一質(zhì)譜檢測,采用Xcalibur軟件與MaxQuant軟件在可視化窗口下運(yùn)行,獲得蛋白質(zhì)樣品的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖,如圖3所示。軟件分析得到鱖魚二級(jí)質(zhì)譜肽段數(shù)量249 個(gè),金鯧魚二級(jí)質(zhì)譜肽段數(shù)量164 個(gè),鱘魚二級(jí)質(zhì)譜肽段數(shù)量141 個(gè),共計(jì)554 個(gè)肽段,基于篇幅,無法一一展示所有肽段,每種魚類僅選取2 個(gè)特征肽段二級(jí)質(zhì)譜如圖4所示,由二級(jí)質(zhì)譜離子峰匹配出相應(yīng)氨基酸序列。

      圖3 3 種魚肌動(dòng)蛋白一級(jí)質(zhì)譜圖Fig.3 Primary mass spectra of actin from three fish species

      圖4 3 種魚肌動(dòng)蛋白特征肽段二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.4 Secondary mass spectra of signature actin peptides from three fish species

      2.2 鱖魚、金鯧魚和鱘魚肌動(dòng)蛋白質(zhì)譜差異性

      鱖魚、金鯧魚和鱘魚肌動(dòng)蛋白的多肽混合物分別經(jīng)Orbitrap Fusion Lumos三合一質(zhì)譜分析。質(zhì)譜得到肽段信息用MaxQuant 1.6.0.16搜庫軟件分別在鱖魚、鱘魚和金鯧魚的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索,根據(jù)得分、匹配的肽段數(shù)、特征肽段數(shù)和覆蓋率等綜合評判鑒定出肽段氨基酸序列、肽段來源及所屬蛋白的氨基酸全序列。蛋白鑒定結(jié)果見表1。

      表1 鱖魚、金鯧魚和鱘魚肌動(dòng)蛋白質(zhì)譜差異性Table 1 Differences in actin mass spectra among S.chuatsi,T.ovatus and A.sinensis

      MS/MS產(chǎn)生的碎片信息搜庫后會(huì)鑒定出氨基酸序列和所屬的蛋白種類,并且肽段對于所屬蛋白來說是否為特征肽段,質(zhì)譜鑒定結(jié)果會(huì)直接告知。僅根據(jù)每種魚類的特征肽段不足以鑒定蛋白,而是通過二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生的所有肽段搜索數(shù)據(jù)庫,根據(jù)質(zhì)譜鑒定到蛋白的肽段覆蓋率、得分、匹配的肽段數(shù)、特征肽段數(shù)等參數(shù)綜合評判來鑒定蛋白的類型,這些參數(shù)的值越大,蛋白質(zhì)鑒定的準(zhǔn)確性越高。

      如表1所示,鱖魚骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白肽段覆蓋率為59.2%、金鯧魚肽段覆蓋率為54.1%、鱘魚β-肌動(dòng)蛋白為42.7%,鱖魚有10 個(gè)特征肽段,金鯧魚有24 個(gè)特征肽段,鱘魚有12 個(gè)特征肽段。鑒定結(jié)果顯示,鱖魚、金鯧魚和鱘魚肌動(dòng)蛋白的蛋白分子質(zhì)量和主鏈氨基酸數(shù)量均有差異。鱖魚骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白全序列氨基酸數(shù)量為377,分子質(zhì)量為41 944 Da,金鯧魚β-肌動(dòng)蛋白全序列氨基酸數(shù)量為375,分子質(zhì)量為41 766 Da,蛋白分子質(zhì)量和全序列氨基酸數(shù)量均大于鱘魚β-肌動(dòng)蛋白(部分序列氨基酸數(shù)量為248,分子質(zhì)量為27 921 Da)。鱘魚蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中沒有完整的肌動(dòng)蛋白氨基酸全序列,只有2 個(gè)部分序列,因此鱘魚肌動(dòng)蛋白酶解后質(zhì)譜鑒定匹配到的肽段數(shù)、蛋白分子質(zhì)量和主鏈氨基酸數(shù)量均小于鱖魚和金鯧魚肌動(dòng)蛋白。

      2.3 鱖魚、金鯧魚和鱘魚肌動(dòng)蛋白肽指紋圖譜的建立

      鱖魚、金鯧魚和鱘魚肌動(dòng)蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解得到的片段經(jīng)Orbitrap Fusion Lumos三合一質(zhì)譜分析,可鑒定出全部的肽段。得到的肽段經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索分析可鑒定出肽段的來源,如TTGIVLDAGDGVTHNVPVYEGYALPHAIMR、EDEIAALVVDNGSGMCK、LCYVALDFEQEMATAASSSSLEK分別屬于鱖魚骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白、金鯧魚β-肌動(dòng)蛋白和鱘魚β-肌動(dòng)蛋白的酶解肽段。鱖魚骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白、金鯧魚β-肌動(dòng)蛋白和鱘魚β-肌動(dòng)蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定得到的全部肽段序列信息分別見表2~4,差異肽段見表5,同時(shí),通過搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫獲得肌動(dòng)蛋白的氨基酸全序列(表6),結(jié)果中沒有搜索到鱘魚β-肌動(dòng)蛋白的完整氨基酸序列,僅有2 個(gè)部分序列。

      表2 鱖魚骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白肽段氨基酸序列信息Table 2 Information about peptide sequence of α-actin in S.chuatsi skeletal muscle

      表3 金鯧魚β-肌動(dòng)蛋白肽段氨基酸序列信息Table 3 Information about peptide sequence of T.ovatus β-actin

      續(xù)表3

      表4 鱘魚β-肌動(dòng)蛋白肽段氨基酸序列信息Table 4 Information about peptide sequence of A.sinensis β-actin

      表6 鱖魚、金鯧魚和鱘魚肌動(dòng)蛋白氨基酸序列對比Table 6 Comparison of amino acid sequences of S.chuatsi, T.ovatus and A.sinensis actin

      由表2~4可知,不同來源的肌動(dòng)蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解后質(zhì)譜檢測得到的肽段數(shù)量有差異。肽段數(shù)量最多的為鱖魚肌動(dòng)蛋白,酶解后可檢測到29 個(gè)肽段,金鯧魚共檢測到24 個(gè)肽段,全為特征肽段,而鱘魚最多檢出13 個(gè)肽段。3 種魚類肌動(dòng)蛋白酶解得到的所有肽段中有多個(gè)相同的肽段。

      由表5可知,鱖魚骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白、金鯧魚β-肌動(dòng)蛋白和鱘魚β-肌動(dòng)蛋白的指紋譜中均有不同數(shù)量的差異肽段。與另外2 種魚類肌動(dòng)蛋白的指紋譜相比,鱖魚骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白有10 個(gè)差異肽段,金鯧魚β-肌動(dòng)蛋白有5 個(gè)差異肽段,鱘魚β-肌動(dòng)蛋白酶解后鑒定到的肽段數(shù)量最少,僅有3 個(gè)差異肽段,因鱘魚蛋白數(shù)據(jù)庫不完善,搜庫中無法匹配到鱘魚肌動(dòng)蛋白氨基酸全序列,這3 個(gè)肽段在蛋白氨基酸全序列位置無法確認(rèn),隨著鱘魚蛋白基因轉(zhuǎn)錄組學(xué)深入研究,有望得到進(jìn)一步相關(guān)論證。

      表5 鱖魚、金鯧魚和鱘魚肌動(dòng)蛋白肽指紋譜的差異性Table 5 Difference in fingerprints of actin peptides in S.chuatsi,T.ovatus and A.sinensis

      由表6可知,鱖魚骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白和金鯧魚β-肌動(dòng)蛋白由于蛋白類型不同,它們的一級(jí)結(jié)構(gòu)在氨基酸數(shù)量和排列方面存在明顯差異:鱖魚骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白序列有377 個(gè)氨基酸,金鯧魚β-肌動(dòng)蛋白序列有375 個(gè)氨基酸;2 個(gè)氨基酸序列從相似序列開始發(fā)生了21 處氨基酸變異(鱖魚骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白從第12個(gè)氨基酸開始,金鯧魚β-肌動(dòng)蛋白從第10個(gè)氨基酸開始,2 個(gè)序列為相似的氨基酸序列。氨基酸變異位置用括號(hào)標(biāo)出)。鱖魚骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白和部分鱘魚β-肌動(dòng)蛋白氨基酸序列從相似序列開始發(fā)生了17 處氨基酸的變異(從鱖魚骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白第74位氨基酸開始,2 個(gè)序列為相似的氨基酸序列。氨基酸變異位置用下劃線標(biāo)出);部分鱘魚β-肌動(dòng)蛋白的氨基酸序列與金鯧魚β-肌動(dòng)蛋白的序列同源性較高,僅有3 個(gè)氨基酸存在變異,分別在第160、228、279位氨基酸處。

      3 結(jié) 論

      采用Orbitrap Fusion Lumos三合一質(zhì)譜技術(shù)分析3 種魚類肌動(dòng)蛋白肽質(zhì)指紋譜,肽段序列和蛋白氨基酸全序列比對結(jié)果表明,鱖魚肌動(dòng)蛋白全序列氨基酸數(shù)量和蛋白分子質(zhì)量均高于金鯧魚和鱘魚。鱖魚肌動(dòng)蛋白全序列氨基酸數(shù)量為377,分子質(zhì)量為41 944 Da;金鯧魚全序列氨基酸數(shù)量為375,分子質(zhì)量為41 766 Da;鱘魚部分序列氨基酸數(shù)量為248,分子質(zhì)量為27 921 Da。鱖魚肌動(dòng)蛋白的酶解肽段質(zhì)譜檢測到29 個(gè)肽段,鑒定為骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白;金鯧魚檢測到24 個(gè)肽段,鱘魚則檢出13 個(gè)肽段,均鑒定為β-肌動(dòng)蛋白;與另外2 種魚類肌動(dòng)蛋白的肽質(zhì)指紋譜相比,鱖魚骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白有10 個(gè)差異肽段,金鯧魚β-肌動(dòng)蛋白有5 個(gè)差異肽段,鱘魚β-肌動(dòng)蛋白有3 個(gè)差異肽段,從氨基酸全序列的排列方式來看,鱖魚骨骼肌α-肌動(dòng)蛋白與金鯧魚β-肌動(dòng)蛋白從相似序列開始共有21 處氨基酸變異,與鱘魚β-肌動(dòng)蛋白從相似序列開始共有17 處氨基酸變異,鱘魚部分β-肌動(dòng)蛋白氨基酸序列與金鯧魚β-肌動(dòng)蛋白的序列同源性較高,僅在金鯧魚β-肌動(dòng)蛋白第160、228、279位氨基酸處存在變異。開展魚肌動(dòng)蛋白肽質(zhì)指紋譜研究將為名貴魚類質(zhì)量品質(zhì)屬性的鑒定、魚類肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的研制及魚蛋白高通量芯片檢測技術(shù)的發(fā)展提供新思路與參考依據(jù),具有重要現(xiàn)實(shí)意義與廣泛的應(yīng)用前景。

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