丁曉燕，曲凌云，王　琛，田欣欣，孫承君，王敏強(qiáng)

(1.煙臺(tái)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005；2.國(guó)家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島 266061；3.海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266237)

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溫度對(duì)副溶血弧菌T3SS中相關(guān)基因表達(dá)的影響*

丁曉燕1,2，曲凌云2,3*，王琛1,2，田欣欣2，孫承君2，王敏強(qiáng)1

(1.煙臺(tái)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005；2.國(guó)家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島 266061；3.海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266237)

摘要:III型分泌系統(tǒng)(type III secretion system，T3SS)是副溶血弧菌主要的毒力因子之一，能傳遞與致病有關(guān)的毒性因子來發(fā)揮病原菌的毒性，而溫度是影響細(xì)菌基因表達(dá)等生命活動(dòng)的關(guān)鍵生態(tài)因子。本文以ATCC17802和JA21作為實(shí)驗(yàn)菌株，分別提取其RNA，在不同溫度和溫度應(yīng)激條件下，以pvuA為內(nèi)參基因，以副溶血弧菌T3SS1的vcrD1、vopS、vopD1和T3SS2的vscC2β、vcrD2β、vopP2β作為目的基因，運(yùn)用熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)T3SS相關(guān)基因的表達(dá)下，用ΔΔCt法計(jì)算基因表達(dá)差異。結(jié)果表明：副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) ATCC17802菌株的T3SS1基因在16 ℃表達(dá)量最高，T3SS2基因在25 ℃表達(dá)量最高。副溶血弧菌JA21菌株的T3SS1基因和T3SS2基因均在25 ℃表達(dá)量最高。2株副溶血弧菌從不同的培養(yǎng)溫度轉(zhuǎn)入到應(yīng)激溫度37 ℃后，T3SS1和T3SS2基因的表達(dá)量均被顯著誘導(dǎo)，并表現(xiàn)出時(shí)間依賴性，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。這為進(jìn)一步探究環(huán)境因素與副溶血弧菌致病力的關(guān)系提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：副溶血弧菌；T3SS；RT-PCR；基因表達(dá)

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus) 屬于弧菌科弧菌屬，是一種嗜鹽嗜溫性的革蘭氏陰性短桿菌[1]，主要生活在海洋環(huán)境、鹽湖和魚蝦貝類等海產(chǎn)品中。副溶血弧菌能感染魚類、對(duì)蝦、文蛤、九孔鮑等，引起水生動(dòng)物疾病[2]，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)造成危害；人類誤食帶有副溶血弧菌的海產(chǎn)品可導(dǎo)致腸胃炎、嘔吐、發(fā)燒等癥狀，嚴(yán)重者甚至引發(fā)敗血癥[3]。副溶血弧菌病主要在中國(guó)、日本等沿海國(guó)家或地區(qū)流行，我國(guó)部分沿海地區(qū)，細(xì)菌性食物中毒的病例中副溶血弧菌食物中毒占居首位(31%)[4]。副溶血弧菌的致病性與其產(chǎn)生的多種毒力因子密切相關(guān)，其中III型分泌系統(tǒng)(type III secretion system，T3SS)是副溶血弧菌的主要毒力因子之一，具有細(xì)胞毒性[5]和腸毒性[6]。2002年Tagomori[7]完成第一株副溶血弧菌全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)副溶血弧菌含有兩套III型分泌系統(tǒng)(T3SS)，分別是T3SS1，T3SS2。 T3SS1位于染色體1的毒力島上，具有30個(gè)開放閱讀框，且T3SS1存在于所有的副溶血弧菌分離株中，其G+C含量與基因組其它區(qū)域有差別，被認(rèn)為是該菌的一個(gè)遺傳標(biāo)記[8]。副溶血弧菌T3SS1 主要貢獻(xiàn)對(duì)宿主細(xì)胞的細(xì)胞毒性，引發(fā)一系列的細(xì)胞效應(yīng)，介導(dǎo)宿主細(xì)胞的自體吞噬作用，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡。副溶血弧菌T3SS2位于染色體2的毒力島上，主要具有腸毒性[9]，引起腹瀉和破壞腸道組織，同時(shí)也發(fā)揮少量細(xì)胞毒性，在感染過程中發(fā)揮重要功能。

環(huán)境溫度作為關(guān)鍵生態(tài)因子之一，其變化會(huì)影響微生物等生命體的生命活動(dòng)[10-11]，Hoe和Gogven[12]研究表明外界環(huán)境溫度的變化可誘導(dǎo)細(xì)菌分泌系統(tǒng)的表達(dá)。Rao等[13]發(fā)現(xiàn)，遲緩愛德華氏菌在感染過程中經(jīng)歷了由環(huán)境溫度到宿主溫度的變化，T3SS的表達(dá)相應(yīng)的受到溫度的調(diào)控，37 ℃條件下與28 ℃條件下T3SS的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)量不同，而在20 ℃條件下，沒有檢測(cè)到T3SS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)。Vilches等[14]發(fā)現(xiàn)環(huán)境因子誘導(dǎo)嗜水氣單胞菌AH-3菌株T3SS的表達(dá)，其中Ca2+的消耗和高濃度Mg2+是最主要的因素，溫度升高也能促進(jìn)表達(dá)。龐歡瑛等[15]研究了溶藻弧菌T3SS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白vscO基因在不同環(huán)境下的表達(dá)差異，結(jié)果顯示vscO基因在特定的環(huán)境下表達(dá)量最高。而關(guān)于環(huán)境因子對(duì)副溶血弧菌T3SS表達(dá)的影響未曾見到報(bào)道。

本研究共選取T3SS中6個(gè)相關(guān)結(jié)構(gòu)和效應(yīng)蛋白基因?yàn)槟康幕?，采用RT-PCR方法比較不同生長(zhǎng)溫度和溫度應(yīng)激條件下副溶血弧菌T3SS中相關(guān)基因的表達(dá)差異，以探討副溶血弧菌T3SS基因表達(dá)與環(huán)境溫度適應(yīng)性之間的關(guān)系，并進(jìn)一步探究環(huán)境因素變化對(duì)副溶血弧菌致病因子表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1菌株來源及毒力基因特征

本研究使用的菌株保存于國(guó)家海洋局第一海洋研究所免疫與疾控實(shí)驗(yàn)室近海微生物資源庫(kù)。其中，副溶血弧菌ATCC17802購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，副溶血弧菌JA21為本實(shí)驗(yàn)室分離。

表1　副溶血弧菌T3SS基因信息

1.2引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中副溶血弧菌T3SS基因，利用Primer Premier 5.0 軟件在T3SS基因比較保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列見表2。 內(nèi)標(biāo)基因pvuA上、下游引物序列引用自參考文獻(xiàn)[20]。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表2　RT-PCR所用引物

1.3實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

細(xì)菌培養(yǎng)所用2216E培養(yǎng)基按照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》(第三版)[21]進(jìn)行配制；細(xì)菌RNA提取試劑盒R6950-01購(gòu)自O(shè)mega公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RR047A、熒光定量PCR試劑盒RR820A購(gòu)自Takara公司；熒光定量PCR儀型號(hào)為Applied Biosystems 7500。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1培養(yǎng)溫度對(duì)T3SS基因表達(dá)的影響

將2株副溶血弧菌ATCC17802、JA21接種于2216E培養(yǎng)基中，37 ℃[22]搖床震蕩過夜培養(yǎng)，將過夜培養(yǎng)的細(xì)菌以1%的比例接種于2216E培養(yǎng)基中，分別放置于16,20,25和37 ℃條件下120 rpm/min搖床震蕩培養(yǎng)。根據(jù)生長(zhǎng)曲線估計(jì)培養(yǎng)時(shí)間，在OD600達(dá)到0.6時(shí)，取菌液4 ℃離心取沉淀，用RNA提取試劑盒(Omega)提取總RNA用于T3SS基因轉(zhuǎn)錄水平差異的檢測(cè)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組各設(shè)3個(gè)平行。

1.4.2溫度應(yīng)激對(duì)T3SS基因表達(dá)的影響

將2株副溶血弧菌ATCC17802、JA21接種于2216E培養(yǎng)基中，37 ℃搖床震蕩過夜培養(yǎng)，將過夜培養(yǎng)的細(xì)菌以1%的比例接種于2216E培養(yǎng)基中， 分別放置于16,20,25和37 ℃條件下120 rpm/min搖床震蕩培養(yǎng)。根據(jù)生長(zhǎng)曲線估計(jì)培養(yǎng)時(shí)間，待培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6，離心棄上清，用等體積2216E培養(yǎng)基重懸菌體沉淀，放置于模擬人體溫度的37 ℃條件下120 rpm/min搖床震蕩培養(yǎng)，分別于1，2，3和4 h取菌液4 ℃離心取沉淀，用RNA提取試劑盒提取總RNA用于T3SS基因轉(zhuǎn)錄水平差異的檢測(cè)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組各設(shè)3個(gè)平行。

1.4.3總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

使用Omega細(xì)菌RNA提取試劑盒提取副溶血弧菌的總RNA，操作在紫外線滅菌的獨(dú)立RNA實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。提取的總RNA的完整性用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，同時(shí)用紫外分光光度計(jì)確定RNA濃度。

反轉(zhuǎn)錄使用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒，首先去除總RNA中殘留的基因組，隨后將RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA分裝后置于-80 ℃保存。

1.4.4熒光定量PCR反應(yīng)體系與條件

反應(yīng)體系為20 μL，其中：cDNA 2 μL，2×SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus) 10 μL，50×ROX Reference Dye II 0.4 μL，濃度為10 μmol/L的上下游引物各0.8 μL，無菌雙蒸水6 μL。

反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min預(yù)變性；95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s， 72 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)，同時(shí)進(jìn)行ROX值校正。最后進(jìn)行RT-PCR溶解曲線分析。

1.5數(shù)據(jù)處理

RT-PCR結(jié)果采用2-ΔΔCt法分析不同條件下T3SS基因表達(dá)差異。每個(gè)菌株以培養(yǎng)溫度37 ℃為對(duì)照組。

2結(jié)果

2.1提取的總RNA檢測(cè)結(jié)果

用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的副溶血弧菌總RNA的完整性，結(jié)果顯示5SrRNA條帶很弱，幾乎不可見，而16SrRNA，23SrRNA條帶明亮清晰，說明提取的總RNA條帶完整。利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度及純度，A260/280數(shù)值處于1.8～2.0，說明RNA可以進(jìn)行下一步反轉(zhuǎn)錄。分析pvuA基因和vcrD1，vopS，vopD1，vscC2β，vcrD2β，vopP2β基因溶解曲線可知只有單峰值，排除了非特異性擴(kuò)增，陰性對(duì)照無擴(kuò)增曲線，表明加樣時(shí)無交叉污染。

2.2熒光定量PCR結(jié)果

2.2.1不同培養(yǎng)溫度下副溶血弧菌T3SS基因的表達(dá)差異

圖1　副溶血弧菌在不同溫度下T3SS基因的表達(dá)差異Fig.1　Differential expression of T3SS gene in V. parahaemolyticus cultured at different temperature

將2株副溶血弧菌ATCC17802和JA21分別接種于不同培養(yǎng)溫度的2216E培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，比較T3SS基因的表達(dá)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖1)：副溶血弧菌ATCC17802的T3SS1基因在16 ℃表達(dá)量最高，其次是25 ℃；其中16 ℃時(shí)T3SS1內(nèi)膜蛋白基因vcrD1的表達(dá)量是最低組的4.31倍，T3SS1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因vopD1的表達(dá)量最低組的5.11倍，T3SS1效應(yīng)蛋白基因vopS的表達(dá)量是最低組的6.71倍；T3SS2基因在25 ℃表達(dá)量最高，其次是16 ℃；其中25 ℃時(shí)T3SS2內(nèi)膜蛋白基因vcrD2β的表達(dá)量是最低組的2.61倍，T3SS2外膜蛋白基因vscC2β的表達(dá)量是最低組的5.80倍，T3SS2效應(yīng)蛋白基因vopP2β的表達(dá)量是最低組的5.59倍；副溶血弧菌JA21的T3SS1基因和T3SS2基因均在25 ℃表達(dá)量最高，其次是37 ℃；其中25 ℃時(shí)T3SS1內(nèi)膜蛋白基因vcrD1的表達(dá)量是最低組的1.34倍，T3SS1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因vopD1的表達(dá)量是最低組的5.72倍，T3SS1效應(yīng)蛋白基因vopS的表達(dá)量是最低組的1.39倍；25 ℃時(shí)T3SS2編碼內(nèi)膜蛋白基因vcrD2β的表達(dá)量是最低組的11.02倍，T3SS2外膜蛋白基因vscC2β的表達(dá)量是最低組的22.75倍，T3SS2效應(yīng)蛋白基因vopP2β的表達(dá)量是最低組的22.60倍。整體而言，2株副溶血弧菌T3SS基因均在20 ℃表達(dá)量最低。

2.2.2溫度應(yīng)激條件下副溶血弧菌T3SS基因表達(dá)差異

圖2　副溶血弧菌從16 ℃轉(zhuǎn)入37 ℃培養(yǎng)1， 2， 3和4 h后與培養(yǎng)溫度為16 ℃和37 ℃條件下的T3SS基因表達(dá)差異Fig.2　Differential expression of T3SS gene in V. parahaemolyticus at 1， 2， 3和4 h after transporting from 16 ℃ to 37 ℃ compared with which cultured at temperature 16 ℃ and 37 ℃

圖3　副溶血弧菌從20 ℃轉(zhuǎn)入37 ℃培養(yǎng)1， 2， 3和4 h后與培養(yǎng)溫度為20 ℃和37 ℃條件下的T3SS基因表達(dá)差異Fig.3　Differential expression of T3SS gene in V. parahaemolyticus at 1， 2， 3和4 h after transporting from 20 ℃ to 37 ℃ compared with which cultured at temperature 20 ℃ and 37 ℃

如圖2a所示，副溶血弧菌ATCC17802從培養(yǎng)溫度16 ℃轉(zhuǎn)入37 ℃后1 h，T3SS基因的表達(dá)量明顯升高，除vopS外其它基因在2 h時(shí)達(dá)到最高值，然后表達(dá)量開始回落。其中，T3SS1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因vopD1的表達(dá)量是對(duì)照組(37 ℃)的157.97倍，遠(yuǎn)高于其他基因。除此之外5個(gè)T3SS基因在最高值處的變化范圍是12.05～28.91倍，其中表達(dá)量變化最小的是T3SS2效應(yīng)蛋白基因vopP2β，表達(dá)量變化最大的是T3SS2外膜蛋白基因vscC2β。

如圖2b所示，副溶血弧菌JA21從培養(yǎng)溫度16 ℃轉(zhuǎn)入37 ℃后1 h，T3SS基因的表達(dá)量明顯升高，且T3SS1基因表達(dá)量在2 h時(shí)達(dá)到最高值，T3SS2基因表達(dá)量在1 h時(shí)達(dá)到最高值，然后表達(dá)量開始回落。T3SS基因在最高值處的變化范圍是2.74～17.91倍，其中表達(dá)量變化最小的是T3SS2效應(yīng)蛋白基因vopP2β，表達(dá)量變化最大的是T3SS2外膜蛋白基因vscC2β。

圖4　副溶血弧菌從25 ℃轉(zhuǎn)入37 ℃培養(yǎng)1， 2， 3和4 h后與培養(yǎng)溫度為25 ℃和37 ℃條件下的T3SS基因表達(dá)差異Fig.4　Differential expression of T3SS gene in V. parahaemolyticus at 1， 2， 3和4 h after transporting from 25 ℃ to 37 ℃ compared with which cultured at temperature 25 ℃ and 37 ℃

如圖3a所示，副溶血弧菌ATCC17802從培養(yǎng)溫度20 ℃轉(zhuǎn)入37 ℃后1 h，T3SS基因的表達(dá)量明顯升高，且在2 h時(shí)達(dá)到最高值，然后表達(dá)量開始回落。其中T3SS1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因vopD1的表達(dá)量是對(duì)照組(37 ℃)的88.74倍，遠(yuǎn)高于其他基因。除此之外5個(gè)T3SS基因在最高值處的變化范圍是7.14～22.25倍，其中表達(dá)量變化最小的是T3SS1內(nèi)膜蛋白基因vcrD1，表達(dá)量變化最大的是T3SS2內(nèi)膜蛋白基因vcrD2β。

如圖3b所示，副溶血弧菌JA21從培養(yǎng)溫度20 ℃轉(zhuǎn)入37 ℃后1 h，T3SS1基因和T3SS2基因的表達(dá)量明顯升高，除vscC2β外在3 h時(shí)達(dá)到最高值，然后表達(dá)量開始回落。T3SS基因在最高值處的變化范圍是4.01～14.47倍，其中表達(dá)量變化最小的是T3SS1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因vopD1，表達(dá)量變化最大的是T3SS2效應(yīng)蛋白基因vopP2β。

如圖4a所示，副溶血弧菌ATCC17802從培養(yǎng)溫度25 ℃轉(zhuǎn)入37 ℃后1 h，T3SS1基因和T3SS2基因的表達(dá)量明顯升高，且在2 h時(shí)達(dá)到最高值，然后表達(dá)量開始回落。其中T3SS1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因vopD1的表達(dá)量是對(duì)照組(37 ℃)的71.71倍，遠(yuǎn)高于其他基因。除此之外5個(gè)T3SS基因在最高值處的變化范圍是4.26～21.33倍，其中表達(dá)量變化最小的是T3SS1內(nèi)膜蛋白基因vcrD1，表達(dá)量變化最大的是T3SS2內(nèi)膜蛋白基因vcrD2β。

如圖4b所示，副溶血弧菌JA21從培養(yǎng)溫度25 ℃轉(zhuǎn)入37 ℃后1 h，T3SS1基因和T3SS2基因的表達(dá)量明顯升高，且在1 h達(dá)到最高值，然后表達(dá)量開始回落。T3SS基因在最高值處的變化范圍是3.59～7.46倍，其中表達(dá)量變化最小的是T3SS2效應(yīng)蛋白基因vopP2β，表達(dá)量變化最大的是T3SS2內(nèi)膜蛋白基因vcrD2β。

由圖2，3，4結(jié)果可見，2株副溶血弧菌從不同的培養(yǎng)溫度轉(zhuǎn)入到應(yīng)激溫度37 ℃后，T3SS基因的表達(dá)量明顯升高，既高于在原本的培養(yǎng)溫度時(shí)的表達(dá)量，也高于2株菌在培養(yǎng)溫度為37 ℃時(shí)的表達(dá)，轉(zhuǎn)入應(yīng)激條件下的副溶血弧菌T3SS基因表現(xiàn)出顯著的時(shí)間依賴性，表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)。

3討論與分析

T3SS作為副溶血弧菌的主要毒力因子之一， 能傳遞與致病有關(guān)的毒性因子來發(fā)揮病原菌的毒性，而溫度是影響細(xì)菌基因表達(dá)等生命活動(dòng)的關(guān)鍵生態(tài)因子。

副溶血弧菌T3SS1主要貢獻(xiàn)對(duì)宿主細(xì)胞的細(xì)胞毒性，介導(dǎo)宿主細(xì)胞的自體吞噬作用，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡。vcrD1編碼的內(nèi)膜蛋白是組成T3SS1分泌裝置基體的一部分，在此基礎(chǔ)上針管狀結(jié)構(gòu)蛋白才能繼續(xù)生長(zhǎng)。vopD1編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能是在宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜表面形成孔洞，效應(yīng)蛋白沿該通道進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，此外還具有對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性和接觸溶血活性[23]。圖1a、1c顯示，副溶血弧菌ATCC17802和JA21的vcrD1和vopD1基因分別在16 ℃和25 ℃條件下表達(dá)量最高。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白vopD1的高表達(dá)量有利于T3SS分泌通道的完善，釋放分泌蛋白，表現(xiàn)細(xì)菌毒性。vopS編碼的效應(yīng)蛋白可導(dǎo)致細(xì)胞變圓和通過抑制RhoB的鳥苷三磷酸酶導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的崩潰，并且vopS可以使AMPylation 阻止Rho家族的鳥苷三磷酸酶與下游的效應(yīng)蛋白反應(yīng)，因此抑制受感染細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白的重排[17]。圖1a 、1c顯示，副溶血弧菌ATCC17802和JA21的vopS基因分別在16 ℃和25 ℃條件下表達(dá)量最高，暗示2株菌分別在16 ℃和25 ℃溫度下，其相關(guān)毒素分泌較多。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明副溶血弧菌ATCC17802、JA21在不同的環(huán)境溫度下表現(xiàn)對(duì)宿主細(xì)胞不同的細(xì)胞毒性作用，即它們表現(xiàn)最強(qiáng)細(xì)胞毒性的溫度不同。副溶血弧菌ATCC17802和JA21的T3SS1分別在16 ℃和25 ℃表達(dá)量最高，二者的差異可能是由于菌株來源不同，菌株宿主的生存環(huán)境溫度有所差異，造成了溫度調(diào)控的多樣性。呂遠(yuǎn)志[24]在研究遲緩愛德華氏菌的雙組份系統(tǒng)的毒力調(diào)控機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，在相同的溫度條件下，不同來源的2株菌的T3SS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EseBCD的分泌量差異很大，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象與本實(shí)驗(yàn)相似。Zhou等[25]研究表明副溶血弧菌T3SS1主要受exsACDE操縱子的調(diào)控，在誘導(dǎo)條件下ExsA蛋白促進(jìn)T3SS1介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的表達(dá)，而ExsD可以結(jié)合ExsA從而阻斷其對(duì)T3SS1表達(dá)的促進(jìn)作用，ExsC結(jié)合ExsD 釋放ExsA, 從而促進(jìn)T3SS1的表達(dá)。Kodama等[26]研究證明，H-NS蛋白能夠通過抑制exsA基因的表達(dá)來調(diào)控T3SS1的表達(dá)，而H-NS蛋白能夠響應(yīng)環(huán)境刺激對(duì)許多系統(tǒng)起調(diào)控作用，因此溫度對(duì)副溶血弧菌T3SS1表達(dá)的影響是否與H-NS蛋白和exsACDE操縱子響應(yīng)環(huán)境溫度有關(guān)及其響應(yīng)機(jī)制仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

副溶血弧菌T3SS2位于染色體2的毒力島上，具有腸毒性，在感染過程中發(fā)揮重要作用。vcrD2β和vscC2β分別編碼T3SS2內(nèi)膜蛋白和外膜蛋白，這2種蛋白是組成T3SS2分泌裝置基體的一部分。圖1b、1d顯示，副溶血弧菌ATCC17802和JA21的vscC2β、vcrD2β基因都是在25 ℃表達(dá)量最高，暗示在25 ℃條件下，副溶血弧菌T3SS2的基底裝置部分組裝最多。vopP2β編碼的效應(yīng)蛋白能活化激酶催化環(huán)結(jié)構(gòu)中保守的賴氨酸乙酰化，阻止ATP的結(jié)合，最終組織激酶的磷酸化[19]。圖1d顯示JA21的vopP2β基因在25 ℃和37 ℃條件下表達(dá)量遠(yuǎn)高于16 ℃和20 ℃，提示副溶血弧菌JA21的T3SS2的效應(yīng)蛋白基因可能在高溫環(huán)境下表達(dá)量高，在低溫環(huán)境下表達(dá)量低。圖1b、1d顯示，副溶血弧菌ATCC17802和JA21的 vopP2β基因都在25 ℃下表達(dá)量最高，暗示在該溫度下T3SS2分泌的毒力因子最多。由效應(yīng)蛋白的功能描述可知，副溶血弧菌的T3SS2能夠破壞腸道組織，誘導(dǎo)腹瀉，并且具有一定的細(xì)胞毒性，是發(fā)揮感染作用的重要毒力因子。本文研究顯示，在25 ℃下，2株副溶血弧菌的T3SS2表達(dá)量均最高；而且陳星等[27]研究表明，副溶血弧菌耐熱直接溶血素基因tdh也在25 ℃表達(dá)量最高，溶血活性最強(qiáng)；由此暗示此溫度下，養(yǎng)殖環(huán)境中的副溶血弧菌對(duì)受感染宿主有較強(qiáng)的致病性。

本實(shí)驗(yàn)還研究了副溶血弧菌從不同培養(yǎng)溫度轉(zhuǎn)入人體溫度37 ℃培養(yǎng)1， 2， 3和4 h后T3SS基因的表達(dá)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如2.2.2所示，2株副溶血弧菌從不同的培養(yǎng)溫度轉(zhuǎn)入到應(yīng)激溫度37 ℃后，T3SS基因的表達(dá)量明顯升高，其中副溶血弧菌ATCC17802從不同培養(yǎng)溫度轉(zhuǎn)入37 ℃后2 h，vopD1的表達(dá)量升高異常顯著。vopD1是T3SS1的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在形成T3SS1的早期階段，細(xì)菌只具備橫跨膜的環(huán)狀基底部分和在此基礎(chǔ)上突出的針管狀裝置，當(dāng)細(xì)菌與宿主細(xì)胞接觸后，T3SS1通過針管狀通道輸出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白安裝到針管結(jié)構(gòu)的頂端，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在靶細(xì)胞膜上形成孔洞，效應(yīng)蛋白通過孔洞進(jìn)入宿主細(xì)胞[28]。副溶血弧菌ATCC17802的vopD1表達(dá)量的大量升高，可能是由于溫度應(yīng)激條件能誘導(dǎo)副溶血弧菌釋放轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，完善分泌通道，釋放分泌蛋白。

應(yīng)激條件下2株菌T3SS基因的表達(dá)表現(xiàn)出顯著的時(shí)間依賴性，表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，4 h后T3SS表達(dá)量明顯降低，由于37 ℃是模擬人體溫度，可以猜測(cè)副溶血弧菌被誤食進(jìn)入人體后，前3 h T3SS的表達(dá)量是最高的，即副溶血弧菌分泌的毒素較多，隨后T3SS基因表達(dá)量降低。比較2株副溶血弧菌轉(zhuǎn)入37 ℃后T3SS基因表達(dá)量的變化，可以發(fā)現(xiàn)，ATCC17802的T3SS基因表達(dá)量變化顯著高于JA21，說明ATCC17802對(duì)溫度變化的反應(yīng)更強(qiáng)烈，應(yīng)激條件下毒力因子基因表達(dá)增加顯著。

苑淑賓，朱愛貴[28]認(rèn)為，條件致病菌一般情況下不會(huì)引起養(yǎng)殖動(dòng)物發(fā)生病害，但一些環(huán)境因子，例如溫度、鹽度等均可以調(diào)控其致病性相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而影響細(xì)菌的致病性[29]。龐歡瑛等[15]對(duì)溶藻弧菌T3SS的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白vscO基因的表達(dá)差異進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示vscO基因在28 ℃時(shí)表達(dá)量最高。這與本研究中副溶血弧菌17802和JA21的T3SS在25 ℃表達(dá)量最高相似。Rao等[12]認(rèn)為，遲緩愛德華氏菌在感染過程中經(jīng)歷了由環(huán)境溫度到宿主溫度的變化，T3SS的表達(dá)相應(yīng)的受到溫度的調(diào)控， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在28 ℃條件下，T3SS的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)最高，而在20 ℃條件下，沒有檢測(cè)到T3SS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)， 說明遲緩愛德華氏菌T3SS的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)量在不同培養(yǎng)溫度下有較大差異，這與本研究中副溶血弧菌的T3SS基因在不同培養(yǎng)溫度下表達(dá)差異顯著的現(xiàn)象一致。

探究環(huán)境因素對(duì)副溶血弧菌致病力的影響，將有助于揭示副溶血弧菌的致病規(guī)律。綜上研究，溫度的變化對(duì)副溶血弧菌T3SS基因的表達(dá)具有顯著的影響，但是不同的基因?qū)囟鹊捻憫?yīng)不同。由副溶血弧菌全基因組測(cè)序表明[7]，副溶血弧菌的基因結(jié)構(gòu)與耶爾森氏菌相似，已有文獻(xiàn)顯示耶爾森菌的T3SS具有多個(gè)操縱子[30]，副溶血弧菌T3SS基因?qū)囟炔煌捻憫?yīng)特性是否根源于不同基因受不同的操縱子調(diào)控有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

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Received: September 9, 2015

*收稿日期：2015-09-09

作者簡(jiǎn)介：丁曉燕(1990-)，女，山東青島人，碩士研究生.主要從事海洋微生物分子生物學(xué)方面研究.E-mail：dingxiaoyan1010@163.com *通訊作者：曲凌云(1975-)，女，山東榮成人，研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事海洋微生物和海洋分子生物學(xué)以及海水養(yǎng)殖動(dòng)物病原微生物學(xué)方面研究.E-mail：qly@fio.org.cn(王佳實(shí)編輯)

中圖分類號(hào)：X834

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1671-6647(2016)02-0250-10

doi:10.3969/j.issn.1671-6647.2016.02.010

Effect of Temperature on T3SS Gene Expression ofVibrioparahaemolyticus

DING Xiao-yan1,2, QU Ling-yun2，3, WANG Chen1,2, TIAN Xin-xin2,SUN Cheng-jun2, WANG Min-qiang1

(1.CollegeofLifeSciences,YantaiUniversity, Yantai 264005, China;2.TheFirstInstituteofOceanography,SOA, Qingdao 266061, China;3.NationalLaboratoryforMarineScienceandTechnology,FunctionLaboratoryforMarineFisheriesScienceandFoodProductionProcesses,Qingdao 266237, China)

Abstract:T3SS (Type III secretion system) is one of the major virulence factors of Vibrio parahaemolyticus, which could deliver pathogenic virulence factors or effectors to eukaryotic host cells, and temperature is one of the key ecological factors which could influence gene expression. We can compare the virulence of strains which in different culture temperature and stress conditionsby comparing the expression level of T3SS genes, including vcrD1, vopS, vopD1, vscC2β, vcrD2β, vopP2β, which encode T3SS1 inner membrane protein, T3SS1 effector, T3SS1 translocator, T3SS2 outer membrane protein, T3SS2 inner membrane protein and T3SS2 effector, respectively. In this paper, we extracted total RNA from two kinds of Vibrio parahaemolyticus ATCC17802 and JA21 cultured under different temperature and stress condition. By means of established fluorescence quantitative RT-PCR method which using pvuA as the internal standard gene and the ΔΔCt method as the calculation method，the transcription changes of the T3SS mRNA were studied. The results showed that in V. parahaemolyticus 17802, T3SS1 exhibited highest expression at 16℃ while T3SS2 exhibited highest expression at 25℃. In V. parahaemolyticus JA21, both T3SS1 and T3SS2 exhibited highest expression at 25℃. The expression level of T3SS of the 2 strains V. parahaemolyticus changed over time in response to stress condition, and were significantly increased compared to control group at 1h after transporting from culture temperature into stress condition. After the peak point, the expression level dropped down. This research provides a scientific basis for the study of the relationship between the environmental factors and the pathogenicity of Vibrio parahaemolyticus.

Key words:V. parahaemolyticus; T3SS; RT-PCR; gene expression

資助項(xiàng)目：國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目——海洋水產(chǎn)病害實(shí)用化檢測(cè)及預(yù)警技術(shù)的建立與應(yīng)用(2012BAD17B01)；青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室鰲山科技創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目——近海健康養(yǎng)殖關(guān)鍵技術(shù)研究與新生產(chǎn)模式構(gòu)建(2015ASKJ02-03)；海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)——重要魚類增養(yǎng)殖區(qū)致病細(xì)菌基因芯片檢測(cè)技術(shù)研究開發(fā)與示范(201105007-1)；山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)——重要水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治替代產(chǎn)品(2014ZZCX06205)；泰山學(xué)者海外人才項(xiàng)目