劉從進宋潔平毛應啟梁王淵愷朱匯慶張光明劉興黨

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脛骨內注射大鼠骨轉移疼痛模型的顯像研究

劉從進1宋潔平2毛應啟梁3王淵愷1朱匯慶1張光明1劉興黨1

【摘要】目的：探討脛骨內注射法建立的大鼠乳腺癌骨轉移疼痛模型骨病灶的影像學確認方法。方法：將Walker 256大鼠乳腺癌腹水瘤注射入Wistar大鼠脛骨腔內，制作乳腺癌骨癌痛模型；以脛骨內注射等量PBS溶液作為對照組。使用von-Frey法，測量大鼠后足機械痛覺閾值，觀察各組疼痛變化。對模型組和對照組進行99mTc-MDP骨顯像和CT成像，觀察骨病灶的骨代謝變化及骨質結構的變化。結果：造模的第3～5天，乳腺癌骨轉移疼痛大鼠的機械痛覺閾值較基礎值明顯下降（P ＜0.01），并持續(xù)下降83.2%左右，至第9天左右達到最痛（P ＜0.001），后下降曲線趨于緩慢變化。造模3～5天后，模型組機械痛覺閾值顯著低于對照組（P ＜0.01），這個差別持續(xù)增大至第9天左右。99mTc-MDP骨顯像顯示所有模型組大鼠脛骨種植腫瘤細胞處放射性攝取顯著高于對側，CT見造模側脛骨上段骨質破壞，對側骨質結構正常，未見其他部位骨病灶存在。而對照組所有大鼠骨顯像示兩側脛骨放射性分布對稱，CT顯示兩側骨質結構正常。結論：脛骨內注射法大鼠骨癌痛模型疼痛確切。99mTc-MDP骨顯像以及CT可以從骨代謝和骨結構評估骨癌痛模型病灶的發(fā)生，是確認此類骨轉移疼痛模型造模的成功較好的影像學方法。

【關鍵詞】骨癌痛模型；99mTc-MDP；骨顯像；X線計算機，體層攝影術；機械痛覺閾值

腫瘤骨轉移疼痛是影響晚期腫瘤患者生命質量的重要因素，是臨床和研究中比較受到關注的方向之一［1-3］。使用合適穩(wěn)定的動物模型是基礎研究的重要方法，以骨轉移疼痛為主要研究目的、通過向雌性大鼠脛骨內注射Walker256乳腺癌細胞是比較成熟的造模方法［4-5］。臨床上核素骨顯像和CT在骨病灶檢出上具有各自的優(yōu)勢，本研究中核素骨顯像和CT在脛骨內注射骨轉移模型中同樣具有顯像識別價值，有了更多的體內顯像手段，有助于我們對模型制作進行更直接的影像學評估。

方 法

1.材料

1.1實驗動物：雌性Wistar大鼠（體重70～-80g，140～160g），購自中國科學院上海實驗動物中心。動物飼養(yǎng)于12h/12h晝夜交替，室溫22±1℃環(huán)境中，自由攝食和飲水，在實驗環(huán)境中適應1周后進行實驗。每次行為實驗前均進行環(huán)境適應性訓練，以排除應激干擾。所有實驗均嚴格按照國際實驗動物使用準則對實驗動物進行處理。32只大鼠隨機分2組：模型大鼠24只，對照組8只。

1.2腫瘤細胞來源：Walker256 大鼠乳腺癌細胞由復旦大學上海醫(yī)學院中西醫(yī)結合系實驗室提供。

1.3. 試劑/藥品：99mTc-MDP購買自上海欣科醫(yī)藥有限公司。

1.4. 儀器設備：SPECT/CT：SymbiaT16，Siemens， 美國

2.方法

2.1 動物模型制作：參照文獻［5］培養(yǎng)獲得Walker256腹水瘤細胞。

大鼠使用10%水合氯醛（4ml/kg）腹腔注射麻醉，以大鼠腳趾對有齒鑷鉗夾無反應為麻醉滿意指標。微量進樣器依次吸入：1μl空氣、2μl明膠海綿水溶液、lμl空氣、4μl腫瘤細胞或者PBS溶液（用于對照組）。酒精消毒待手術部位皮膚后，使用文獻中［5］的改良法，不暴露脛骨平臺，用7號針頭在右膝關節(jié)髕韌帶內側緣沿脛骨縱軸往脛骨遠端鉆約1cm，然后將準備好的微量進樣器的內容物注射入對應的各組骨髓腔內。最后均推入2μl凝膠海綿溶液封口。

2.2 von Frey機械痛覺超敏測定：大鼠置于不銹鋼鋼絲網底的特制有機玻璃盒子中，保持環(huán)境安靜，室溫21～23℃，讓大鼠適應20min后，根據(jù)Dixon介紹的up-and-down法：將一系列von Frey細絲按照一定的順序刺激大鼠腳掌中部皮膚，觀察大鼠縮足反應。大鼠對von Frey細絲的刺激有縮足動作稱為陽性反應，反之成為陰性反應。刺激從2.0g開始，當陽性反應時，改用低一級刺激，當陰性反應時，改用高一級的刺激。從第一次陽性反應后再測試5次，然后用軟件計算出50% von Frey反應閾值作為機械性痛覺閾值。

2.399mTc-MDP骨顯像、CT掃描及圖像分析：造模后10d行99mTc-MDP骨顯像。大鼠10%水合氯醛（4ml/kg）腹腔注射麻醉后，行尾靜脈給藥，每只大鼠1mCi的99mTc-MDP，2h后，再行腹腔麻醉，并將大鼠固定于硬紙板上，使用Siemens symbiat16 SPECT/CT行靜態(tài)骨掃描顯像。采集參數(shù)：Count：1000Kcts；zoom：1.23；Matrix-Size：256×256。采集結束后使用工作站對數(shù)據(jù)進行處理，得到可視的骨掃描顯像。觀察組件放射性攝取差異。在Image J （National Institute of Health，USA）軟件中使用ROI方法比較分析兩側后肢脛骨上段放射性計數(shù)。

骨顯像結束后即刻行CT掃描。使用SiemensSymbia T16 SPECT/CT的16排CT掃描，采集參數(shù)：120kV，100mAs。窗寬窗位設為骨窗。圖像分析：視覺觀察，發(fā)現(xiàn)骨質破壞記為陽性，否則為陰性。

結 果

1.機械疼痛閾值

實驗組大鼠的基礎痛覺閾值（BSL：造模前1周內3次測痛結果平均值）右側為11.05±0.35g，左側為11.40±0.25g，對照組兩側基礎痛覺閾值分別為11.77±0.34g和11.63±0.13g，各組數(shù)據(jù)之間無統(tǒng)計學差異（P ＞0.05）。模型組造模側（右側）肢體的疼痛隨后迅速加重，至第3天即明顯低于對側及對照組的左右側（P ＜0.01）。至第7～9天，疼痛基本達到最低水平位置，變化趨于穩(wěn)定，在第9天，痛覺閾值已降低至1.86±1.10g，下降了約83.2%。實驗組左側后肢雖沒有進行造模手術，但觀察到與造模側同步的疼痛感覺變化，幅度上略好于造模側。對照組兩側后肢痛覺閾值隨著測痛次數(shù)的增加，出現(xiàn)輕微的下降，并在第13天時左側后肢有比基礎值統(tǒng)計學差異的降低（P ＜0.05）。見圖1。

2.99mTc-MDP骨顯像

造模第10天使用西門子Symbia T16 SPECT進行大鼠靜態(tài)顯像（圖2），圖像導出DICOM格式后用Image J計算右側與左側脛骨上段放射性攝取比值（R/L），對照組比值為：1.03±0.06，而模型組比值為：1.23±0.11，兩組均數(shù)比較P＜0.001。

3.CT骨形態(tài)及離體骨組織形態(tài)

造模第10天，使用西門子Symbia T16所帶CT對大鼠進行X線斷層顯像，如圖3所示，模型組均見到造模側骨質破壞，其中1只大鼠造模處見軟組織腫塊，而對側（左側）骨結構未見異常。對照組兩側脛骨CT顯像均未見異常。第28天處死大鼠取離體脛骨，可見模型組造模脛骨色澤黯啞，表面不光滑，骨質破壞，變脆易折斷。對照組脛骨色澤光亮，骨質結構完整。

圖1 造模術后兩組大鼠左右后肢機械痛覺閾值變化。模型組造模側肢體機械痛覺閾值顯著下降，同時對側同步下降，出現(xiàn)鏡像疼痛。對照組隨著測痛次數(shù)增加，痛覺閾值略有下降。Model：實驗組，Control：對照組。R：右側后肢（造模側），L：左側后肢。

圖299mTc-MDP骨顯像。 A.對照組，兩側脛骨放射性攝取基本對稱。B.模型組，右側脛骨放射性攝取顯著高于對側。

圖3 大鼠CT顯像及離體骨組織形態(tài)。A.對照組，CT見兩側脛骨骨質結構正常，離體右脛骨見形態(tài)正常，骨表面光滑，色澤光亮。B.模型組，CT見右側脛骨骨質破壞，左側正常；離體右側脛骨色澤黯啞，表面不光滑，骨質破壞。

討 論

骨癌痛模型是研究腫瘤骨轉移疼痛的主要工具，目前造模包括心內注射腫瘤細胞、靜脈注射腫瘤細胞和脛骨內注射腫瘤細胞三種主要的方法。前兩種方法主要在裸鼠中開展，模型成功率較低，且容易引起其他臟器部位轉移，骨轉移灶位置不確切，模型動物存活時間短等局限。脛骨內注射相對前兩種方法在機制上不能完全代表血運轉移的發(fā)生，但其造模成功率高，轉移部位確切，誘發(fā)的轉移性疼痛顯著，且模型動物存活時間較長［6-7］。對以疼痛為研究目的的研究具有非常高的價值。本試驗中使用了毛應啟梁等發(fā)表的改良造模方法，用7號針脛骨平臺經皮鉆孔，避免暴露脛骨，減輕實驗動物造模創(chuàng)傷。使用明膠封閉腫瘤細胞在微量注射器后進行注射，有效防止腫瘤細胞在皮下骨外種植，本試驗中僅1例大鼠造模處出現(xiàn)軟組織腫塊，造模時腫瘤細胞播撒或脛骨內腫瘤擴張至脛骨外可能。

在使用von Frey觀察大鼠后肢疼痛時，可以明確腫瘤骨轉移模型的疼痛發(fā)生，第7天后疼痛趨向穩(wěn)定。同時可以觀察到非造模側后肢疼痛伴隨發(fā)生，考慮認為鏡像疼痛，與既往文獻報道一致［8］，這種現(xiàn)象機制尚不清楚，體液機制認為是體液內炎癥因子致使對側脊髓神經根的炎癥刺激反應，我們在后續(xù)實驗里將對脊髓組織的炎癥因子進行分析比較。對照組大鼠出現(xiàn)痛覺閾值輕微的降低，考慮認為是反復von Frey纖維針刺激大鼠足底后引起的痛覺過敏。

99mTc-MDP骨顯像，在臨床中應用廣泛，是腫瘤骨轉移診斷的重要手段。其對骨病灶高敏感性，能夠發(fā)現(xiàn)較早的骨轉移病灶，但特異性相對較差。本試驗中使用臨床使用的SPECT/CT設備，在150g左右的大鼠顯像上，使用低能高分辨準直器，顯像能力尚不能達到足夠清晰，使用針孔準直器有可能改善圖像質量［9］。西門子Symbia T16所帶CT為16排診斷級別CT，在大鼠斷層顯像中，能夠清晰顯示脛骨橫斷面的結構，診斷骨質破壞的結果與后續(xù)離體組織隨訪一致，診斷準確性高。

近年來，micro-SPECT的應用愈來愈廣泛，對于動物實驗是非常有價值的設備。但很多基礎研究者對核醫(yī)學的相關設備和技術手段缺乏足夠的了解，較少有作者使用骨顯像的方法驗證骨癌痛模型，故核醫(yī)學在輔助基礎研究中尚有很多可以拓展的空間。尤其是micro-SPECT/CT和micro-PET/CT等混合顯像設備，能夠從功能代謝以及微小解剖結構上幫助研究者觀察活體內的組織內在變化。

參 考 文 獻

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中國醫(yī)學計算機成像雜志，2016，22：269-273

Chin Comput Med Imag，2016，22：269-273

1 Department of Nuclear Medicine， Huashan Hospital of Fudan University

2 Department of Nuclear Medicine， Dongfang Hospital of Tongji University

3 Shanghai Medical College of Fudan University

Same contribution as the frst author： LIU Cong-jin，SONG Jie-ping

Address： 12 Wulumuqi Middle Rd， Shanghai 200040，P.R.C.

Address Correspondence to LIU Xing-dang （E-mail： xingdliu@yahoo.com）Foundation items： 1. Natural Science Foundation of China No. 81201113；2. Shanghai Municipal Commission of Health and Family Plan Youth Research Project No. 20124Y069

中圖分類號：R445.6

文獻標志碼：A

文章編號：1006-5741（2016）-03-0269-05

收稿時間：（2016.02.04；修回時間：2016.04.07）

作者單位：1 復旦大學附屬華山醫(yī)院核醫(yī)學科2 同濟大學大學附屬東方醫(yī)院核醫(yī)學科3 復旦大學上海醫(yī)學院中西醫(yī)結合系并列第一作者：劉從進，宋潔平

通信地址：上海市烏魯木齊中路12號， 上海 200040

通信作者：劉興黨（電子郵箱：xingdliu@yahoo.com）

基金項目：國家自然科學基金 No. 81201113；上海市衛(wèi)計委青年科學基金項目（20124Y069）

Bone Imaging Study in Rat Bone Metastatic Pain Model via Tibia Injection

LIU Cong-jin1， SONG Jie-ping2， MAO Ying-qi-liang3， WANG Yuan-kai1，ZHU Hui-qing1， ZHANG Guang-ming1， LIU Xing-dang1

【Abstract】Purpose： To investigate the imaging methods to confirm bone lesions in rat bone metastatic pain model via tibia injection of breast cancer cells. Methods： Bone cancer pain model of breast cancer were made by injection of walker 256 mammary carcinoma cells cultured in ascites into Wistar rats' tibial cavity； The other group of rats were injected with equal volume of PBS solution into tibial cavity which was take as the control group. von-Frey method was used to measure the mechanical pain threshold of the rat back feet to observe the changes of pain in each group.99mTc-MDP bone imaging and CT imaging were performed in the model group and control group to observe the changes of bone metabolism and bone structure. Results： Three to fve days after the model was made，the mechanical pain threshold of the breast cancer bone metastasis pain rats model was decreased signifcantly when compared to the basic values （P ＜0.01）， and was continued to decline by about 83.2%， on 9th day the pain was reached the most heavy degree （P ＜0.001）， and after that the decline curve was changed slowly. Three to fve days after the model was made， the mechanical pain threshold in the model group was signifcantly lower than thatin the control group （P ＜0.01）. The difference was enlarged to the biggest while in the following 9 days. The results of99mTc-MDP bone scintigraphy showed that the location of tibia planted tumor cells in model group had signifcantly higher radioactivity than the contralateral tibia bone. CT scans showed bone destruction in the same side tibia. The bone structure of the other side of tibia was normal. While in the control group bone imaging showed that both sides of the tibia had similar radioactivity， and CT scans showed normal bone structure in both sides. Conclusion： Intratibia injection method of rat bone cancer model can arise exactly pain sites.99mTc-MDP bone scintigraphy and X-ray CT imaging can evaluate the occurrence of lesions of bone cancer pain from bone metabolism and bone structure.99mTc-MDP bone scintigraphy and X-ray CT imaging are suitable imaging methods to confrm such intratibia injection bone metastasis pain rat model..

【Key words】Bone cancer pain model；99mTc-MDP； Bone scintigraphy； X-ray computed，tomography； Mechanical pain threshold