劉莉等

摘要：試驗(yàn)設(shè)計(jì)了南美白對(duì)蝦超氧岐化酶和酚氧化酶的熒光定量PCR檢測的特異性引物，用于檢測肝胰腺中超氧化物歧化酶（SOD）和酚氧化酶（PO）的表達(dá)。該方法避免了血清學(xué)檢測免疫指標(biāo)的不穩(wěn)定性、測定值波動(dòng)性較大的缺點(diǎn)，可作為評(píng)估南美白對(duì)蝦免疫狀態(tài)的一種分子檢測方法。

關(guān)鍵詞：南美白對(duì)蝦；肝胰腺；SOD；PO；熒光定量PCR

中圖分類號(hào)： S945.4+9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）09-0290-02

南美白對(duì)蝦屬甲殼類動(dòng)物，其免疫主要為非特異性免疫。包括體液免疫中的一些非特異性的酶或因子來進(jìn)行的[1-2]?？寡趸甘菬o脊椎動(dòng)物機(jī)體非特異性免疫的一個(gè)重要方面，其中SOD是一種能夠催化超氧化物通過歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為O2和H2O2的酶。超氧化物歧化酶（SOD）是抗氧化系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用的酶，不僅具有清除體內(nèi)自由基的作用，而且在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中具有重要的作用[3-4]。酚氧化酶（PO）是一種含銅的氧化還原酶，能夠催化單酚羥化成二酚，再把二酚氧化成醌，醌在非酶促條件下形成反應(yīng)終產(chǎn)物黑色素。其反應(yīng)鏈的短暫中間產(chǎn)物擁有很高的生物毒性，能夠抑制病原體胞外蛋白酶以及幾丁質(zhì)酶的活性，屬于一種酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)，在南美白對(duì)蝦抵抗病原菌侵襲過程中具有重要作用[5-9]。

目前檢測南美白對(duì)蝦免疫活性因子通常是通過采集血清，采用生化反應(yīng)方法檢測免疫相關(guān)酶。由于采集過程及檢測過程，酶活性極易受外界環(huán)境的影響，常導(dǎo)致檢測結(jié)果波動(dòng)性很大，檢測的可靠性受影響。酶的產(chǎn)生是通過基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯及后加工形成的，其轉(zhuǎn)錄水平也可反映機(jī)體的免疫狀態(tài)。蝦肝胰腺是其血細(xì)胞產(chǎn)生的主要場所，肝胰腺組織免疫因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)也可作為評(píng)價(jià)機(jī)體免疫能力的指標(biāo)之一。熒光定量PCR檢測技術(shù)已經(jīng)成為國際上檢測基因表達(dá)通用的方法，能對(duì)低豐度mRNA水平進(jìn)行定量分析[10]。設(shè)計(jì)特異性強(qiáng)的引物以及合適的反應(yīng)條件是利用熒光定量PCR檢測南美白對(duì)蝦免疫相關(guān)因子的關(guān)鍵。本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物及反應(yīng)條件可同時(shí)用于檢測南美白對(duì)蝦肝胰腺SOD和PO的轉(zhuǎn)錄相對(duì)定量表達(dá)檢測，為今后準(zhǔn)確分析其南美白對(duì)蝦免疫狀態(tài)提供新的方法。

1材料與方法

1.1材料

南美白對(duì)蝦來自浙江省紹興縣某養(yǎng)殖場，SYBGreen反應(yīng)預(yù)混液購自Bio-Rad公司，M-MLV酶、dNTP、RNase抑制劑購自TaKaRa（大連）公司，Trizol購自Invotrigen公司。

1.2肝胰腺總 RNA的提取

取南美白對(duì)蝦完整肝胰腺組織，加入500 μL Trizol裂解液，用研磨棒研磨，等徹底勻漿后，取50 μL勻漿液加入1 mL Trizol 繼續(xù)裂解5 min。其余勻漿液置-80 ℃保存?zhèn)溆茫驅(qū)⑼暾我认僭谝旱兴賰龊笾糜谟?80 ℃下保存。使用時(shí)將組織全部碾磨后，取100 mg加入1 mL Trizol裂解，其余組織粉末置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取出的50 μL勻漿液或100 mg組織粉末繼續(xù)裂解5 min后，12 000 r/min條件下離心2 min，吸取上清至新的離心管。加入200 μL三氯甲烷，渦旋混勻，12 000 r/min條件下離心15 min，吸取上清。加入等體積異丙醇，顛倒混勻數(shù)次，靜置10 min，12 000 r/min 條件下離心10 min，棄上清。用500 μL DEPC水配制的70%乙醇洗滌沉淀，12 000 r/min 條件下離心 5 min，棄去上清。100 μL DEPC水溶解RNA。 測定RNA濃度和純度后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3引物設(shè)計(jì)與合成

引物是根據(jù)GenBank公布的南美白對(duì)蝦SOD（登錄號(hào)：AY486424.1）、PO（登錄號(hào)：JN393011.1）及β-actin內(nèi)參基因序列（登錄號(hào)：JF288784.1），由軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)和手工修改后獲得（表1），均由蘇州金維智生物科技有限公司合成。

1.4cDNA合成

取1 μg 總RNA為模板，加入1 μL 10 mmol/L dNTP、1 μL 50 mmol/L Oligo（dT）15，加DEPC水至總體積6.25 μL，65 ℃變性5 min，冰上驟冷2 min。上述反應(yīng)液加入2 μL 5× M-MLV buffer、0.25 μL RNA酶抑制劑、0.5 μL MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、1 μL 10 mmol/L二硫蘇糖醇，使最終反應(yīng)總體積達(dá) 10 μL。42 ℃反應(yīng)1 h后，65 ℃孵育10 min，cDNA合成完畢。表1熒光定量PCR所用引物

檢測基因名稱引物序列（5′→3′）擴(kuò)增長度（bp）SOD SOD-F：CGCCCTTGAACCTCACATCT；SOD-R：ATTGCGCTTACGTCATTGGC135POPO-F：AATGACCGCGTTGAGGAGTT；PO-R：AGTGGGATCTTCAGCTTGCC134β-actin（內(nèi)參）β-actin-F：CGAGCGAGAAATCGTTCGTG；β-actin-R：GAATGAGGGCTGGAACAGGG187

合成的cDNA加入90 μL無菌雙蒸水，用于后續(xù)熒光定量PCR擴(kuò)增。1.5熒光定量的反應(yīng)體系及條件

取5 μL上述合成的cDNA稀釋液作為擴(kuò)增模板，加入2×Sybgreen反應(yīng)預(yù)混液12.5 μL，分別加入5 μmol/L相應(yīng)特異性上、下游引物各0.5 μL，加6.5 μL無菌雙蒸水，使反應(yīng)總體系達(dá)25 μL，置于熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；60～90 ℃熔解曲線。

2結(jié)果與分析

2.1熒光定量PCR擴(kuò)增效果

從擴(kuò)增曲線可以看出，SOD、PO及內(nèi)參基因β-actin的擴(kuò)增曲線均較好，曲線拐點(diǎn)清楚，基線平，無上揚(yáng)現(xiàn)象；SOD的CT值為23.85，PO的CT值為28.33，能較好地反映各基因的表達(dá)差異（圖1）。通過CT值計(jì)算該樣品中SOD和PO表達(dá)量相對(duì)于β-actin的表達(dá)量分別為0.140 63、0.006 30倍。

2.2熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線

從擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線看，SOD、PO及內(nèi)參基因β-actin均為單峰，且峰值較高（圖2），表明各擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性較好，且擴(kuò)增效率較高。

2.3熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測

將熒光定量PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測，結(jié)果顯示SOD、PO及內(nèi)參基因β-actin的各擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶單一，亮度較好，并能一定程度上看出各基因的表達(dá)差異（圖3）。進(jìn)一步證實(shí)了其較好的擴(kuò)增效率和較高的擴(kuò)增特異性。

3結(jié)論與討論

非特異性免疫因子的測定是評(píng)估南美白對(duì)蝦免疫狀態(tài)的主要指標(biāo)，建立可靠的檢測方法對(duì)于南美白對(duì)蝦的免疫學(xué)研究、抗病育種研究等都具有重要意義。傳統(tǒng)的體液免疫指標(biāo)的測定常采用酶法檢測，但易受多種因素干擾，測定值偏差較大。近幾年，隨著分子生物學(xué)迅猛發(fā)展，熒光定量PCR方法開始被廣泛應(yīng)用于多種免疫因子定量檢測[11-12]。熒光定量PCR檢測方法的可靠性與所設(shè)計(jì)引物的特異性和擴(kuò)增有效性密切相關(guān)。本方法針對(duì)SOD和PO等2個(gè)重要的非特異免疫指標(biāo)設(shè)計(jì)了特異性較好、擴(kuò)增效率較高的引物，建立了利用熒光定量PCR方法對(duì)南美白對(duì)蝦肝胰腺SOD、PO的檢測方法。該方法特異性強(qiáng)，敏感性高，克服了酶法測定易波動(dòng)的問題，適合南美白對(duì)蝦免疫活力的評(píng)估。

與酶法檢測技術(shù)比較，本方法所提供的南美白對(duì)蝦肝胰腺SOD、PO的熒光定量PCR檢測方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）所采用的肝胰腺組織較對(duì)蝦血液采集更容易。（2）所采集的組織直接用Trizol處理或通過速凍方式保存，可有效減少RNA降解；較血清采集過程可能發(fā)生的溶血或其他導(dǎo)致酶失活的因素更易于控制，保證結(jié)果的可靠性。（3）設(shè)計(jì)的引物特異性好，擴(kuò)增效率高，提高了檢測的準(zhǔn)確性。（4）采用相對(duì)定量方式，通過與內(nèi)參基因表達(dá)量的對(duì)比，可同時(shí)測定多個(gè)免疫相關(guān)因子。

參考文獻(xiàn)：

[1]黃輝洋，李少菁，王桂忠. 甲殼動(dòng)物酚氧化酶活力及其在養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J]. 海洋通報(bào)，2000，19（3）：79-84.

[2]李光，樊景鳳，林鳳翱，等. 對(duì)蝦的免疫機(jī)制及其疾病免疫預(yù)防的研究進(jìn)展[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2007，26（1）：56-60.

[3]劉恒，李光友. 免疫多糖對(duì)養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦作用的研究[J]. 海洋與湖沼，1998，29（2）：113-118.

[4]丁美麗，林林，李光友，等. 有機(jī)污染對(duì)中國對(duì)蝦體內(nèi)外環(huán)境影響的研究[J]. 海洋與湖沼，1997，28（1）：7-12.

[5]王雷，李光友，毛遠(yuǎn)興. 中國對(duì)蝦血淋巴中的抗菌、溶菌活力與酚氧化酶活力的測定及其特性研究[J]. 海洋與湖沼，1995，26（2）：179-185.

[6]李天道，于佳，俞開康. 中國對(duì)蝦血清中酚氧化酶活力研究[J]. 海洋湖沼通報(bào)，1998（1）：51-56.

[7]孟凡倫，張玉臻，孔健，等. 甲殼動(dòng)物中的酚氧化酶原激活系統(tǒng)研究評(píng)價(jià)[J]. 海洋與湖沼，1999，30（1）：110-116.

[8]李桂英，宋曉玲，孫艷，等. 幾株腸道益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦非特異免疫力和抗病力的影響[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué)，2011，18（6）：1358-1367.

[9]胡毅，譚北平，麥康森，等. 飼料中益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長、腸道菌群及部分免疫指標(biāo)的影響[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué)，2008，15（2）：244-251.

[10]王科，王曉雄，石炳毅. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR在細(xì)胞因子mRNA檢測研究中的應(yīng)用[J]. 北京生物醫(yī)學(xué)工程，2006，25（2）：217-221.

[11]Zokaeifar H，Balcázar J L，Saad C R，et al. Effects of Bacillus subtilis on the growth performance，digestive enzymes，immune gene expression and disease resistance of white shrimp，Litopenaeus vannamei[J]. Fish & Shellfish Immunology，2012，33（4）：683-689.

[12]Palmer C V，Bythell J C，Willis B L. A comparative study of phenoloxidase activity in diseased and bleached colonies of the coral Acropora millepora[J]. Development & Comparative Immunology，2011，35（10）：1098-1101.