基于腎陽虛大鼠HPA軸的不同針刺因素正交設(shè)計研究

閔友江，鄧玲，洪恩四（江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南昌 330006）

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·動物實驗·

基于腎陽虛大鼠HPA軸的不同針刺因素正交設(shè)計研究

閔友江，鄧玲，洪恩四
（江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南昌 330006）

【摘要】目的 觀察針刺對腎陽虛大鼠血清促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）、垂體促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）及其 mRNA表達(dá)的影響，探索影響針刺效應(yīng)的主次因素和針刺參數(shù)的最佳組合。方法 基于氫化可的松肌肉注射制作的皮質(zhì)酮腎陽虛實驗動物模型，以血清CRH、垂體ACTH及其mRNA表達(dá)為觀察指標(biāo)，采用L9（34）正交表對影響針刺效應(yīng)的4因素（穴位的選擇、捻針角度、捻針頻率、捻針時間）3水平安排試驗，運用計算機控制的針刺手法儀治療腎陽虛大鼠，通過酶聯(lián)免疫檢測血清中CRH、垂體中ACTH的水平和實時熒光定量PCR檢測垂體組織中ACTH mRNA的表達(dá)來比較上述4因素的主次。結(jié)果 上述4因素對針刺效應(yīng)的影響大小依次是捻針時間、捻針頻率、捻針角度及穴位的選擇，其中捻針角度、捻針頻率、捻針時間是影響針刺效應(yīng)的主要因素或次要因素（P＜0.01或P＞0.05）。穴位的選擇是影響針刺效應(yīng)的重要因素或次要因素（P＜0.05或P＞0.05）。結(jié)論 針刺治療腎陽虛大鼠的最佳針刺參數(shù)為針刺腎俞穴，捻針角度為90°，頻率為180次/min，捻針時間為120 s。不同因素對針刺治療腎陽虛大鼠的療效不同，其中捻針時間對療效的影響最大，然后依次為捻針頻率、捻針角度和穴位的選擇。

【關(guān)鍵詞】針刺療法；正交設(shè)計；腎陽虛；HPA軸；大鼠

針灸是通過調(diào)和陰陽、疏通經(jīng)絡(luò)、扶正祛邪等作用來治療疾病的，其中扶正祛邪又是通過針灸能產(chǎn)生補虛瀉實的效應(yīng)來實現(xiàn)的。一般認(rèn)為針灸補虛瀉實的效應(yīng)與機體的機能狀態(tài)、穴位的相對特異性、補瀉手法、刺激量的大小等因素有關(guān)［1-4］。而刺激量的大小又與針刺強度（提插的幅度、捻轉(zhuǎn)的角度、提插捻轉(zhuǎn)的頻率、針具的粗細(xì)、針刺深淺）和作用時間（行針時間、留針時間、針刺間隔時間、針刺次數(shù)或療程）有關(guān)［3］。但對于針刺補瀉效應(yīng)與穴位的相對特異性、刺激量的關(guān)系如何？針刺刺激量能不能做到定量？影響針刺效應(yīng)的主次因素是什么？能否獲取最佳針刺效應(yīng)多因素的最佳組合？對于這些問題，有些學(xué)者［5-7］做過一些理論上的探討或?qū)嶒炑芯?，但存在一些不足之處。為進(jìn)一步客觀、科學(xué)、定量地研究針刺效應(yīng)與不同針刺因素的關(guān)系，本研究在皮質(zhì)酮腎陽虛大鼠模型的基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交表對影響針刺效應(yīng)的4因素（穴位的選擇、捻針角度、捻針頻率、捻針時間）3水平安排試驗，通過采用計算機控制針刺手法儀對實驗性腎陽虛大鼠進(jìn)行針刺效應(yīng)影響因素定性定量化實驗研究，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只SD雄性大鼠［湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供，合格證號 SCXK（湘）2011-0003］，體重為（220±20）g，清潔級，標(biāo)準(zhǔn)配方桿狀飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)水。所有大鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后開始進(jìn)行實驗。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 實驗試劑

氫化可的松注射液，天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn)，5 mL/25 mg，國藥準(zhǔn)字H12020886；CRH、ACTH酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，上海博谷生物科技有限公司生產(chǎn)；Trizol，invitrogen公司生產(chǎn)；DEPC處理水，基爾頓生物科技（上海）有限公司生產(chǎn)；氯仿、異丙醇、無水乙醇，國藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn)；RNaseⅠ，F(xiàn)ermentas公司生產(chǎn)；SYBR Green PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，Thermo公司生產(chǎn)。

1.2.2 儀器與設(shè)備

0.30 mm×13 mm華佗牌一次性針灸針，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司生產(chǎn)；酶標(biāo)儀，芬蘭（Labsystems Multiskan MS）公司生產(chǎn)；洗板機，芬蘭（Thermo Labsystems）公司生產(chǎn)；移液器，吉爾森 P型移液器（Pipetman） 生產(chǎn)；計算機控制針刺手法儀［申請（專利）號 CN200510027586.1，公開（公告）號 CN1709215］，上海中醫(yī)藥大學(xué)研制；旋渦振蕩器，上海青浦瀘西儀器廠生產(chǎn)；手握式電動勻漿機，德國 FLUKO 公司生產(chǎn)；低溫冷凍離心機，Sigma（3K15）公司生產(chǎn)；Real-time檢測儀，ABI（ABI-7300）公司生產(chǎn)；超純水分離系統(tǒng)，美國LABCONCO公司生產(chǎn)。

1.3 動物分組與處理

60只SD雄性大鼠飼養(yǎng)3 d后，按體重查隨機數(shù)字表隨機分為A組（正常組）8只和B組52只。B組造模后，按體重查隨機數(shù)字表隨機分為模型組8只、藥物組8只和治療組36只。治療組再分9個亞組，每組4只。

1.4 模型制備

52只大鼠按照0.03 mg/g·bw劑量肌肉注射氫化可的松注射液，每日1次，連續(xù)注射10 d。模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)為大鼠體重減輕，毛發(fā)失去光澤，弓背，扎堆，反應(yīng)遲鈍，活動減少，陰囊皺縮，尿量明顯增多。

1.5 分組處理方法

1.5.1 藥物組

采用右歸丸配方煎藥灌胃。配方參照《景岳全書》，即肉桂、制附子各6 g，山茱萸、當(dāng)歸各9 g，山藥、枸杞子、鹿角膠、杜仲、菟絲子各12 g，熟地黃24 g。全部藥材從江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房購進(jìn)，煎煮方法參考相關(guān)文獻(xiàn)［8］。按 70 kg體重成年人每日 1劑、每劑400 mL煎劑計算，200 g大鼠的右歸丸煎劑灌服用量換算公式［9］為，大鼠日服總量=人日服總量（400 mL）×大鼠與人體表面積比（0.018）=7.2 mL。分兩次灌服，共治療14 d。

1.5.2 治療組

采用針刺治療，穴位定位根據(jù)《實驗針灸學(xué)》［10］，針刺前剪去相應(yīng)穴位處的毛發(fā)。采用自制的固定器捆綁大鼠，將0.30 mm×13 mm毫針刺入穴位5～7 mm，進(jìn)針后行小幅度提插捻轉(zhuǎn)，然后與針刺手法儀連接，按相應(yīng)參數(shù)進(jìn)行針刺手法操作，留針10 min后再行手法操作1次，再留針10 min后出針。每日1次，共治療14 d。

1.5.2.1 實驗干預(yù)因素設(shè)計

因素 A（針刺穴位的選擇）：根據(jù)前期工作基礎(chǔ)，選擇腎俞穴治療腎陽虛證大鼠；選擇前三里作為對照穴位之一；非穴區(qū)，擬選擇前三里旁開5 mm處的點，作為對照穴位之一。

因素 B（捻針角度）：綜合文獻(xiàn)和項目組成人員的臨床經(jīng)驗，擬將捻針角度設(shè)定為360°、180°和90°3個水平。

因素 C（捻針頻率）：綜合文獻(xiàn)和項目組成人員的臨床經(jīng)驗，擬將捻針頻率設(shè)定為 180次/min、120次/min和60次/min 3個水平。

因素 D（捻針時間）：綜合文獻(xiàn)和和前期研究，擬將每次捻針的時間設(shè)定為120 s、60 s和30 s 3個水平。

影響針刺效應(yīng)的因素有針刺穴位的選擇、捻針角度、捻針頻率、捻針時間，本實驗在腎陽虛大鼠模型的基礎(chǔ)對上述4因素3水平采用正交表安排試驗。查統(tǒng)計表，選擇L9（34）正交設(shè)計表安排實驗。詳見表1。

表1 L9（34）正交設(shè)計實驗因素及水平數(shù)

1.5.2.2 L9（34）正交設(shè)計方案

治療組各亞組具體分組及干預(yù)措施見表2。

1.5.3 模型組和正常組

模型組和正常組大鼠在治療組治療期間進(jìn)行相同的捆綁。

1.6 指標(biāo)檢測及方法

1.6.1 標(biāo)本采集

治療結(jié)束第2天處死全部大鼠。抽取動脈血，離心，取上清液，分裝，-20℃的冰箱中保存?zhèn)溆?。斷頭，用咬骨鉗咬掉顱骨，分離垂體組織，立即投入到液氮中速凍，然后放入-80℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 L9（34）正交設(shè)計具體分組及干預(yù)措施

1.6.2 血清促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）、垂體促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）的檢測

采用酶聯(lián)免疫方法測量其濃度，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6.3 垂體ACTH mRNA表達(dá)的檢測

采用實時熒光定量 PCR。組織總 RNA的抽提按Trizol說明書操作。

cDNA第一條鏈的合成步驟分為，①總RNA中DNA的消除，DNaseⅠ：1 μL；10×DNaseⅠ Buffer：1 μL；總RNA≤1 ng；DEPC-H2O：n μL；總體積為10 μL。反應(yīng)條件為37℃，30 min；Hold，加 1 μL的EDTA；65℃，10 min。②反轉(zhuǎn)錄，按以下體系加入，RNA-Primer Mix：12 μL；5×RT Reaction Buffer：5 μL；25mM dNTPs：1 μL；25 U/μL RNase Inhibitor：1 μL；200 U/μL M-MLV Rtase：1 μL；Oligo（dt）18：1 μL；ddH2O（DNase- free）：4 μL；總體積為25 μL。反應(yīng)程序為37℃， 60 min；85℃，5 min；4℃，5 min；置于-20℃保存。③Real-time PCR擴增，將制備好的 cDNA進(jìn)行 PCR擴增。擴增體系如下，SYBRGreen Mix：12.5 μL；上游引物 F：0.5 μL；下游引物R：0.5 μL；ddH2O：9.5 μL；cDNA模板：2 μL?？傮w積為25 μL。反應(yīng)程序為95℃，10 min （95℃，15 s；60℃，45 s）×40；95℃，15 s；60℃，1 min； 95℃，15 s；60℃，15 s。引物的合成與純化均由上海捷瑞生物科技有限公司提供。ACTH上游引物序列為5'-GCAAAGAACGAAGTCCGTGA-3'，下游引物序列為 5'-GATGGTGCTTGCTGTTGACC-3'。④相對mRNA表達(dá)水平的計算數(shù)據(jù)分析采用 ABI Prism 7300 SDS Software。每個樣品中靶基因的相對 mRNA表達(dá)水平采用以下公式計算，即相對mRNA表達(dá)=2-△Ct×100%，其中△Ct=靶基因Ct值－管家基因Ct值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。正常組、模型組和藥物組比較采用F檢驗及SNK檢驗；L9（34）正交設(shè)計各治療亞組組間比較采用極差分析和正交設(shè)計方差分析，以確定因素各水平的優(yōu)劣、分析因素的主次，找出最佳試驗方案。

2 實驗結(jié)果

2.1 一般情況觀察

大鼠造模后體重減輕，毛發(fā)失去光澤，弓背，扎堆，反應(yīng)遲鈍，活動減少，陰囊皺縮，尿量明顯增多。經(jīng)針刺和右歸丸治療后，治療組和藥物組大鼠食欲增加，體重加重，毛發(fā)漸漸有光澤，喜歡活動，而模型組的大鼠整體情況不佳。

2.2 各組大鼠血清CRH、垂體ACTH水平及其mRNA表達(dá)比較

2.2.1 模型組、正常組和藥物組組間比較

由表3可見，模型組大鼠血清CRH、垂體ACTH水平及其mRNA表達(dá)與正常組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。藥物組大鼠血清CRH和垂體ACTH水平與正常組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。模型組大鼠血清 CRH水平與藥物組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。通過大鼠一般情況的比較及以方測證的結(jié)果，提示采用氫化可的松造模方法是成功的。

表 3 模型組、正常組和藥物組大鼠血清 CRH、垂體 ACTH水平及其mRNA表達(dá)比較 （±s）

表 3 模型組、正常組和藥物組大鼠血清 CRH、垂體 ACTH水平及其mRNA表達(dá)比較 （±s）

注：由于ACTH mRNA檢測的數(shù)值較小，表中ACTH mRNA 所有數(shù)值是×100后的結(jié)果；與模型組比較1）P＜0.01，2）P＜0.05；與藥物組比較3）P＜0.05

組別 　n　CRH（pg/mL） 　ACTH（pg/mL） 　ACTH mRNA模型組 　8 　70.01±2.84 　10.58±0.95 　196.66±9.451）2）正常組 　8 　121.54±11.891）3）12.70±1.782）3）　181.17±7.351）藥物組 8 　106.13±4.441）　11.24±0.91 　219.42±8.94

2.2.2 L9（34）正交設(shè)計各治療組亞組組間比較

表4 L9（34）正交實驗設(shè)計方案及相關(guān)指標(biāo)極差分析

L9（34）正交設(shè)計各治療組亞組組間比較采用極差分析，即直觀分析，R值越大，表示針刺治療效果越好。由表4、5可見，對血清CRH水平的影響從大到小排列順序為穴位選擇、捻針時間、捻針角度、捻針頻率，且最佳組合是A2B3C2D3，即針刺前三里，捻針30 d，捻針角度為180°，頻率為60次/min；對垂體ACTH的影響從大到小排列順序為穴位的選擇、捻針時間、捻針頻率、捻針角度，且最佳組合是 A3B1C3D2，即針刺腎俞穴，捻針角度為360°，頻率為 60次/min，捻針60 s；對垂體ACTH mRNA表達(dá)的影響從大到小排列順序為捻針時間、捻針頻率、捻針角度、穴位的選擇，且最佳組合是A3B3C1D1或 A2B3C1D1，即針刺腎俞穴或前三里，捻針角度為180°，頻率為180次/min，捻針120 s。

結(jié)合表6方差分析的結(jié)果，對血清CRH的影響，各因素都是次要因素，故在極差分析綜合評定排除在外。綜合各因素對垂體中ACTH及其mRNA表達(dá)的影響的分析，最佳組合是 A3B3C1D1，即針刺腎俞穴，捻針角度為90°，頻率為180次/min，捻針時間120 s。對針刺效應(yīng)的影響從大到小排列順序為捻針時間、捻針頻率、捻針角度、穴位的選擇。

綜合以血清CRH、垂體ACTH的水平及其mRNA的表達(dá)為觀察對象進(jìn)行的上述4因素3水平間比較的方差分析結(jié)果顯示，針刺捻針的角度、捻針頻率、捻針時間是影響針刺效應(yīng)的主要因素或次要因素，P＜0.01 或 P＞0.05；穴位的選擇是影響針刺效應(yīng)的重要因素或次要因素，P＜0.05或P＞0.05。從表中F值可看出，F(xiàn)值越大，其因素對針刺效應(yīng)的影響越大。詳見表6。

表5 血清CRH、垂體ACTH水平及其mRNA表達(dá)與各項因素極差分析

表6 以血清CRH、垂體ACTH水平及其mRNA表達(dá)為觀察指標(biāo)的針刺多因素方差分析

3 討論

臨床長期大量使用腎上腺皮質(zhì)激素治療的患者停藥后表現(xiàn)為腎上腺皮質(zhì)功能低下出現(xiàn)腎陽虛一系列癥狀。沈自尹院士［11］幾十年來的研究證實腎陽虛證的物質(zhì)基礎(chǔ)在于下丘腦-垂體-靶腺（腎上腺、甲狀腺、性腺）軸的功能低下。糖皮質(zhì)激素（人類主要為皮質(zhì)醇，大鼠主要為皮質(zhì)酮）是下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA軸）的終末激素，它可以調(diào)節(jié)人體的代謝，認(rèn)知功能，情緒等。下丘腦分泌CRH作用于腺垂體，調(diào)控腺垂體ACTH的分泌，ACTH 又可作用于腎上腺皮質(zhì)，影響 HPA軸終末激素的分泌，由此構(gòu)成了由上到下的順行調(diào)控。同時各激素又可反饋作用于其上級中樞，調(diào)節(jié)上級激素的釋放，從而形成復(fù)雜的調(diào)節(jié)環(huán)路。蔣淑君等［12］研究發(fā)現(xiàn)大劑量的山茱萸提取物能使腎陽虛大鼠含量低下的下丘腦CRH 升高。陳津巖等［13］采用氫化可的松復(fù)制腎陽虛證動物模型，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠下丘腦CRH、血漿ACTH和CORT含量顯著下降，經(jīng)服右歸丸后ACTH和CORT含量顯著上升，下丘腦 CRH含量也有所上升。任大蔚等［14］采用氫化可的松肌肉注射制作皮質(zhì)酮腎陽虛實驗動物模型，模型組大鼠血清CORT、ACTH含量明顯低于正常對照組，經(jīng)艾灸腎俞、關(guān)元后兩者含量都較模型組升高。本實驗中模型組大鼠血清CRH、垂體中ACTH的水平及其mRNA的表達(dá)分別明顯低于正常對照組，右歸丸治療后上述指標(biāo)都有不同程度的升高。另外不同針刺治療組上述指標(biāo)的均值大部分高于模型組，針刺治療腎陽虛證的作用機制可能是針刺能夠使功能低下的HPA軸功能趨于正常。

腎陽虛證模型是中醫(yī)虛證實驗研究中運用得最多且比較成功的動物模型之一。該動物模型是依據(jù)臨床腎陽虛患者腎上腺皮質(zhì)功能低下而設(shè)計的。基于前期研究［9］及按照陳英華等［15］提出的評價腎陽虛動物模型從一般狀態(tài)與實驗檢測、客觀指標(biāo)、藥物反證幾個方面進(jìn)行評價的科學(xué)設(shè)想，本實驗采用氫化可的松肌肉注射制作腎陽虛證實驗動物模型；通過對大鼠進(jìn)行一般情況觀察、右歸丸治療反證、模型組血清 CRH、垂體ACTH水平及其mRNA的表達(dá)分別明顯低于正常對照組和右歸丸治療組，表明模型成功。

本實驗分別以血清CRH、垂體ACTH水平及其mRNA的表達(dá)為觀察對象進(jìn)行方差分析，針刺捻針的角度、捻針頻率、捻針時間是影響針刺效應(yīng)的主要因素，而三者是構(gòu)成針刺刺激量的主要要素。且在本實驗中捻針時間對針刺效應(yīng)影響最大，其次是捻針頻率，再次是捻針角度?？赡苁怯捎隗w重200 g大鼠的表面積是70 kg人的1/56［10］，直徑0.30 mm的針灸針作用于大鼠，則相當(dāng)于一枚直徑為 2.39 mm（0.32×的鋼針作用于人體［9］。黃宇琨等［16］在分析針刺作用力時認(rèn)為按應(yīng)力性質(zhì)，針刺力作用可分為 3種作用，即壓應(yīng)力作用（如插入），張應(yīng)力作用（如抽提）和剪應(yīng)力作用（如搓柄）。捻轉(zhuǎn)屬于旋扭交變應(yīng)力作用，其特點除應(yīng)力方向可相反外，最重要的是剪應(yīng)力作用強烈，并認(rèn)為針刺力以剪應(yīng)力作用最為重要。捻針頻率、捻針角度是影響剪應(yīng)力作用的主要因素，針刺捻針時間則是影響剪應(yīng)力作用量積累的主要因素之一，再加上相當(dāng)于鋼釘?shù)尼樧饔糜诖笫髾C體，刺激量有多大可以想象。故三者在本實驗中是影響針刺效應(yīng)的主要因素。

腧穴的選擇是影響針刺效應(yīng)的重要因素，筆者曾從古代文獻(xiàn)簡述、臟腑經(jīng)穴相關(guān)、神經(jīng)生理學(xué)、實驗研究等方面進(jìn)行過分析［9］。對于腎陽虛證來說，選擇腎俞穴的治療效果要好于前三里，好于非穴區(qū)。腎俞穴為腎的背俞穴，是治腎的重要腧穴?！夺t(yī)宗金鑒》：“腎俞，主治下元諸虛，精冷無子。”現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，腎俞穴區(qū)的組織受第1～3腰神經(jīng)節(jié)段支配，第1～3腰神經(jīng)前支參與腰叢的組成，從腰叢發(fā)出髂腹股溝神經(jīng)和生殖股神經(jīng)支配生殖器；腎俞穴所在的腰部有 4對腰神經(jīng)節(jié)，位于腰椎體前外側(cè)與腰大肌內(nèi)側(cè)緣之間，腰神經(jīng)節(jié)連成腰交感干；腰交感干通過交通支與 5對腰神經(jīng)相連，并隨腰神經(jīng)分布；腰交感干還有一腰內(nèi)臟神經(jīng)，通過這一神經(jīng)與腹盆部的臟器如腎、腎上腺、內(nèi)生殖器官等聯(lián)系；這可能就是經(jīng)穴-臟腑相關(guān)學(xué)說和背俞穴治療相應(yīng)臟腑疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。楊廉等［17］研究發(fā)現(xiàn)溫針灸腎俞穴具有明顯調(diào)節(jié)性激素的作用，可以使老年雌性大鼠明顯低下的雌二醇與孕酮水平升高。而前三里是手陽明大腸經(jīng)的腧穴，與腎沒有直接的關(guān)系；從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)分析，前三里與腎陽虛證的靶腺（腎上腺、甲狀腺、性腺）也沒有直接的聯(lián)系。而非穴區(qū)更無上述相關(guān)聯(lián)系。因此，通過上述的分析與本實驗研究的結(jié)果，腧穴主治作用還是有相對特異性的。

本實驗使用的計算機控制針刺手法儀只能夠?qū)︶槾棠磙D(zhuǎn)的角度、頻率、時間進(jìn)行定量控制，筆者曾對該儀器的改進(jìn)進(jìn)行過設(shè)想［18］，由于硬件和軟件等各方面的原因，本次實驗采用的計算機控制針刺手法儀還是不能模擬針刺補瀉手法，我們知道針刺補瀉手法很可能與針刺取穴、捻針角度、頻率、時間存在交互作用，由于儀器的原因，補瀉手法沒有作為獨立因素進(jìn)行研究，這是本實驗的不足之處，但也是課題組今后努力的方向。

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【中圖分類號】R2-03

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

DOI：10.13460/j.issn.1005-0957.2016.03.0339

文章編號：1005-0957（2016）03-0339-05

收稿日期2015-11-02

基金項目：江西省教育廳科技項目（GJJ10559）；國家自然科學(xué)基金項目（81360562）

作者簡介：閔友江（1975 - ），男，副主任醫(yī)師

通信作者：洪恩四（1965 - ），男，主任醫(yī)師，Email：myj2002@126.com

Orthogonal Study on Different Acupuncture Factors Based on Hypothalamic-pituitary-adrenal Axis in Rats with Kidney Yang Deficiency

MIN You-jiang， DENG Ling， HONG En-si.
Affiliated Hospital of Jiangxi University of Chinese Medicine，Nanchang 330006，China

［Abstract］Objective To observe the effect of acupuncture on the expressions of serum corticotropin-releasing hormone （CRH），pituitary adrenocorticotropic hormone （ACTH） and its mRNA， to discuss the predominant and secondary factors that influence the efficacy of acupuncture， and to explore the optimal combination of acupuncture parameters. Method The rat model of kidney yang deficiency was made by muscular injection with hydrocortisone. Serum CRH， pituitary ACTH and its mRNA expressions were taken as the observation indexes， and 4 influential factors （i.e. selection of acupoints， angle of needle twisting， frequency of needle twisting，and time of needle twisting） plus 3 levels of each factor were arranged to L9（34） orthogonal table. A computer-controlled acupuncture manipulation device was used to treat the kidney yang rats. Serum CRH and pituitary ACTH were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） and pituitary ACTH mRNA expression by real time fluorescent quantitative PCR， to illustrate the primary and secondary factors that affect the acupuncture effectiveness. Results Regarding the effect on acupuncture effectiveness，the time of needle twisting ranked the top， followed by frequency of needle twisting， angle of needle twisting， and selection of acupoints. Angle of needle twisting， frequency of needle twisting， and time of needle twisting should be the predominant factors or secondary factors in influencing acupuncture effectiveness （P＜0.01 or P＞0.05）. Selection of acupoints should be an important factor or secondary factor in influencing acupuncture effectiveness （P＜0.05 or P＞0.05）. Conclusion For rats with kidney yang deficiency， the optimal acupuncture parameters combination should be acupuncture at Shenshu （BL 23）， with twisting angle by 90°，twisting frequency at 180/min， and needle twisting time 120 s. Different factors can produce different effects on the therapeutic efficacy of acupuncture in treating rats with kidney yang deficiency； among the factors， the time of needle twisting produces the most significant effect， followed by frequency of needle twisting， angle of needle twisting， and selection of acupoints.

［Key words］Acupuncture therapy； Orthogonal design； Kidney yang deficiency； Hypothalamic-pituitary-adrenal axis； Rats