基于HPLC-MS檢測(cè)食品中新霉素和潮霉素B的殘留量

□戴 輝 孟 晶 祖立青 樂(lè)麗歡

（上海科茂糧油食品質(zhì)量檢測(cè)有限公司 上海 普陀區(qū) 200333）

基于HPLC-MS檢測(cè)食品中新霉素和潮霉素B的殘留量

□戴 輝 孟 晶 祖立青 樂(lè)麗歡

（上?？泼Z油食品質(zhì)量檢測(cè)有限公司 上海 普陀區(qū) 200333）

目的建立測(cè)定食品中新霉素和潮霉素B氨基糖苷類藥物殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)。方法樣品中的氨基糖苷類藥物經(jīng)磷酸鹽緩沖液提取后，經(jīng)過(guò)弱陽(yáng)離子固相萃取柱富集凈化后，采用液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，使用電噴霧離子化源(ESI)，在正離子條件下以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方式進(jìn)行掃描。結(jié)果線性范圍為10～1 000μg·kg-1，新霉素和潮霉素B的最低定量濃度(LOQ)為100μg/kg，最低檢測(cè)濃度(LOD)為30μg/kg。；以加標(biāo)樣品計(jì)算，在各濃度水平下，各被測(cè)物的方法回收率為60%～120%。結(jié)論本方法準(zhǔn)確、高效，適用于食品中氨基糖苷類藥物殘留量的檢測(cè)。

氨基糖苷；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；殘留檢測(cè)

氨基糖苷類化合物(aminoglycosides)作為廣譜抗生素的一種，其抗菌活性是針對(duì)諸多革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌。氨基糖苷酸抗生素在獸醫(yī)界和畜牧業(yè)中,被廣泛用于治療細(xì)菌性感染。但任何事物都具有兩面性，氨基糖苷類抗生素具有不可逆的耳毒性和腎毒性等不良反應(yīng)，為了保證廣大消費(fèi)者安全健康的飲食,美國(guó)食品及藥物管理局 (Food and Drug Administration)和歐盟委員會(huì)針對(duì)肉類,奶類及奶制品、蛋類等動(dòng)物源性食品進(jìn)行了幾種氨基糖類化合物最大殘留限量（Maximum residuelimit）的設(shè)定。

氨基糖苷類是由兩個(gè)或多個(gè)氨基糖通過(guò)苷鍵與氨基環(huán)醇鍵合而成的一類化合物，其結(jié)構(gòu)由于缺少發(fā)色團(tuán)和熒光團(tuán)，需要在柱前或柱后衍生化反應(yīng)結(jié)束后，采用液相色譜-熒光或紫外檢測(cè)。因?yàn)榘被擒疹惥哂休^強(qiáng)的極性，不易揮發(fā)，在進(jìn)行衍生化反應(yīng)后，也會(huì)需要繼續(xù)使用氣相色譜法測(cè)定。這些衍生化的方法不僅操作比較繁瑣，而且穩(wěn)定性較差。本次試驗(yàn)采用內(nèi)標(biāo)法，對(duì)動(dòng)物源性食品中的新霉素和潮霉素B，這2種氨基糖苷類藥物殘留量進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)過(guò)較為嚴(yán)格的方法學(xué)驗(yàn)證，對(duì)于測(cè)定動(dòng)物源食品中氨基糖苷類藥物的殘留量?jī)?nèi)定法具有準(zhǔn)確且高效的特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 儀器與藥品

LC-MS 8050型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 (日本島津公司)，配有電噴霧離子化源(ESI源)；LC-30A超高效液相色譜儀(日本島津公司)；MS 3 basic旋渦混合器 (德國(guó) IKA)；D-37520臺(tái)式冷凍離心機(jī) (美國(guó)Thermo公司)。Oasis混合型弱陽(yáng)離子(WCX)固相萃取柱(3cm3，60mg，30μm，美國(guó) Waters公司)。

新霉素和潮霉素B對(duì)照品購(gòu)買于美國(guó) Sigma公司；乙腈、甲醇、醋酸、醋酸銨、甲酸均為色譜純；磷酸氫二鈉為分析純；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 試樣制備。肌肉組織及器臟組織、水產(chǎn)品類取適量新鮮或冷藏的樣品，絞碎，并均質(zhì)。置-18℃以下冰箱中冷凍保存。另準(zhǔn)備空白樣品，絞碎后置于-18℃以下冰箱中冷凍保存，作為空白樣品備用。

1.2.2 提取和凈化。前處理1：取5.00g樣品，加入7.5%EDTA緩沖鹽溶液0.5ml（視情況而定，可不加），加入5%三氯乙酸溶液10ml，渦旋1min，超聲20min，4000r/min離心5min，取上清液于一離心管，殘?jiān)屑尤?0ml5%三氯乙酸溶液重復(fù)提取一次，合并上清液。取10ml上清液，用氨水準(zhǔn)確調(diào)ph=7，（用高速離心機(jī)離心后）準(zhǔn)備上WCX小柱。WCX小柱依次用2ml甲醇、2ml水活化。上樣，待樣液自然流完，依次用2ml水，2ml甲醇淋洗，棄去淋洗液，用2ml5%甲酸甲醇洗脫。洗脫液過(guò)有機(jī)濾膜后直接上儀器待測(cè)。

前處理2：取5.00g樣品，加入7.5%EDTA緩沖鹽溶液0.5ml（視情況而定，可不加），加入5%三氯乙酸溶液10ml，渦旋1min，超聲20min，4000r/min離心5min，取上清液于一離心管，殘?jiān)屑尤?0ml5%三氯乙酸溶液重復(fù)提取一次，合并上清液，取10ml提取液(PH≤1)，準(zhǔn)備上HLB小柱。HLB小柱依次用2ml甲醇、2ml水活化。上樣，待樣液自然流完，用5ml水淋洗，2ml甲醇洗脫。洗脫液過(guò)濾膜上儀器待測(cè)。

前處理3：取5.00g樣品，加入7.5%EDTA緩沖鹽溶液0.5ml（視情況而定，可不加），加入5%三氯乙酸溶液10ml，渦旋1min，超聲20min，4000r/min離心5min，取上清液于一離心管，殘?jiān)屑尤?0ml5%三氯乙酸溶液重復(fù)提取一次，合并上清液，取10ml提取液，準(zhǔn)備上MCX小柱。MCX小柱依次用5ml甲醇、5ml水活化。上樣，待樣液自然流完，依次用5ml水，5ml乙腈，5ml乙腈甲酸銨水溶液（乙腈：2M甲酸銨水溶液=3:7）淋洗，再用5ml乙腈甲酸銨水溶液（乙腈：2M甲酸銨水溶液=3:7）（PH=8.0）洗脫，洗脫液過(guò)濾膜上儀器待測(cè)。

前處理1可測(cè)：壯觀霉素、二氫鏈霉素、潮霉素B、鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素

前處理2可測(cè)：安普霉素、妥布霉素、慶大霉素

前處理3可測(cè)：新霉素

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。精密量取10μg/mL10種氨基糖苷類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，用樣品空白基質(zhì)配制成氨基糖苷類藥物 濃度為 20、50、100、200、500ng/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.4 測(cè)定。

（1）色譜條件

a.除新霉素外九種氨基糖苷類

色譜柱：CORTECS Hilic 2.1*100mm 1.6μm；

流動(dòng)相：A：250mM甲酸銨水（200mL中加800uL甲酸）B：200mM甲酸銨有機(jī)相（乙腈+甲醇+水=6+1+3）溶液，（200ml中加甲酸 400uL）；

流速：0.25mL/min；

柱溫：30℃；

進(jìn)樣量：5μl；

表1 9種氨基糖苷類流動(dòng)相梯度

b.新霉素的色譜條件

色譜柱：ZIC HILLIC 2.1*75mm 3μm；

流動(dòng)相：A：250mM甲酸銨水（200mL中加800uL甲酸）B：200mM甲酸銨有機(jī)相（乙腈+甲醇+水=6+1+3）溶液，（200ml中加甲酸 400uL）；

流速：0.25mL/min；

柱溫：30℃；

進(jìn)樣量：5μl；

表2 新霉素流動(dòng)相梯度

（2）質(zhì)譜條件

a）離子源：電噴霧離子源；

b）掃描方式：正離子掃描；

c）檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；

d）毛細(xì)管電壓：Auto Tune(4.0KV)

e）Nebulizing Gas Flow:3L/min；

f）Heating Gas Flow:10L/min；

g）Interface Temperature:300℃；

h）DL Temperature:240℃；

i)Heat Block Temperature:400℃；

j)Drying Gas Flow:10L/min；

k）定量，定性離子對(duì)及碰撞能量見(jiàn)表2

表3 2種氨基糖苷類定量，定性離子對(duì)及碰撞能量

1.2.5 空白試驗(yàn)。除不加試料外，采用完全相同的步驟進(jìn)行平行操作。

1.3 計(jì)算方法

1.3.1 定性判斷。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，樣品中目標(biāo)化合物與氨基糖苷類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間一致，且監(jiān)測(cè)離子對(duì)的相對(duì)豐度滿足表3要求?？烧J(rèn)為目標(biāo)峰是氨基糖苷類物質(zhì)。

表4 目標(biāo)物離子對(duì)相對(duì)豐度比允許偏差范圍

1.3.2 定量方法。將樣品制備液與標(biāo)準(zhǔn)溶液等體積進(jìn)樣，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行定量校準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣液中待分析物的響應(yīng)均應(yīng)在儀器測(cè)定的線性范圍內(nèi)。

計(jì)算公式：

X-樣品中藥物含量（μg/kg）；

C-儀器測(cè)定樣液中藥物含量（ng/mL）；

V-定容體積（mL）；

m-稱取樣品質(zhì)量（g）；

計(jì)算結(jié)果需扣除空白值，測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示。

3 結(jié)果

3.1 檢出限

最低定量濃度 (LOQ)與最低檢測(cè)濃度(LOD)以信噪比 10∶1和 3∶1分別計(jì)算各被測(cè)物的LOQ和 LOD。新霉素和潮霉素B的最低定量濃度(LOQ)為 100μg/kg，最低檢測(cè)濃度(LOD)為30μg/kg。

3.2 準(zhǔn)確度

本方法在添加濃度水平為30～200μg/kg時(shí)新霉素和潮霉素B的回收率范圍為60%～120%。

3.3 精密度

本方法的批內(nèi)變異系數(shù)≤20%。

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1004-7026（2016）18-0097-03

S859.84

A

DOI：10.16675/j.cnki.cn14-1065/f.2016.18.075

戴輝（1985-），男，湖北黃岡人，本科，主要研究方向?yàn)槭称窓z測(cè)分析。