桃仁紅花煎治療心血管疾病的計(jì)算藥理學(xué)研究

榮毅楨　侯亞飛　徐順

摘 要：通過(guò)理論計(jì)算方法研究桃仁紅花煎治療心血管疾病的藥理學(xué)行為。首先將從桃仁紅花煎各味中藥中分離得到的672個(gè)小分子與30個(gè)與心血管疾病有關(guān)的靶標(biāo)（55個(gè)結(jié)合位點(diǎn)）進(jìn)行初步對(duì)接，篩選出活性成分，構(gòu)建小分子——靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)；接下來(lái)將虛擬篩選出來(lái)的活性較高的分子與部分靶標(biāo)作進(jìn)一步的精細(xì)對(duì)接，研究其相互作用機(jī)理，為治療心血管疾病的新藥設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)提供指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：桃仁紅花煎；心血管疾?。环肿訉?duì)接；計(jì)算藥理學(xué)

桃仁紅花煎出自《素庵醫(yī)案》，主要由紅花、當(dāng)歸、桃仁[1]、香附、延胡索、赤芍、川芎、丹參[2]、青皮、生地黃組成。以桃仁、紅花為主藥，配香附、延胡索、青皮行氣以活血，丹參尤屬要物，研究表明其對(duì)心血管疾病有較好的治療作用，與赤芍配伍有抗凝血作用，而與川芎、赤芍、生地黃等配伍則有預(yù)防血栓形成的功效。臨床表明桃仁紅花煎具有降低血壓、有效對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)心血管的效果[3]。然而對(duì)該方劑具體的藥理學(xué)研究很少。中藥體系成分復(fù)雜，具有與多種藥靶作用，調(diào)控多種生物途徑的復(fù)雜作用機(jī)理，因此在分子水平研究中藥作用機(jī)理有很大的難度。近年來(lái)，隨著計(jì)算化學(xué)的發(fā)展，人們已經(jīng)注意到通過(guò)計(jì)算藥理學(xué)研究探討中藥可能的作用機(jī)理[4-7]，對(duì)中藥現(xiàn)代化研究可能是一條有效的途徑。

本文利用桃仁紅花煎已分離得到的672個(gè)化合物分子，再結(jié)合一些重要的與心血管疾病有關(guān)的靶標(biāo)，運(yùn)用理論計(jì)算方法研究桃仁紅花煎的藥理學(xué)性質(zhì)，并篩選出活性成分，為新藥的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)提供指導(dǎo)。

1 桃仁紅花煎中有效成分的虛擬篩選

1.1 桃仁紅花煎中含有小分子化合物的收集

通過(guò)查閱大量文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)搜集到中藥方劑桃仁紅花煎中十味中藥中已分離得到的化合物672種，均已被確定結(jié)構(gòu)。然后用Cerius2軟件對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)最優(yōu)構(gòu)象進(jìn)行加氫及能量?jī)?yōu)化，保存為T(mén)RHHJ.sd文件。

1.2 分子對(duì)接與打分

在DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)及PDB數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出30個(gè)與心血管疾病相關(guān)的靶標(biāo)，其中包括環(huán)氧化酶、白細(xì)胞介素、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶、腫瘤壞死因子等30個(gè)靶酶，共55個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。將672個(gè)化合物分子與靶標(biāo)蛋白的55個(gè)結(jié)合位點(diǎn)在Cerius2的LigandFit模塊下進(jìn)行對(duì)接。對(duì)接之前，首先需對(duì)靶標(biāo)蛋白進(jìn)行預(yù)處理，然后去除原配體，保存。去除原配體也須處理后保存。對(duì)接中使用柔性對(duì)接，另外將Pose Saving Strategy下的參數(shù)Max number of pose saved改為1，其余參數(shù)均為默認(rèn)設(shè)置。保存為合適的名字，點(diǎn)擊Ligand Fit下的Dock Ligands按鈕進(jìn)行對(duì)接。對(duì)接完成后，還需要進(jìn)行原配體與靶標(biāo)蛋白的對(duì)接，與上述步驟相同。構(gòu)建小分子-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖

經(jīng)過(guò)LigandFit對(duì)接，我們可以得到672個(gè)小分子化合物與靶標(biāo)蛋白的55個(gè)位點(diǎn)對(duì)接的DockScore值，取得分前四十的小分子和靶標(biāo)利用Pajek軟件構(gòu)建小分子-靶標(biāo)蛋白相互作用的D-T網(wǎng)絡(luò)圖。最后，使用軟件CentiBin計(jì)算其Degree值。

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)圖可以直觀的看到多個(gè)化合物分子分別靶向多個(gè)不同的靶標(biāo)蛋白，表明中藥的作用機(jī)理是多靶點(diǎn)相互協(xié)同作用，進(jìn)一步揭示了中藥復(fù)雜的作用機(jī)制。

2 活性化合物分子與靶標(biāo)的精細(xì)對(duì)接

活性化合物與靶標(biāo)的精細(xì)對(duì)接在Autodock軟件中完成。采用拉馬克遺傳算法（Lamarckian GA）以及半經(jīng)驗(yàn)自由能的方法分別來(lái)尋找和評(píng)價(jià)配體和受體間相互作用的最佳結(jié)合位置及匹配情況，通過(guò)分子精細(xì)對(duì)接得到的結(jié)合能和最佳構(gòu)象在受體中的位置，為新藥的研發(fā)與設(shè)計(jì)提供更精確的數(shù)據(jù)。

2.1 配體的篩選

由于Autodock對(duì)接不像LigandFit對(duì)接可以批量處理，只能逐個(gè)進(jìn)行對(duì)接，因此在初步選出的11個(gè)化合物小分子中，選出Degree較大的6個(gè)化合物分子做精細(xì)對(duì)接的配體。他們分別是T56、H1、C71、D67、D14、H17。

2.2 受體的選擇

由于檢索到的與心血管疾病相關(guān)的靶標(biāo)較多，若在Autodock軟件中一一做精細(xì)對(duì)接工作量相對(duì)較大，因此根據(jù)化合物分子和靶標(biāo)蛋白質(zhì)的LigandFit對(duì)接篩選出的活性成分，在這30個(gè)靶標(biāo)蛋白中找出與上述11個(gè)活性化合物分子結(jié)合較好的部分靶標(biāo)蛋白作為精細(xì)對(duì)接的受體，如1TVO、1ALU等。

2.3 精細(xì)對(duì)接

首先是受體分子的準(zhǔn)備，將切除原配體的蛋白靶標(biāo)三維結(jié)構(gòu)導(dǎo)入AutoDock中，去掉溶劑并加極性氫和點(diǎn)電荷。其次是配體小分子的準(zhǔn)備，將已經(jīng)優(yōu)化好的6個(gè)小分子也導(dǎo)入Autodock中，轉(zhuǎn)換格式并保存。接下來(lái)選擇Grid選項(xiàng)卡計(jì)算格點(diǎn)親和力，輸入受體和配體分子，并設(shè)定格點(diǎn)參數(shù)，number of points in x-dimension，number of points y-dimension，number of z-dimension均為60，Spacing為0.375，以受體分子作為中心，然后在選項(xiàng)卡下選擇運(yùn)行Run Autogrid；待Autogrid運(yùn)行完畢后便是AutoDock的對(duì)接了，設(shè)定好配體和受體及相應(yīng)的參數(shù)，選擇拉馬克算法進(jìn)行分子對(duì)接，得到一個(gè)DLG文件。

2.4 對(duì)接的結(jié)果

以選出的6個(gè)活性化合物分子與靶標(biāo)蛋白1ALU的精細(xì)對(duì)接結(jié)果為例進(jìn)行討論。主要根據(jù)受體與配體的鍵合自由能、抑制常數(shù)等參數(shù)來(lái)分析受體與配體的結(jié)合情況，對(duì)接自由能=分子間能（vdw + Hbond + desolv energy）+旋轉(zhuǎn)能+總內(nèi)能-其他能量

注：對(duì)接自由能=Free Energy of Binding；靜電能=Electrostatic Energy 分子間能量=Final Intermolecular Energy ；旋轉(zhuǎn)能=Torsional Free Energy 總內(nèi)能=Final Total Internal Energy ； 非鍵系統(tǒng)能=Unbound System&apos；s Energy

當(dāng)結(jié)合自由能（BE）的絕對(duì)值較大而抑制常數(shù)偏小時(shí)，說(shuō)明受體與配體之間結(jié)合較好。H17的結(jié)合自由能最大且抑制常數(shù)較小，所以H17與該受體的對(duì)接為最佳對(duì)接。因此舍棄其他5個(gè)分子，僅對(duì)上述H17分子做進(jìn)一步研究。

如圖2所示，H17的結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)一定程度的旋轉(zhuǎn)和折疊之后，剛好嵌入1ALU的環(huán)形口袋，二者具有很高的契合度，H17與1ALU上的殘基LYS86、GLU93、LEU64、ASN63、LEU62 等具有明顯的相互作用；苯環(huán)骨架上的羥基和殘基上的羰基發(fā)生了分子間氫鍵作用，可見(jiàn)這個(gè)位置上如果有活性氫則有助于配體與受體之間的結(jié)合，同時(shí)酯基上的羰基與殘基上的N-H發(fā)生了氫鍵作用[10]，說(shuō)明在該位置如果有C=O等易生成氫鍵的基團(tuán)時(shí)則有助于配體與受體之間的結(jié)合，通過(guò)鍵能比較發(fā)現(xiàn)，苯環(huán)上的羥基對(duì)二者的相互作用影響最大。

3 結(jié)論

通過(guò)桃仁紅花煎中已知的672個(gè)化合物分子與心血管疾病有關(guān)的30個(gè)靶標(biāo)蛋白的55個(gè)活性位點(diǎn)的對(duì)接，虛擬篩選出11個(gè)生物活性較高的成分，這些化合物可以作為開(kāi)發(fā)治療心血管疾病藥物的先導(dǎo)化合物。利用對(duì)接結(jié)果構(gòu)建了小分子-靶標(biāo)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，證實(shí)了桃仁紅花煎中所含的化合物分子具有多靶點(diǎn)相互協(xié)同作用。接下來(lái)選取活性較高的6個(gè)分子與部分靶標(biāo)蛋白做了進(jìn)一步的精細(xì)對(duì)接，獲得了活性小分子與靶標(biāo)蛋白相互作用的定量數(shù)據(jù)，揭示了桃仁紅花煎在治療心血管疾病方面的作用機(jī)理，對(duì)篩選出的治療心血管疾病的活性小分子的結(jié)構(gòu)改造，新藥設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)提供了詳 細(xì)信息和指導(dǎo)。

參考文獻(xiàn)

[1]王仁芳，范令剛，高文遠(yuǎn)，等.桃仁化學(xué)成分與藥理活性研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代藥物與臨床：2010，25（6）：426-429

[2]張金濤，于敏佳.丹參化學(xué)成分及其臨床應(yīng)用探討[J].黑龍江科技信息：2011，15（18）：44-44

[3]劉俊峰，張建偉.桃仁紅花煎加減治療腦血管性癡呆 40 例[J].陜西中醫(yī)：2007，28（2）：147-148