鄧　飛，李　麗，裴超信，周麗媛，張　睿，邵　靚（四川省動物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041）

阻斷ELISA 法檢測非洲豬瘟抗體

鄧飛，李麗，裴超信，周麗媛，張睿，邵靚
（四川省動物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041）

摘要：非洲豬瘟（ASF）是我國重點(diǎn)防范的外來動物疫病，目前我國尚無疫情發(fā)生，為防患于未然，仍需加強(qiáng)病原監(jiān)測。本試驗(yàn)采用西班牙Ingenasa非洲豬瘟阻斷ELISA抗體檢測試劑盒對來源于四川省內(nèi)的92份豬血清進(jìn)行檢測，結(jié)果表明92份血清樣本均為ASFV抗體陰性。

關(guān)鍵詞：非洲豬瘟；阻斷ELISA；抗體檢測

非洲豬瘟（ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。其臨床癥狀和病理變化與豬瘟相似，表現(xiàn)為發(fā)熱、皮膚發(fā)紺和淋巴結(jié)、腎、胃腸黏膜充血、出血，急性型死亡率高達(dá)100%［1］。國際獸醫(yī)局（OIE）將該病列為必須報告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病，是重點(diǎn)防范的外來動物疫病。近年來，俄羅斯等國家的非洲豬瘟疫情頻發(fā)，并呈繼續(xù)擴(kuò)散蔓延的態(tài)勢。由于與俄羅斯毗鄰，我國面臨著巨大的跨境傳播防控壓力，一旦傳入，將給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來災(zāi)難性危害［2］。因此我們應(yīng)防患于未然，必須防止ASFV傳入。除了加強(qiáng)對引進(jìn)商品豬和豬肉制品的檢驗(yàn)檢疫外，還要積極開展非洲豬瘟的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測工作。本試驗(yàn)通過阻斷ELISA法對ASF抗體進(jìn)行了檢測，現(xiàn)報告如下：

1　材料與方法

1.1血清樣本血清樣本來源于四川省阿壩、廣元、巴中、達(dá)州、廣安的規(guī)模場及散養(yǎng)戶，共計92份。

1.2檢測試劑西班牙Ingenasa（英吉納）非洲豬瘟阻斷ELISA抗體檢測試劑盒，批號：160316。

1.3檢測方法

1.3.1使用前將所有試劑恢復(fù)至室溫。

1.3.2在ELISA反應(yīng)板上每孔加50μL稀釋液。兩孔加50 μL陽性對照血清（E12和F12孔），兩孔加50μL陰性對照血清（G12和H12孔），其余每孔加入50μL血清樣品，每份樣品重復(fù)2孔（如A1、B1為同一份樣品，C1、D1為同一份樣品，以此類推）。共兩個反應(yīng)板，37℃孵育1h。

表1　ELISA反應(yīng)板1檢測46份血清的OD值

表2　ELISA反應(yīng)板2檢測46份血清的OD值

1.3.3將孔中溶液倒入含NaOH溶液的容器中，用洗板機(jī)洗滌4次。

1.3.4每孔加100μL酶結(jié)合物，37℃孵育30min。

1.3.5按洗滌步驟洗板5次。

1.3.6每孔加100μL底物，室溫避光放置15min。

1.3.7每孔加100 μL終止液，5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處讀取OD值。

2　結(jié)果

2.1OD值樣品檢測的OD值見表1、表2。

2.2結(jié)果有效性若陰性對照OD值/陽性對照OD值≥4，則兩個反應(yīng)板的試驗(yàn)檢測結(jié)果均有效。

2.3Cut Off值計算陽性Cut Off值=NC-［（NCPC）×0.5］；陰性Cut Off值=NC-［（NC-PC）×0.4］。

2.4結(jié)果判定樣品OD值＜陽性Cut Off值，則ASFV抗體陽性；樣品OD值＞陰性Cut Off值，則ASFV抗體陰性；樣品OD值介于2個Cut Off值之間，則需重新檢測樣品或用另外的方法檢測。經(jīng)計算，本試驗(yàn)所測樣品的OD值＞陰性Cut Off值，證明ASFV抗體呈陰性（樣品OD值取其平均值）。

3　討論

非洲豬瘟的檢測主要包括抗原檢測和抗體檢測，檢測抗體對于診斷亞急性、慢性、隱性感染具有重要意義。用阻斷ELISA法檢測ASF抗體是一種無感染性的實(shí)驗(yàn)室檢測方法，對于未發(fā)生ASF的國家來說具有現(xiàn)實(shí)意義。由于我國目前尚無ASF發(fā)生的報道，所以我們采用阻斷ELISA法對樣本進(jìn)行檢測，試驗(yàn)所用Ingenasa試劑盒為OIE指定參考的ASF診斷試劑盒。本試驗(yàn)對來源于四川省北部、東北部邊境地區(qū)的部分規(guī)模場及散養(yǎng)戶的豬血清樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果ASFV抗體均為陰性，表明未發(fā)生ASFV感染。

非洲豬瘟是一把令世界各國養(yǎng)豬業(yè)聞之色變的“殺豬刀”，目前無有效疫苗防制，所幸我國境內(nèi)尚無該病發(fā)生。然而中國作為養(yǎng)豬業(yè)大國，又與俄羅斯接壤，所以我們應(yīng)保持最高程度的警戒，平時應(yīng)加強(qiáng)對ASF的監(jiān)測，建立快速、準(zhǔn)確的檢測和診斷系統(tǒng)，以確保清潔無疫，同時提高獸醫(yī)人員對ASF的應(yīng)對能力和實(shí)驗(yàn)室檢測水平。

參考文獻(xiàn)：

［1］殷震，劉景華.動物病毒學(xué)［M］.2版.北京：科學(xué)出版社，1997：1197-1205.

［2］王君瑋.非洲豬瘟傳入風(fēng)險與應(yīng)對策略［J］.現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2011（6）：15-18.

中圖分類號：S854.43

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：1001-8964（2016）06-0022-02

收稿日期：2016-02-29

作者簡介：鄧飛（1982-），女，四川成都人，碩士研究生，獸醫(yī)師。

Detection of African Swine Fever Antibody by Blocking ELISA

DENG Fei，LI Li，PEI Chaoxin，et al.
（Animal Disease Prevention and Control Center of Sichuan Province，Sichuan Chengdu 610041，China）

Abstract：African swine fever is an important exotic animal disease in China，although there is not outbreak of ASF in our country，but the situation of prevention and controlis very severe.In this study，92 serum samples of pigs from Sichuan were detected by ASFV blocking ELISA antibody detection kit of Spain′s Ingenasa.The results showed that theseserum samples were negative for ASFV antibody.

Key words：African swine fever（ASF）；Blocking ELISA；Antibody detection