李璐，趙靜，梁倩，孔存翠，王計平

(山西農業(yè)大學 農學院，山西 太谷 030801)

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紫蘇PfPDAT基因單核苷酸多態(tài)性分析

李璐，趙靜，梁倩，孔存翠，王計平*

(山西農業(yè)大學 農學院，山西 太谷 030801)

摘要：[目的] 磷脂：二酰甘油脂酰轉移酶(PDAT)是植物油脂合成最后一步?；磻年P鍵酶之一，研究紫蘇PfPDAT基因單核苷酸多態(tài)性，旨在分析該基因多態(tài)性與紫蘇種子油脂含量之間的關系。[方法] 以脂肪酸含量不同的7個紫蘇品種為試材，通過直接測序法分析PfPDAT基因cDNA全長序列的單核苷酸多態(tài)性及其與油脂含量的關系。[結果]在所測總長度為14 679 bp的核苷酸序列中，共檢測到9個SNP 和2個InDel，單核苷酸多態(tài)性頻率分別為1/1 631 bp和1/7 340 bp，其中編碼區(qū)含2個SNP，非編碼區(qū)為7個。編碼區(qū)和非編碼區(qū)發(fā)生SNP的頻率分別為1/5 439 bp和1/543 bp。根據PfPDAT 基因序列多態(tài)性將供試紫蘇材料分為不同的單倍型，單倍型H1和H2中都包含有油脂含量較高和含量較低的材料。[結論]PfPDAT基因的單倍型分類與紫蘇油脂含量之間沒有顯著相關性，同時也反映了植物種子油脂合成的復雜性。

關鍵詞：紫蘇； 種子油脂； PfPDAT； 單核苷酸多態(tài)性

紫蘇(Perilla frutescens)作為一種藥食同用的新型油料作物，越來越引起人們的關注[1]。紫蘇籽油富含α-亞麻酸，是人體必需脂肪酸，但是不能直接在人體內合成，只能通過食物供給[2]，因此，開發(fā)基于植物源的α-亞麻酸營養(yǎng)保健產品具有十分重要的意義。目前，有關紫蘇α-亞麻酸生物合成積累及調控機制的研究很少。磷脂：二酰甘油脂酰轉移酶(PDAT)是植物油脂合成最后一步?；磻年P鍵酶之一，PDAT途徑最初是在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)的，Oelkers等[3]發(fā)現(xiàn)PDAT在酵母中參與對數(shù)期TAG的合成。該途徑利用磷脂作為脂?；w，二酰甘油(DAG)作為脂酰基受體，在該酶的催化作用下，將磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)的sn-2位的酞基鏈轉移到DAG上，形成溶血卵磷脂和三酰甘油TAG[4～6]。Dahlqvist等[7]利用蓖麻微粒體制備物可以將2-[14C]蓖麻油酰-DAG作為底物形成TAG，證明在發(fā)育的蓖麻微粒體制備物中具有PDAT活性，對蓖麻油酸具有高特異性。PDAT被認為與特殊FA(fattyacid,FA，主要以脂酰-CoA的方式存在)在TAG中的積累有關。蓖麻是一種特殊FA植物，在種子中可積累80 %～90 % 的羥基化FA-蓖麻油酸。在蓖麻種子發(fā)育過程中可檢測到較高的蓖麻油酸的PDAT酶活性，在轉化蓖麻油酸合成基因RcFAH12的擬南芥中過表達RcPDAT可使得種子積累的蓖麻油酸由17 %提高到25%[8]。單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所導致的DNA序列多態(tài)性，分布在基因編碼區(qū)的SNP又稱為cSNP位于外顯子內，cSNP可引起表達蛋白的多態(tài)性，非同義替換將會導致蛋白質結構及功能的改變[9]。本試驗以種子油脂含量不同的紫蘇品種為試驗材料，利用直接測序法研究紫蘇PfPDAT基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，分析PfPDAT基因多態(tài)性與紫蘇種子油脂含量及α-亞麻酸含量之間的關系，為紫蘇種子油脂品質的遺傳改良提供基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

本研究以晉蘇1號、中北、白蘇、Y-2、Y-4、Y-7、Y-早為試材， 具體情況如表1。

表1　試驗材料

1.2試驗方法

1.2.1紫蘇RNA的提取及cDNA的合成

利用TRNzol總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取7個紫蘇品種開花后10d的種子RNA，反轉錄為cDNA，用于PCR擴增。

1.2.2引物設計

利用PrimerPremier5.0軟件對克隆得到的紫蘇PfPDAT全長cDNA序列設計2對能夠進行全長cDNA擴增的疊套引物，分別命名為：F1/R1和F2/R2(見表2)。

表2　引物序列

1.2.3PCR擴增和測序

PCR擴增體系：模板cDNA2μL，引物1μL，10×TaqBuffer2μL，dNTPMixture(2.5mol·L-1) 1.6μL，DNAPolymerase0.5μL，ddH2O12.9μL，共20μL。反應條件為：94 ℃ 3min→(94 ℃ 30s→60 ℃ 30s→30 ℃ 2min)×循環(huán)30次→72 ℃ 5min→4 ℃保存 。

將能夠擴增出特異性強的單一條帶的PCR產物送至北京金諾銳杰基因科技有限公司進行雙向測序，每份材料至少檢測6個克隆。

1.2.4SNP位點鑒定

利用Chromas1.81 軟件將測序峰圖較好的序列用于cSNP分析。當|低峰值|/|主峰值|≥0.3 時，認為是雜合位點，反之則為模糊位點，無法進行判斷。

1.2.5SNP位點檢測

測序結果利用DNAStarSeqMan軟件進行質量評估和組裝拼接，用DNAStarMegalign軟件對不同材料的序列進行多序列聯(lián)配(ClustalW)，用DnaSP5.0 和PHYLIP軟件包對不同品種的序列進行單核苷酸多態(tài)性及單倍型分析。

2結果與分析

2.1紫蘇PfPDAT基因PCR擴增

如圖1-1A和1-1B，7個品種所擴增出的PCR產物與預期的分子量相一致，引物特異性較強，無非特異性擴增條帶，濃度高，能夠滿足PCR產物測序，隨后標記樣品進行雙向測序。

圖1-1A　F1/R1引物PCR擴增產物電泳分析Fig.1-1A　Electrophoresis of amplified PCR product of F1/R1 primer

圖1-1B　F2/R2引物PCR擴增產物電泳分析Fig.1-1B　Electrophoresis of amplified PCR product of F2/R2 primer　　注： M：DL2000 marker；1～7分別為紫蘇品種晉蘇1號、白蘇、中北、Y-2、Y-4、Y-7、Y-早。Note: M:DL2000 marker; 1～7 respectively perilla varieties Jin Su 1, Bai Su, Zhong Bei, Y-2, Y-4, Y-7, Y-Zao.

2.2SNP位點鑒定

圖2　PfPDAT基因多態(tài)位點測序圖Fig.2　The sequencing map for polymorphism locus of PfPDAT

測序結果進行比對分析發(fā)現(xiàn)，在總長度14 679bp核苷酸序列中共有9個SNP位點和2個InDel，SNP位點檢測如圖2所示，位點清晰且為單一峰，具有較高的可信度。以晉蘇1號作為參照，9個SNP位點中有2個位點位于編碼區(qū)，分別為Y-2的707bp位點處堿基C轉換為A，中北722bp位點處堿基T轉換為C。剩余的7個位點和2個InDel都位于非編碼區(qū)，中北1 627bp位點處堿基C轉換為A；Y-4 1 631bp位點處堿基G轉換為A；白蘇1 710bp位點處堿基T轉換為C；白蘇/中北/Y-7的1 733bp同一位點處發(fā)生突變(中北、Y-7基因多態(tài)位點測序圖同白蘇1 733bp故略圖)，均由C轉換為T；Y-早1 869bp位點處堿基G轉換為A。

2.3紫蘇PfPDAT基因的單核苷酸多態(tài)性分析

2.3.1紫蘇PfPDAT基因序列多態(tài)性分析

對7份材料進行單核苷酸多態(tài)性分析，結果如表3所示：總長度為14 679bp核苷酸序列中共發(fā)現(xiàn)9個SNP位點和2個InDel，多態(tài)性頻率分別為1/1 631bp和1/7 340bp，其中編碼區(qū)有2個SNP位點，非編碼區(qū)有7個，SNP在編碼區(qū)和非編碼區(qū)中出現(xiàn)的頻率分別為1/5 439bp和1/543bp，SNP在非編碼區(qū)的變異頻率約為編碼區(qū)的10倍，且9個SNP都屬于堿基轉換突變。2個InDel出現(xiàn)在非編碼區(qū)，發(fā)生頻率為1/1 901bp，分別在野生型品種Y-2和栽培型品種中北中檢測到。

表3　PfPDAT基因序列核苷酸變異

核苷酸多樣性(π)的大小代表該基因的遺傳變異程度。PfPDAT基因在序列總長中π值為0.00127，其中編碼區(qū)為0.000 37，非編碼區(qū)為0.003 16，非編碼區(qū)π值大于編碼區(qū)，因此非編碼區(qū)的遺傳變異程度較大。

2.3.2紫蘇PfPDAT基因編碼區(qū)多態(tài)性位點分析

對7份供試材料PfPDAT基因編碼區(qū)堿基序列和所翻譯的氨基酸序列進行檢測分析，在Y-2和中北2個品種中各發(fā)現(xiàn)了1個SNP位點，其中中北722bp位點為同義突變，同義變異對編碼蛋白質的氨基酸組成沒有變化，因此對基因的功能和表型沒有影響。

位于Y-2第707bp位點的變異為非同義突變，堿基由C轉換為A，氨基酸由組氨酸變?yōu)楣劝滨０?，由于突變位點不在該基因PLN02733superfamily功能域之內，因此可能不會影響蛋白質的合成和基因的表達。

2.3.3紫蘇PfPDAT基因編碼區(qū)多態(tài)性分析

對7份供試材料PfPDAT基因編碼區(qū)內由核苷酸多樣性引起的同義與非同義突變進行分析，結果表明(見表4)：同義突變大于非同義突變。Ka(非同義突變平均數(shù))與Ks(同義突變平均數(shù))之比表示基因的選擇效應及選擇方向，當Ka/Ks>1時，基因進行正向選擇，快速進化基因；Ka/Ks=1時，為中性變異，群體不發(fā)生改變；Ka/Ks<1時，進行負向選擇影響，為相對保守基因[10]。PfPDAT基因Ka與Ks之比為0.3，該基因屬于負向選擇，核苷酸序列相對保守。

表4　PfPDAT編碼區(qū)單核苷酸多樣性

2.4紫蘇PfPDAT基因單倍型分析

對7份供試材料進行聚類分析和單倍型分析，結果如圖3所示。該基因序列在不同品種間差異較小，4份野生型品種為一分支，剩余3份栽培型品種為另一分支，遺傳關系較近，遺傳系數(shù)達0.99。單倍型分析顯示，7份材料可分為2個單倍型，單倍型H1包含Y-2、Y-4、Y-7、Y-早共4個野生型品種，其中品種Y-2總脂肪酸含量較高，但品種Y-4、Y-7、Y-早總脂肪酸含量較低；單倍型H2包括晉蘇1號、白蘇和中北3個栽培型品種，其中晉蘇1號總脂肪酸含量較高，白蘇和中北總脂肪酸含量較低。本研究供試材料較少，因此不能很好地解釋油脂含量與單倍型分類之間的相關性，同時也表明植物種子油脂合成的復雜性。

圖3　7份紫蘇材料的聚類分析Fig.3　Cluster analysis of 7 Perilla frutescens genotypes　　注：不同品種紫蘇名稱分別為：BS：白蘇；ZB：中北；JS1：晉蘇1號；Y-2：Y-2；Y-7：Y-7；Y-4：Y-4；Y-Z：Y-早Note: Different varieties of Perilla frutescens names: BS:BaiSu; ZB:ZhongBei; JS1:JinSu 1; Y-2:Y-2; Y-7:Y-7; Y-4:Y-4; Y-Z:Y-Zao

3結論與討論

在生物進化過程中，SNP的出現(xiàn)是自然和人工共同選擇的結果[11～14]，當個體中的SNP隨著時間的延長得以保留時，SNP的發(fā)生會在一定程度上加快個體的進化速度[15]。作為繼RFLP、AFLP、SSR之后第四代分子標記的SNP具有很大的發(fā)展?jié)摿Γ瑥V泛應用于生物、農學、醫(yī)學等眾多領域，在分子育種和遺傳學等方面發(fā)揮著巨大的作用，大量研究表明SNP與遺傳表型具有直接聯(lián)系，李密杰等[16]研究表明SNP標記將成為研究人類及動植物遺傳變異和進化的重要方法。本研究通過對7份供試紫蘇材料PfPDAT基因全長cDNA進行單核苷酸多態(tài)性分析，在總長度為14 679bp核苷酸序列中共發(fā)現(xiàn)9個SNP位點和2個InDel，二者多態(tài)性頻率分別為1/1 631bp和1/7 340bp，均低于棉花R2R3-MYB轉錄因子0.94/100bp[17]、葡萄MYBA轉錄因子1/33bp[18]、向日葵基因組編碼區(qū)1/63bp[19]、及水稻基因組編碼區(qū)3/1 000bp[20]的發(fā)生頻率，因此推測cSNP的發(fā)生頻率可能與生物種類、基因功能和表達等有一定的相關性。對該基因進行蛋白質功能預測和氨基酸多態(tài)性分析結果表明：在材料Y-2的第707位點上的SNP變異導致氨基酸發(fā)生變化，但由于這一位點不在氨基酸序列第2～143位的PLN02733superfamily功能域之內，因此可能不會對紫蘇種子油α-亞麻酸含量及蛋白質的合成和表達產生影響。

植物種子積累儲存TAG是一個非常復雜的生理生化過程，研究表明，PDAT基因表達與植物種子油含量和油脂成分都有一定的限制作用[21]。前期研究結果表明本文所用的7個紫蘇品種在種子發(fā)育的過程中脂肪酸的組成成分及含量均具有明顯的差異[22]，但在對PfPDAT基因進行單倍型分析時發(fā)現(xiàn)：7個供試材料可以分為兩個單倍型，單倍型H1和H2中均包含總脂肪酸含量較高和總脂肪酸含量較低的品種，由于本研究所選紫蘇材料較少，因此不能很好地解釋PfPDAT基因單倍型分類與油脂含量之間的相關性，同時也進一步說明了植物中油脂合成的復雜性。

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(編輯：武英耀)

收稿日期：2016-03-22 修回日期：2016-04-23

作者簡介：李璐(1992-)，女(漢)，山西靈石人，在讀碩士，研究方向：紫蘇油脂代謝機理 *通訊作者：王計平，副教授，博士，碩士生導師。Tel: 13633544366；E-mail:sxndwjp@163.com

基金項目：國家自然科學基金(31201266)

中圖分類號：S565.8

文獻標識碼：A

文章編號：1671-8151(2016)08-0551-06

SinglenucleotidepolymorphismsanalysisofPfPDATGeneinPerilla frutescens

LiLu,ZhaoJing,LiangQian,KongCuncui,WangJiping*

(College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China)

Abstract:[Objective] Phospholipid: diacylglycerol acyltransferase (PDAT) is one of the key enzymes that can catalyze the final acylation of triacylglycerol (TAG). The objective of the present study was to detect single nucleotide polymorphisms (SNP) of PfPDAT and determine the relationship between SNP and seed fatty acid content. [Methods] Seven perilla varieties with different fatty acid content were used as the plant materials. The single nucleotide polymorphism of the full-length cDNA sequence of PfPDAT gene was analyzed by sequencing. [Results] Eleven nucleotide mutations were identified, including 9 SNP and 2 InDel in a total of 14679 bp nucleotide acid sequence. The frequencies of SNP and InDel were 1/1 631 and 1 /543, respectively. Among them, 2 SNP loci were in the coding region and 7 SNP in non-coding region. The SNP frequencies were 1/5439 bp and 1/543 bp respectively. The tested seven accessions could be classified as two haplotypes. Haplotype H1 and H2 comprised higher oil content materials and low oil content materials, synchronously. [Conclusion] The results of research showed that there was no significant correlation between haplotype classification of PfPDAT gene and perilla seed oil content, meanwhile it also showed that plant seed oil synthesis was very complicated.

Key words:Perilla frutescens; Seed oil; PfPDAT; Single nucleotide polymorphisms