自愿轉(zhuǎn)輪運動對慢性應(yīng)激大鼠下丘腦乙酰膽堿代謝及室旁核c-fos表達(dá)的影響

崔建梅　郭旭玥　于　芳　藥宏慧　蘇曉云　龐立杰　趙行瑞

(中北大學(xué)體育學(xué)院，山西　太原　030051)

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自愿轉(zhuǎn)輪運動對慢性應(yīng)激大鼠下丘腦乙酰膽堿代謝及室旁核c-fos表達(dá)的影響

崔建梅郭旭玥于芳藥宏慧1蘇曉云2龐立杰3趙行瑞

(中北大學(xué)體育學(xué)院，山西太原030051)

〔摘要〕目的探討4 w自愿轉(zhuǎn)輪運動對慢性不可預(yù)知應(yīng)激致抑郁大鼠下丘腦乙酰膽堿代謝及下丘腦室旁核c-fos表達(dá)的影響。方法隨機(jī)將30只大鼠分為對照組(C，n=10)、應(yīng)激模型組(SM，n=10)及運動應(yīng)激組(SEX，n=10)。SEX及SM組大鼠每日進(jìn)行慢性不可預(yù)知性應(yīng)激1次，連續(xù)28 d，SEX組大鼠同時進(jìn)行4 w自愿轉(zhuǎn)輪運動。慢性應(yīng)激及轉(zhuǎn)輪運動結(jié)束后檢測大鼠下丘腦乙酰膽堿酯酶(AchE)及膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶ChAT的活性，采用免疫組織化學(xué)結(jié)合圖像半定量方法對下丘腦室旁核 c-fos 神經(jīng)元的數(shù)量、面積及灰度進(jìn)行測量和分析。結(jié)果與C組比較，慢性應(yīng)激大鼠下丘腦AchE及ChAT活性均顯著增強(qiáng)(P<0.01，P<0.01)，下丘腦室旁核c-fos表達(dá)顯著增加(P<0.01)；經(jīng)過4 w自愿轉(zhuǎn)輪運動，與SM組大鼠比較，SEX大鼠下丘腦AchE及ChAT活性顯著減弱(P<0.05，P<0.05)，下丘腦室旁核c-fos表達(dá)降低(P<0.05)。結(jié)論長期自愿轉(zhuǎn)輪運動可以糾正慢性應(yīng)激致抑郁模型大鼠下丘腦膽堿能系統(tǒng)功能亢進(jìn)并減弱下丘腦室旁核 c-fos 的表達(dá)。

〔關(guān)鍵詞〕自愿轉(zhuǎn)輪運動；抑郁大鼠；下丘腦；乙酰膽堿系統(tǒng)；c-fos

抑郁癥是一種使人衰弱的、常見的、危及生命的精神障礙性疾病，臨床表現(xiàn)為持續(xù)性情緒低落、思維遲鈍、言語動作減少，嚴(yán)重者伴有自殺行為〔1〕，慢性應(yīng)激已成為誘發(fā)抑郁的重要因素〔2〕。Drevets等〔3〕認(rèn)為中樞膽堿能系統(tǒng)在抑郁癥的發(fā)病過程中起重要作用。乙酰膽堿激動劑及膽堿酯酶抑制劑可引起抑郁患者嚴(yán)重的抑郁情緒、煩躁不安和焦慮行為〔4〕。Dong等〔5〕認(rèn)為，急性應(yīng)激可以增加大腦乙酰膽堿(Ach)的釋放，而慢性應(yīng)激對大腦Ach的影響還不清楚。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，與應(yīng)激刺激密切相關(guān)的腦區(qū)主要有海馬、前額葉皮層、紋狀體、杏仁核下丘腦等核團(tuán)，HPA 軸(下丘腦-垂體-腎上腺軸)是機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)系統(tǒng)，被認(rèn)為是許多抑郁癥癥狀和體征產(chǎn)生的“最后共同通路”，其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)為下丘腦室旁核(PVN)和腎上腺皮質(zhì)。下丘腦PVN與邊緣結(jié)構(gòu)聯(lián)系緊密，在控制應(yīng)激行為反應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用，被認(rèn)為是應(yīng)激反應(yīng)的中樞驅(qū)動力〔6〕。當(dāng)機(jī)體遭受損害性刺激時fos蛋白表達(dá)增多〔7〕，但在慢性應(yīng)激時fos蛋白表達(dá)尚無定論。因此，本實驗通過制備慢性不可預(yù)知的溫和應(yīng)激(CUMS)抑郁模型，探討4 w自愿轉(zhuǎn)輪運動對抑郁模型大鼠下丘腦膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)及乙酰膽堿酯酶(AchE)活性和下丘腦室旁核c-fos表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1動物及分組30只3月齡健康成年雄性SD大鼠，體重200～220 g，控制室溫為(22±1)℃，濕度(55～65)%，自由攝食與飲水，12 h明暗交替(光照8∶00～20∶00)，大鼠適應(yīng)實驗室環(huán)境1 w后正式進(jìn)行實驗。30只大鼠被隨機(jī)分為應(yīng)激模型組(SM，n=10)、運動應(yīng)激組(SEX，n=10)及對照組(C，n=10)。應(yīng)激組大鼠單獨飼養(yǎng)。

1.2大鼠CUMS抑郁模型制備根據(jù)Braun等〔8〕慢性應(yīng)激程序制備大鼠CUMS程序。應(yīng)激程序：食物及水的剝奪(各24 h)、5 min冷水強(qiáng)迫游泳(水溫4℃)、2 h束縛應(yīng)激、20 min足底電擊(0.8 A，間隔5 min、每次持續(xù)4 s)、5 min懸尾(距離尾尖1 cm處)、晝夜顛倒，共7種刺激，除了禁食禁水及晝夜顛倒，其他應(yīng)激均在每天上午9∶00～12∶00之間進(jìn)行，每天一次連續(xù)4 w，應(yīng)激刺激順序隨機(jī)安排。

1.3訓(xùn)練方案①SM大鼠自第2周開始接受4 w CUMS應(yīng)激程序(7種應(yīng)激，每天一種，隨機(jī)安排)；② SEX組大鼠適應(yīng)環(huán)境1 w后從第2周開始將大鼠放入配備了轉(zhuǎn)輪(直徑33 cm、寬度10 cm)的鼠籠里開始轉(zhuǎn)輪運動，大鼠可自由進(jìn)跑輪進(jìn)行轉(zhuǎn)輪運動，紅外線檢測裝置自動采集大鼠每天的轉(zhuǎn)輪距離、分析系統(tǒng)分析轉(zhuǎn)輪情況，大鼠允許適應(yīng)自愿轉(zhuǎn)輪1 w；同時每天接受7種應(yīng)激中的1種，為期4 w；③C組在整個實驗過程中不做任何其他干擾(除了每天例行鼠籠清潔)。

1.4下丘腦AChE及ChAT活性測定慢性應(yīng)激及轉(zhuǎn)輪運動結(jié)束后第二天，將每組大鼠取6只處死，斷頭取全腦，置于冰盒上迅速分離下丘腦并稱重，用4℃生理鹽水將腦組織制成10%勻漿，將勻漿液離心20 min(3 000～4 000 r/min)，取上清液，比色法測定AchE及的ChAT活性(試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供)。

1.5心臟灌注及免疫組織化學(xué)染色慢性應(yīng)激及轉(zhuǎn)輪運動結(jié)束后第二天，每組剩余4只大鼠行戊巴比妥鈉(60 mg/kg，腹腔注射)麻醉，仰臥位固定大鼠四肢，迅速開胸經(jīng)左心室至升主動脈插管，剪破右心耳，先灌入150 ml生理鹽水沖洗血液，隨后先快后慢灌入4%、0.1 mol/L多聚甲醛磷酸緩沖液(pH7.4)300 ml，最后將腦置于0.1 mol/L PBS中脫水24 h直至腦組織沉于溶液底部。取全腦在恒溫冰凍切片機(jī)上做連續(xù)冠狀位切片(片厚40 μm)，下丘腦PVN區(qū)每4張切片取1張。切片經(jīng)0.01 mol/L PBS漂洗后加入兔抗大鼠fos血清第一抗體(1∶400)，經(jīng)PBS漂洗三次，隨后加入pH 7.4的PBS緩沖液孵育2 h(37℃)，再次放入PBS緩沖液漂洗后入含生物素標(biāo)記的第二抗體羊抗兔IgG液(1∶100)，37℃ 室溫孵育1 h，漂洗之后按DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色20 min，常規(guī)乙醇脫水、透明(二甲苯)、封片(中性樹脂)。

1.6下丘腦PVN c-fos分析根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜，取每組2只大鼠下丘腦室旁核5張切片，盡量使每張切片在同一位置，在400倍顯微鏡下將切片輸入電腦拍片，用江蘇捷達(dá)形態(tài)學(xué)分析系統(tǒng)計算下丘腦PVN c-fos免疫陽性細(xì)胞的個數(shù)、面積及灰度。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS18.0軟件行單因素方差分析或Dunnetts法進(jìn)行組間比較。

2結(jié)果

2.1自愿轉(zhuǎn)輪運動對慢性應(yīng)激大鼠下丘腦AChE及ChAT活性的影響與C組比較，SM組大鼠下丘腦AChE及ChAT活性均顯著增強(qiáng)(P<0.01)，增加幅度分別為76%及38%；SEX組大鼠下丘腦AChE活性顯著增強(qiáng)(P<0.05)，下丘腦ChAT活性與C組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。經(jīng)過4 w轉(zhuǎn)輪鍛煉，SEX組大鼠與SM組比較，AChE及ChAT活性均顯著下降(P<0.05)，下降幅度分別為11%及21%。見表1。

表1　各組大鼠下丘腦AChE及ChAT活性結(jié)果

與C組比較：1)P<0.01，2)P<0.05；與SM組比較：3)P<0.01，4)P<0.05；下表同

2.2自愿轉(zhuǎn)輪運動對慢性應(yīng)激大鼠下丘腦PVN c-fos表達(dá)的影響光鏡下可見下丘腦PVN 內(nèi)分布大量c-fos(呈三角形)，細(xì)胞核著色，100倍鏡下c-fos為黃褐色小圓點，400倍鏡下為棕黃色圓形或橢圓形神經(jīng)元。見圖1。測量結(jié)果顯示：長期不可預(yù)知的慢性應(yīng)激可以顯著上調(diào)下丘腦PVN內(nèi)c-fos表達(dá)，SM組大鼠的c-fos免疫陽性細(xì)胞數(shù)量、面積及灰度值均顯著多于C組(P<0.01，P<0.05)；4 w轉(zhuǎn)輪運動顯著下調(diào)了慢性應(yīng)激大鼠下丘腦PVN內(nèi)c-fos的表達(dá)，與SM組比較，SEX 組大鼠c-fos免疫陽性細(xì)胞面積和數(shù)量均顯著減少(P<0.05)，灰度值無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2　各組大鼠下丘腦PVN c-fos 免疫陽性細(xì)胞表達(dá)結(jié)果

圖1　下丘腦PVN c-fos陽性神經(jīng)元表達(dá)(×400)

3討論

研究發(fā)現(xiàn)，緊張應(yīng)激性生活事件尤其是慢性長期的生活壓力與抑郁行為是一種劑量-反應(yīng)關(guān)系，即生活中應(yīng)激事件越多，抑郁癥的發(fā)病率就越高，抑郁癥狀也越嚴(yán)重。中樞Ach能系統(tǒng)與焦慮及抑郁樣行為有關(guān)，已成為誘發(fā)抑郁癥的危險因素之一〔9〕。應(yīng)激尤其是慢性不可預(yù)測和無法控制的應(yīng)激可能會增加大腦神經(jīng)病理學(xué)的脆弱性，從而改變膽堿能系統(tǒng)的功能。AchE及ChAT活性常作為膽堿能神經(jīng)元功能活動的標(biāo)志或間接反映Ach含量的指標(biāo)，AchE的活性與Ach的釋放有關(guān)，Ach釋放越多，AchE的活性越高〔10〕。本研究結(jié)果提示抑郁模型大鼠下丘腦膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)Ach代謝亢進(jìn)。Das等〔11〕認(rèn)為急性固定姿勢臥姿應(yīng)激150 min大鼠大腦AchE活性下降，而同種刺激每天150 min連續(xù)5 d，大腦AChE活性與對照組比較無顯著變化，這或許由于同種刺激長期應(yīng)激導(dǎo)致了大腦對同種刺激的適應(yīng)。過度活躍的膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)可導(dǎo)致抑郁癥狀的發(fā)生〔12〕，Addy等〔13〕發(fā)現(xiàn)腹側(cè)被蓋區(qū)注射Ach受體拮抗劑東茛菪堿可產(chǎn)生抗抑郁行為，強(qiáng)迫游泳實驗中抑郁模型大鼠的不動時間顯著縮短，并呈劑量依賴性。Kaneko等〔14〕研究認(rèn)為AchE抑制劑多奈哌齊可提高抑郁癥的認(rèn)知功能，甚至已經(jīng)被證明能夠逆轉(zhuǎn)慢性應(yīng)激引起的海馬神經(jīng)元的凋亡。有關(guān)抑郁癥發(fā)病機(jī)制的另一個假說是膽堿能-腎上腺素能功能平衡失調(diào)學(xué)說，膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的亢進(jìn)可以激活HPA軸，糖皮質(zhì)激素皮質(zhì)醇分泌增多，糖皮質(zhì)激素(GCs)在調(diào)節(jié)大腦神經(jīng)元的功能方面起重要作用，而研究認(rèn)為高水平的GCs可以引起大腦膽堿能神經(jīng)元的凋亡及急劇退化〔15〕。本實驗發(fā)現(xiàn)運動應(yīng)激組大鼠下丘腦ChAT與AchE活性明顯下降，表明Ach釋放減少。本課題組以前研究發(fā)現(xiàn)4 w自愿運動可以改善慢性應(yīng)激模型大鼠的抑郁樣行為〔16〕，因此可以推測，轉(zhuǎn)輪運動減弱cums大鼠抑郁樣行為(興趣喪失、探索能力下降等)可能與此運動在一定程度上糾正應(yīng)激導(dǎo)致下丘腦膽堿能系統(tǒng)功能亢進(jìn)抑制HPA軸功能活動有關(guān)，具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

HPA軸激活及由此引起GCs分泌增加是應(yīng)激反應(yīng)的最重要特征，而下丘腦PVN是HPA軸活動的直接控制部位。Pacak等〔17〕認(rèn)為損害大鼠PVN 可顯著減少垂體門脈血流中的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRF)水平，還可導(dǎo)致血液循環(huán)中的促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和GCs水平顯著下降，同時應(yīng)激反應(yīng)基本消失。

原癌基因c-fos作為信號傳遞通路的第三信使調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，與細(xì)胞的生長、信號傳遞、學(xué)習(xí)記憶過程有關(guān)，可被生理、心理和病理等內(nèi)源性或外源性刺激所誘導(dǎo)，可作為神經(jīng)細(xì)胞損害、情感和行為改變的標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，長期慢性不可預(yù)知應(yīng)激顯著上調(diào)下丘腦PVN原癌基因c-fos的表達(dá)，說明此部位很可能與長期CUMS引起的焦慮樣行為有關(guān)。研究認(rèn)為，應(yīng)激引起的c-fos激活與皮質(zhì)醇過度分泌有關(guān)〔18〕，因此可以推測長期慢性應(yīng)激引起的下丘腦PVN區(qū)c-fos 顯著增多與應(yīng)激引起的下丘腦GCs的高分泌有關(guān)，而高濃度的GCs可能會導(dǎo)致下丘腦膽堿能神經(jīng)元的急劇退化引起應(yīng)激大鼠焦慮樣行為。本實驗觀察到的結(jié)果與其他一些研究結(jié)果存在差異，以前學(xué)者研究認(rèn)為慢性重復(fù)應(yīng)激后c-fos表達(dá)逐漸減弱〔19〕，而本實驗結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)長期不可預(yù)知的多種應(yīng)激刺激引起下丘腦PVN c-fos顯著增多，可能因為大鼠每次刺激的方式不同，因而在一定程度上避免了大鼠對多種刺激的習(xí)慣化，這可能是c-fos表達(dá)增強(qiáng)的另一個重要原因。本實驗還觀察到4 w自愿轉(zhuǎn)輪運動減少了慢性應(yīng)激大鼠下丘腦PVN c-fos蛋白的表達(dá)，表明自愿轉(zhuǎn)輪運動下調(diào)下丘腦PVN fos 蛋白的表達(dá)可能是此運動抗抑郁的中樞作用機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn)，c-fos可作為第三信使調(diào)節(jié)CRF的表達(dá)，進(jìn)而控制ACTH的分泌，啟動HPA軸影響與應(yīng)激有關(guān)的焦慮狀態(tài)及學(xué)習(xí)記憶能力下降〔20〕，而自愿轉(zhuǎn)輪運動可能通過下調(diào)下丘腦PVN 的c-fos 表達(dá)拮抗HPA軸功能亢進(jìn)，糾正下丘腦膽堿能系統(tǒng)功能紊亂，從而改善應(yīng)激模型大鼠的焦慮樣行為，但具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

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〔2016-01-17修回〕

(編輯郭菁)

基金項目：國家自然科學(xué)基金(30671019)；山西省自然科學(xué)基金(2014011041-6)

通訊作者：于芳(1968-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事運動與中醫(yī)康復(fù)研究。

〔中圖分類號〕G804.7

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3095-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.003

Effects of voluntary wheeling on acetylcholine metabolism within hypothalamus and C-fos expression within hypothalamus PVN in the chronic stress rats

CUI Jian-Mei,GUO Xu-Yue,YU Fang,et al.

College of Physical Education,North University of China,Taiyuan 030051,Shanxi,China

【Abstract】ObjectiveTo explore the influence of the 4-week voluntary wheeling exercise on the acetylcholine metabolism within hypothalamus and c-fos expression within paraventricular nucleus (PVN) of the hypothalamus in the depressive rats induced by chronic unpredictable stress (CUMS).Methods30 Sprague Dawley male rats were randomly divided into the control (C,n=10),the stress model (SM,n=10) and stress exercise groups (SEX,n=10).The rats of SEX and SM groups received CUMS every day and lasted 28 days.At the same time,rats in SEX group received 4-week voluntary wheeling exercise.Then AchE and ChAT activities within hypothalamus were detected and c-fos expression within PVN of the hypothalamus was detected and analyzed by ABC immunohistochemical technique and semi quantitative.ResultsCompared with C group,AchE and ChAT activities were increased in hypothalamus and c-fos expression was enhanced in hypothalamus PVN in the SM group(P<0.01).Compared with SM group,AchE and ChAT activities were reduced (P<0.05) in hypothalamus and c-fos expression was decreased (P<0.01) in hypothalamus PVN in the SEX group.ConclusionsVoluntary wheeling exercise could rectify the acetylcholine hyperfunction within hypothalamus and weaken c-fos expression within hypothalamus PVN in depressive model rats.

【Key words】Voluntary wheeling exercise;Depressive rats;Hypothalamus;Cholinergic system;c-fos

1太原學(xué)院體育系2山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院

3山西體育職業(yè)學(xué)院

第一作者：崔建梅(1972-)，女，講師，碩士，主要從事運動與中醫(yī)康復(fù)學(xué)研究。