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      Sirt1調(diào)控軟骨細(xì)胞自噬在骨關(guān)節(jié)炎中作用及機(jī)制

      2016-08-05 01:05:44李春亮李釗偉
      重慶醫(yī)學(xué) 2016年15期
      關(guān)鍵詞:自噬骨關(guān)節(jié)炎

      李春亮,李釗偉,秦 鳳

      (青海大學(xué)附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科,西寧 810000)

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      Sirt1調(diào)控軟骨細(xì)胞自噬在骨關(guān)節(jié)炎中作用及機(jī)制

      李春亮,李釗偉△,秦鳳

      (青海大學(xué)附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科,西寧 810000)

      [摘要]目的探討沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirt1)調(diào)控軟骨細(xì)胞自噬在骨關(guān)節(jié)炎(OA)中作用及機(jī)制的研究。方法免疫組織化學(xué)及逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法檢測(cè)人OA軟骨和正常軟骨中Sirt1的表達(dá),Ⅱ型膠原酶消化軟骨獲得軟骨細(xì)胞,單丹磺酰尸胺(MDC)法檢測(cè)OA軟骨細(xì)胞及正常軟骨細(xì)胞自噬水平,并分析二者相關(guān)性;Sirt1激動(dòng)劑白藜蘆醇干預(yù)OA軟骨細(xì)胞,并通過(guò)MDC法檢測(cè)OA軟骨細(xì)胞自噬水平,Western blot及RT-PCR法檢測(cè)酵母自噬基因Atg/Vps30同源基因(Beclin-1)及微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)蛋白及mRNA表達(dá)水平,煙酸己可堿(Hoechst)染色檢測(cè)OA軟骨細(xì)胞凋亡情況,Western blot檢測(cè)B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)及哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路激活情況,分光光度法檢測(cè)各組天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase-3)活性。結(jié)果OA軟骨中Sirt1蛋白及mRNA表達(dá)量都顯著低于正常軟骨中表達(dá)量(P<0.01),OA軟骨細(xì)胞自噬水平低于正常軟骨細(xì)胞(P<0.01),OA中軟骨Sirt1表達(dá)量與自噬水平正相關(guān);Sirt1激動(dòng)劑白藜蘆醇能顯著提高OA軟骨細(xì)胞自噬水平(P<0.01),提高自噬基因Beclin-1及LC3蛋白及mRNA表達(dá)量(P<0.01),并抑制mTOR磷酸化(P<0.01),從而抑制OA軟骨細(xì)胞凋亡(P<0.01),下調(diào)Bax表達(dá)(P<0.01),上調(diào)Bcl-2表達(dá)(P<0.01),降低Caspase-3活性(P<0.01)。結(jié)論Sirt1在OA中低表達(dá),并與軟骨細(xì)胞自噬水平正相關(guān),提高Sirt1表達(dá)水平后能顯著能夠顯著抑制OA自噬,并抑制OA軟骨細(xì)胞凋亡,這可能是通過(guò)mTOR信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

      [關(guān)鍵詞]骨關(guān)節(jié)炎;軟骨細(xì)胞;自噬;沉默信息調(diào)節(jié)因子1

      骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種多發(fā)于老年人的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病,以關(guān)節(jié)軟骨破壞和關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)增生為主要病理特征,主要與年齡、性別、遺傳因素等有關(guān)[1-3]。目前OA發(fā)病機(jī)制主要圍繞在關(guān)節(jié)軟骨如何維持細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)代謝的動(dòng)態(tài)平衡上,而近年來(lái)也發(fā)現(xiàn)自噬在OA發(fā)病過(guò)程中起著重要作用[4-5]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulation of transcription 1,Sirt1)是sirtuins家族研究最為廣泛的一員,在神經(jīng)退變性疾病、糖尿病、腫瘤、炎癥、衰老等疾病中通過(guò)自噬參與其病理過(guò)程[6]。此外Sirt1在人OA軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成、細(xì)胞存活,以及抗炎作用中起著重要作用[7-8],并能通過(guò)對(duì)自噬相關(guān)蛋白去乙?;瘡亩{(diào)節(jié)細(xì)胞自噬水平[6,9]。因此推測(cè),Sirt1可能通過(guò)調(diào)節(jié)OA軟骨細(xì)胞自噬水平從而參與軟骨細(xì)胞凋亡。所以本研究擬探討Sirt1是否通過(guò)調(diào)控OA軟骨細(xì)胞自噬,從而為Sirt1成為OA治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

      1資料與方法

      1.1一般資料軟骨組織取自2014年8月至2015年8月本院骨科進(jìn)行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的30名OA患者(根據(jù)美國(guó)風(fēng)濕性學(xué)會(huì)2008年制訂的OA診斷標(biāo)準(zhǔn),通過(guò)病史、臨床檢查和X線片確診)。其中,男12例,女18例,年齡57~86歲,平均70歲。正常關(guān)節(jié)軟骨10例,取自因創(chuàng)傷根據(jù)截肢的膝關(guān)節(jié)股骨頭軟骨,根據(jù)病史,術(shù)前X線片及術(shù)后肉眼觀察排除標(biāo)本退行性變,腫瘤、感染、類風(fēng)濕炎癥和明顯骨質(zhì)疏松等結(jié)構(gòu)性破壞。正常關(guān)節(jié)軟骨中,男7例,女3例,年齡19~42歲,平均31歲?;颊邔?duì)取材知情并同意,本試驗(yàn)亦經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

      1.2方法

      1.2.1主要試劑與儀器兔抗Sirt1人多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;兔抗B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及p-mTOR單克隆抗體購(gòu)自Epitmics公司;鼠抗甘油醛3-磷酸脫氫酶(GADPH)抗體,含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶3(Caspase-3)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;兔抗酵母自噬基因Atg/Vps30同源基因(Beclin-1)及微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)多克隆抗體購(gòu)自Abcam公司;白藜蘆醇購(gòu)自Sigma公司;Ⅱ型膠原酶,胎牛血清,達(dá)爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養(yǎng)基(DMEM/F-12)購(gòu)自Gibco公司。ChemiDocTMXRS凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司;Tecan Infinite F200/M200型多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士TECAN集團(tuán)公司,AF6000熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司。

      1.2.2免疫組織化學(xué)檢測(cè)標(biāo)本經(jīng)二甲苯脫蠟,100%、95%、80%乙醇脫水,流水沖洗,抗原修復(fù),馬血清進(jìn)行抗原封閉,一抗封閉,二抗封閉,蘇木素浸泡,鹽酸乙醇浸泡,流水沖洗至反藍(lán),梯度乙醇脫水,二甲苯透明,吹干后中性樹(shù)膠封片,后鏡檢。Sirt1陽(yáng)性染色為淡黃色、棕黃色,定位于細(xì)胞核。

      1.2.3逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測(cè)總RNA的提取參考Trizol試劑盒 (Invitrogen) 使用說(shuō)明書(shū),整個(gè)提取處于無(wú)RNAase的環(huán)境下。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1,通過(guò)一步法RT-PCR試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用于下一步2%的瓊脂糖膠進(jìn)行檢測(cè)并拍照。引物分別加入25 μL PCR反應(yīng)體系中,反應(yīng)條件為94 ℃變性45 s,59 ℃復(fù)性45 s,72 ℃延伸60 s,共35個(gè)循環(huán)。

      1.2.4軟骨細(xì)胞的制備及分組[1-2]無(wú)菌環(huán)境下,充分漂洗軟骨組織標(biāo)本,用眼科剪剪碎至1 mm3大小。并依次用0.25%的胰蛋白酶及0.20%的膠原酶分別消化30 min 及2 h。獲得單細(xì)胞懸液后,用10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),約4~5 d細(xì)胞開(kāi)始融合,實(shí)驗(yàn)使用第2~3代細(xì)胞。細(xì)胞分為OA組及Sirt1激動(dòng)劑白藜蘆醇組(白藜蘆醇組)。

      1.2.5單丹磺酰尸胺(MDC)染色細(xì)胞自噬囊泡體能與MDC特異性結(jié)合,在熒光顯微鏡下呈藍(lán)色。于6孔板中制備OA軟骨細(xì)胞爬片,于37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,再加入10 μmol/L白藜蘆醇或不加任何刺激物進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)24 h后,加入0.05 mmol/L MDC于37 ℃孵育15 min,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,4%多聚甲醛固定15 min,PBS洗滌3次,并置于含有防熒光猝滅劑的載破片上,避光作用5~10 min后,熒光顯微鏡下觀察拍照。

      表1 RT-PCR引物

      1.2.6煙酸已可堿(Hoechst)染色將OA軟骨細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板,于37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,加入10 μmol/L白藜蘆醇或不加任何刺激物進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)24 h,后按照Hoechst染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,染色,固定,顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。

      1.2.7Western blot檢測(cè)將OA軟骨細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板,于37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,加入10 μmol/L白藜蘆醇或不加任何刺激物進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞,加入裂解液裂解,冰浴30 min,每隔10 min震蕩5 s,以1×104r/min 4 ℃離心15 min,獲得蛋白樣品。根據(jù)二喹啉甲酸(BCA)試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。蛋白上樣,十二烷基磺酸鈉(SDS)凝膠電泳,后濕法轉(zhuǎn)膜。將膜浸入一抗溶液孵育,4 ℃過(guò)夜;漂洗后,浸入二抗溶液(1∶100)中室溫孵育1~2 h。將膜取出漂洗,在膜上滴加ECL曝光液,在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“Quantity one”軟件對(duì)各抗體條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

      1.2.8Caspase-3活性檢測(cè)將OA軟骨細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板,于37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,加入10 μmol/L白藜蘆醇或不加任何刺激物進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)24 h,按Caspase-3分光光度法檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

      2結(jié)果

      2.1Sirt1蛋白及mRNA在人OA軟骨及正常軟骨組織中的表達(dá)與正常軟骨組織比較,OA軟骨組織中Sirt1蛋白陽(yáng)性表達(dá)顯著降低(5.42±0.43vs.2.87±0.25),OA軟骨組織中Sirt1 mRNA表達(dá)亦顯著降低(0.98±0.09vs.0.38±0.06),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)圖1、2。

      A:正常軟骨組織;B:OA軟骨組織。

      圖1Sirt1蛋白在人OA軟骨及正常軟骨組織中的表達(dá)

      *:P<0.01,與正常軟骨細(xì)胞比較。

      圖2Sirt1mRNA在人OA軟骨及正常軟骨組織中的表達(dá)

      2.2OA軟骨細(xì)胞及正常軟骨細(xì)胞中自噬水平與正常軟骨細(xì)胞比較,OA軟骨細(xì)胞自噬水平降低[(30.45±5.17)%vs.(6.35±0.45)%,P<0.01],見(jiàn)圖3。

      A:正常軟骨細(xì)胞;B:OA軟骨細(xì)胞。

      圖3OA軟骨細(xì)胞及正常軟骨細(xì)胞中自噬水平

      2.3OA軟骨細(xì)胞中Sirt1表達(dá)自噬水平的相關(guān)性Person分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),OA軟骨細(xì)胞中Sirt1表達(dá)量與自噬水平正相關(guān)(r=0.783,P<0.01)。

      A:OA組;B:白藜蘆醇組。

      圖4Sirt1表達(dá)上調(diào)后對(duì)OA軟骨細(xì)胞凋亡的影響

      *:P<0.01,與OA組比較。

      圖5Sirt1表達(dá)上調(diào)后對(duì)OA軟骨細(xì)胞中自噬蛋白表達(dá)量的影響

      2.4Sirt1表達(dá)上調(diào)后對(duì)OA軟骨細(xì)胞中自噬水平的影響與OA軟骨細(xì)胞組織比較,白藜蘆醇刺激Sirt1表達(dá)上調(diào)后,OA軟骨細(xì)胞自噬水平升高[(6.49±0.53)%vs.(26.89±3.12)%,P<0.01]。并使凋亡自噬基因Beclin-1及LC3蛋白及mRNA表達(dá)量上調(diào)(P<0.01),見(jiàn)圖4、5。

      A:OA組;B:白藜蘆醇組。

      圖6Sirt1表達(dá)上調(diào)后對(duì)OA軟骨細(xì)胞凋亡的影響

      *:P<0.01,與OA組比較。

      圖7Sirt1表達(dá)上調(diào)后對(duì)OA軟骨細(xì)胞中Bax及Bcl-2表達(dá)量的影響

      *:P<0.01,與OA組比較。

      圖8Sirt1表達(dá)上調(diào)后對(duì)OA軟骨細(xì)胞中>Caspase-3活性的影響

      *:P<0.01,與OA組比較。

      圖9Sirt1表達(dá)上調(diào)后對(duì)OA軟骨細(xì)胞mTOR信號(hào)通路的影響

      2.5Sirt1表達(dá)上調(diào)后對(duì)OA軟骨細(xì)胞凋亡的影響與OA軟骨細(xì)胞組比較,白藜蘆醇刺激Sirt1表達(dá)上調(diào)后,OA軟骨細(xì)胞凋亡率顯著下降[(28.71±3.24)%vs.(6.76±0.39)%,P<0.01)],并上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)(P<0.01),下調(diào)Bax蛋白表達(dá)(P<0.01),抑制Caspase-3活性(P<0.01),見(jiàn)圖6~8。

      2.6Sirt1表達(dá)上調(diào)后對(duì)OA軟骨細(xì)胞mTOR信號(hào)通路的影響與OA軟骨細(xì)胞組比較,白藜蘆醇刺激Sirt1表達(dá)上調(diào)后,OA軟骨細(xì)胞中mTOR磷酸化水平顯著降低(P<0.01),見(jiàn)圖9。

      3討論

      細(xì)胞自噬是生物體在生理或病理?xiàng)l件下的應(yīng)激反應(yīng),可通過(guò)溶酶體清除受損或老化的細(xì)胞器,從而維持細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)定和代謝平衡。研究發(fā)現(xiàn),自噬功能的缺失或增強(qiáng),在神經(jīng)性疾病、骨骼肌病變、腫瘤、炎癥及衰老等病理過(guò)程中起著重要作用[6]。自噬也可稱之為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡,參與OA軟骨退變,Caramés等[10]研究發(fā)現(xiàn)小鼠OA模型中自噬相關(guān)蛋白ULK1,Beclin1,LC3的表達(dá)量減少。Almonte-Becerril等[11]通過(guò)免疫組織化學(xué)和Western blot證實(shí)動(dòng)物OA模型中同時(shí)存在細(xì)胞凋亡及細(xì)胞自噬。后續(xù)的研究也證實(shí)通過(guò)提高OA自噬水平能顯著的抑制OA軟骨退變[12]。本研究結(jié)果與上述報(bào)道一致,OA軟骨細(xì)胞中自噬水平顯著低于正常軟骨細(xì)胞。所以研究軟骨細(xì)胞自噬作用機(jī)制有助于一步了解OA發(fā)病機(jī)制,同時(shí)也為OA治療提供新的思路。

      研究已證實(shí)Sirt1與OA的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。如Fujita等[13]證實(shí)OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞比正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中表達(dá)量降低。與本研究結(jié)果相一致,在人OA軟骨組織Sirt1表達(dá)量顯著低于正常軟骨組織。同時(shí)Matsuzaki等[14]證實(shí)Sirt1-CKO小鼠比野生型8周C57BL6/J小鼠更容易發(fā)展為OA,并伴隨著膠原X,人基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)水平的上升,提示軟骨細(xì)胞中Sirt1的缺失加速小鼠OA模型的形成。Gabay 等[15]進(jìn)一步證實(shí)Sirt1 KO小鼠軟骨表達(dá)發(fā)生變化,凋亡程度提高,軟骨退變加速。Gagarina等[16]證實(shí)Sirt1能促進(jìn)OA軟骨特異性基因表達(dá)。說(shuō)明Sirt1在OA中起著保護(hù)性作用。本研究進(jìn)一步通過(guò)Person分析發(fā)現(xiàn),OA軟骨中Sirt1低表達(dá)水平與低自噬水平正相關(guān),同時(shí)Marino等[9]提出Sirt1能通過(guò)調(diào)節(jié)自噬蛋白乙?;交虻鞍姿絹?lái)調(diào)控細(xì)胞的自噬水平。Powell等[17]進(jìn)一步研究Sirt1促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞自噬體成熟。從而說(shuō)明OA中Sirt1不僅與軟骨自噬水平相關(guān),還可參與調(diào)控軟骨細(xì)胞自噬。所以,在此基礎(chǔ)上本研究進(jìn)一步探討Sirt1對(duì)于OA自噬水平的調(diào)控作用。

      Li等[18]證實(shí)白藜蘆醇通過(guò)提高OA小鼠中Sirt1活性,降低缺氧誘導(dǎo)因子2α(HIF-2α),MMP13及一氧化氮合成酶(iNOS)表達(dá),從而抑制OA小鼠軟骨退變。siRNA干擾人軟骨細(xì)胞中Sirt1的表達(dá),促使TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目,聚ADP核糖聚合酶(PARP)及Caspases-3,9片段數(shù)量,Bax表達(dá)量都顯著提高,Bcl-2表達(dá)量下降,而白藜蘆醇激活Sirt1表達(dá),能扭轉(zhuǎn)此變化[19]。從而說(shuō)明Sirt1有可能通過(guò)上調(diào)OA軟骨細(xì)胞自噬水平,達(dá)到抑制軟骨細(xì)胞凋亡的作用。因此本研究采用Sirt1激動(dòng)劑白藜蘆醇干預(yù)OA軟骨細(xì)胞,結(jié)果表明白藜蘆醇能使OA軟骨細(xì)胞自噬水平顯著提高,同時(shí)自噬蛋白Beclin1及LC3表達(dá)量顯著上調(diào)。進(jìn)一步檢測(cè)OA凋亡情況,結(jié)果表明OA軟骨細(xì)胞凋亡率下降。Bax表達(dá)量顯著降低,Bcl-2表達(dá)量顯著上升,Caspase-3活性下降,說(shuō)明Sirt1能通過(guò)調(diào)節(jié)OA軟骨細(xì)胞自噬水平影響OA軟骨細(xì)胞凋亡。

      細(xì)胞的自噬作用受多種信號(hào)通路的影響,如絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路,mTOR信號(hào)通路,Bcl-2信號(hào)通路等。其中mTOR信號(hào)研究最為廣泛,已經(jīng)證實(shí)mTOR信號(hào)通路能調(diào)控腎臟上皮細(xì)胞,心肌細(xì)胞,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,腫瘤細(xì)胞,淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞中自噬功能的產(chǎn)生[20]。Bohensky等[21]證實(shí)通過(guò)HIF/AMPK/mTOR信號(hào)途徑調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬。Caramés等[22]研究證實(shí)mTOR抑制劑雷帕霉素可以通過(guò)誘導(dǎo)自噬起到保護(hù)OA軟骨的作用。Zhang等[23]也發(fā)現(xiàn)通過(guò)阻斷mTOR信號(hào)通路可以防止大鼠OA的發(fā)生。因此本研究探討了白藜蘆醇刺激OA軟骨Sirt1表達(dá)上調(diào)后,mTOR信號(hào)通路的激活情況,結(jié)果表明白藜蘆醇干預(yù)后,OA軟骨細(xì)胞中mTOR磷酸化水平顯著提高。同時(shí)mTOR信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞增殖也具有調(diào)控作用[24]。并且Zhao等[25]證實(shí)外源性刺激單倍體干細(xì)胞能促進(jìn)Sirt1表達(dá),且是通過(guò)mTOR通路產(chǎn)生的,而單倍體干細(xì)胞中Sirt1敲除后,會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡并伴隨p53及Caspase-3的激活。從而推測(cè)Sirt1不僅通過(guò)阻斷mTOR信號(hào)通路來(lái)干擾OA軟骨細(xì)胞的自噬水平,也通過(guò)此信號(hào)通路來(lái)干預(yù)OA軟骨細(xì)胞凋亡情況。

      綜上所述,Sirt1在OA軟骨組織中低表達(dá),并與軟骨細(xì)胞自噬水平正相關(guān),通過(guò)上調(diào)Sirt1表達(dá)水平,可顯著上調(diào)OA軟骨細(xì)胞自噬水平,并進(jìn)一步抑制細(xì)胞凋亡及調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),此過(guò)程可能與mTOR信號(hào)通路有關(guān)。

      參考文獻(xiàn)

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      作者簡(jiǎn)介:李春亮(1978-),主治醫(yī)師,碩士,主要從事四肢創(chuàng)傷研究。 △通訊作者,E-mail:lizhaowei5120@sina.com。

      doi:·經(jīng)驗(yàn)交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.15.029

      [中圖分類號(hào)]R684.3

      [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B

      [文章編號(hào)]1671-8348(2016)15-2118-05

      (收稿日期:2015-11-08修回日期:2016-02-11)

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