楊春寶 史雪峰 續(xù)力民 呂繼宏 孫振軍 項毅 張浩

中國人民解放軍第264醫(yī)院骨科，山西 太原 030001

骨質(zhì)疏松是我國老年人群的三大疾病之一。20世紀90年代，Oliver提出的納米壓痕技術(shù)(nanoindentation)成為研究材料微納觀力學(xué)特性的新技術(shù)。它不僅能夠精確測量骨小梁細微結(jié)構(gòu)的彈性模量、硬度，而且可以用于骨微結(jié)構(gòu)斷裂韌性的檢測。因此，近年來，國內(nèi)外學(xué)者對骨質(zhì)疏松的生物力學(xué)研究已從骨骼的宏觀力學(xué)層面逐漸轉(zhuǎn)向納米水平的微觀力學(xué)。

而影響納米壓痕產(chǎn)生誤差的因素有很多，粘彈作用是其中比較重要的影響因素。目前納米壓痕的測量方法是基于彈性、各向同性的樣品材料和可以忽略的粘附力，但許多生物材料常常表現(xiàn)出粘彈性或與時間相關(guān)的行為，可能會受到針尖和樣品之間的粘合相互作用。這種作用會使納米壓痕測量發(fā)生誤差。納米壓痕中最容易發(fā)生的粘彈性是蠕變或者叫做恒定負荷下進針中針尖下沉。

合適的保載時間(Holding time)可以消除這種不良因素。保載時間是在納米壓痕測量壓頭增加載荷過程中加載到一定負荷時保持加載力度的一段時間[1,2]。目前國內(nèi)外對保載時間研究尚少[3,4]，且都是牛等大型動物，而納米壓痕測量最常用的為大鼠模型。因此，本實驗通過比較納米壓痕檢測下不同保載時間(15 s，30 s，60 s，90 s，120 s)對正常SD大鼠股骨標本的彈性模量和硬度的影響來探討合適的保載時間，為更準確的測量大鼠微觀力學(xué)特性提供理論依據(jù)。

1 材料和方法[5]

1.1 實驗標本

1.1.1實驗動物：10只健康雌性SD大鼠，年齡(10±0.5)月，體重(300 ± 20)g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。

1.1.2標本制備：用鉆石鋸切片機從股骨中段切出一段約5 mm厚的皮質(zhì)骨薄片，切割同時不間斷地用去離子水沖洗切割部位。隨后用不同碳化硅粒度的砂紙(依次600、800、1000、1200目)打磨標本直至表面光滑如鏡面，然后用鋁粉拋光器進行表面拋光，最后用超聲波清洗機洗去標本表面的碎屑，再次用去離子水沖洗10s。標本浸泡在生理緩沖液中，放置-20℃冰箱冷藏。

1.2 納米壓痕測量

把SD大鼠股骨標本從冰箱取出，放至常溫下自然解凍，保持納米壓痕儀器室內(nèi)常溫20℃和濕度60%到70%左右。納米壓痕儀的加載負荷精確到0.05 μN，它的位移可以精確到0.01 nm。我們選取Berkovich壓頭，因為相比于其他壓頭，玻式壓頭更適合測量彈性模量和硬度。選取加載速度為0.1 mN/s，加載到最大壓力為1 mN時，卸載時間為0.1 mN/s，最大壓力400 mN，保持以上條件不變，保載時間分別采用15 s、30 s、60 s、90 s、120 s共5組。每組時間分別壓10個點，壓點區(qū)域都選在皮質(zhì)骨標本中心到最邊緣的中間1/2的位置，之間的距離保持在5 μm。

整合所得數(shù)據(jù)，可以得到載荷-位移曲線。卸載曲線的初始斜率即為該壓點的彈性接觸剛度，縮寫S。載荷(P)和卸載曲線的上半部分有關(guān)，并可以由以下公式得到：

P=a(h-hf)m

(1)

其中a和m是公式里的常數(shù)。當壓痕深度為最深，即h=hmax時，S可以由以下公式得到

(2)

為了得到彈性模量和硬度，還需要得到接觸面積的值，即A。而在納米壓痕測量中，接觸面積是由其儀器的壓頭所決定的。

通過以下公式可以由彈性接觸剛度S而得到彈性模量Er：

(3)

β是壓頭的幾何學(xué)常數(shù)，對于玻式壓頭來說β=1.034。

(4)

其中Ei是約化模量，Vi是波松比。對于骨組織，其波松比V=0.3。從而可以用下面的公式求得彈性模量E：

(5)

處于峰值負荷的接觸硬度(Hc)即為硬度，故可由下面公式求得硬度為

(6)

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

計量資料采用均數(shù)±標準差表示，采用SPSS19進行方差分析，組間多重比較采用單方向方差分析(One-Way ANOVA)，預(yù)先用Levene方法進行方差齊性檢驗，方差齊性采用最小顯著差值法(Least-Significant Different，LSD)檢驗，方差不齊則采用Welch方法進行檢驗。選用P< 0.05為統(tǒng)計學(xué)顯著性界值。

2 結(jié)果

表1 各保載時間組間硬度和彈性模量的比較Table 1 Comparison of the hardness and Er in each group

硬度H組間P>0.05，無顯著性差異；彈性模量Er組間P<0.05，有顯著性差異。

表2 各保載時間改變時硬度、彈性模量變化比例Table 2 Change ratio of the hardness and Er in each group

圖1 皮質(zhì)骨硬度隨保載時間的變化Fig.1 Change of the cortical bone hardness as the holding time

圖2 皮質(zhì)骨彈性模量隨保載時間的變化Fig.2 Change of the cortical bone Er as the holding time

從表1和圖1、2中可以看到：隨著保載時間的增加，硬度和彈性模量并不是一個單純遞增的曲線，而是在60 s之后有下降趨勢或者反折。從表1得知硬度H組間P>0.05，無顯著性差異；彈性模量Er組間P<0.05，有顯著性差異。從表2可得知，保載時間每改變30 s時硬度、彈性模量變化比例平均為14.8%，5.6%。

3 討論

納米壓痕測量對于樣品的厚度和表面光滑度有一定的要求。目前最常用的兩種打磨方法為：脫水包埋切片打磨和直接切片打磨(簡稱“干、濕”法)[6]。 “干”方法和“濕”方法的區(qū)別在于前者在切片打磨之前需要用乙醇梯度脫水并用PMMA進行包埋。 “干”方法在包埋中會產(chǎn)生大量的熱量。經(jīng)本實驗核實，外部溫度大約70℃左右，內(nèi)部溫度則更高，對骨結(jié)構(gòu)有一定的破壞性；并且包埋液會滲透進皮質(zhì)骨的空隙中，而納米壓痕測量測定是十納米甚至幾納米的區(qū)域，一旦此區(qū)域含有包埋液，則會對測量結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。“濕”方法在納米壓痕測量中標本的粘彈性更高，對測量值有一定的影響[7]。但粘彈性可以通過納米壓痕測量中加載過程中加入一定的保載時間來消除。根據(jù)Briscoe[8]的研究，將峰值前后10s進行合并，使其載荷恒定，從而消除粘彈作用。一般采用30 s到120 s[3,4]的保載時間，從而消除材料粘彈作用對卸載曲線的影響[9-11]。具體的保載時間應(yīng)該由實驗材料的粘彈性質(zhì)和卸載率來確定[12]。Ngan[13]和Cheng[14]等人發(fā)現(xiàn)可用梯形加載函數(shù)來分析粘彈性材料，從而保證材料的粘彈作用不會對最終的彈性模量計算產(chǎn)生不良影響。因此，本實驗采用能更好保持骨活性和骨結(jié)構(gòu)的“濕法”來對SD大鼠股骨標本進行處理，并且在后期納米壓痕測量中采用保載時間和特定加載函數(shù)來消除粘彈性帶來的不良影響。

本實驗選取SD大鼠的股骨中段部分。因為骨的這片區(qū)域可以更好的代表人骨整體的骨微觀力學(xué)性質(zhì)[15]。Hoc[16]和Dong[17]等人發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)骨的微觀力學(xué)強度與松質(zhì)骨一樣具有極為顯著的各向異性，并且處在同一同心圓的骨板的彈性模量和硬度沒有顯著性差異。而納米壓痕測量中兩個樣本最少要相隔5 μm，否則各個壓點間會因為壓頭擠壓樣本組織而相互影響。本實驗壓點選定標本中心到最邊緣的1/2的位置，壓點之間的距離保持在5 μm。皮質(zhì)骨在接近的區(qū)域，微觀力學(xué)性質(zhì)相近，而且股骨中段的皮質(zhì)骨橫截面為類中空圓狀，同一半徑圓上的微觀力學(xué)性質(zhì)較為一致，故選取皮質(zhì)骨做本實驗的標本，并且選取兩壓點間距離為納米壓痕儀器能檢測的最小距離5 μm。所以，基本可以認為本實驗是在相同的壓點區(qū)域內(nèi)，并且其他試驗條件不變的情況下，研究保載時間對彈性模量和硬度的影響，即保載時間對標本骨粘彈性的影響。

從研究結(jié)果可以得知，保載時間每改變30 s時硬度、彈性模量變化比例平均為14.8%、5.6%，說明保載時間對微觀力學(xué)檢測值有較大影響。隨著保載時間的增加，硬度和彈性模量并不是一個單純遞增的曲線，而是在60 s之后有下降趨勢或者反折。這提示60 s可能是一個臨界點。依據(jù)納米壓痕中彈性模量和硬度的計算公式，可知粘彈作用會導(dǎo)致彈性模量和硬度值的降低。從各表可知道，硬度值在60 s是最高，提示保載時間為60 s時，骨標本的粘彈作用最小；而在彈性模量值中60 s和120 s為最高，而且二者之間沒有顯著性差異。而Norman等人[18]在研究中證實骨組織中的彈性模量和硬度也有著顯著的正相關(guān)性。120 s保載時間的硬度為1.07 GPa，遠低于60 s的1.45 GPa。而納米壓痕檢測中產(chǎn)生誤差的原因很多，比如標本表面欠光滑等等。根據(jù)Wu等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，標本表面欠光滑會導(dǎo)致彈性模量和硬度正相關(guān)性降低。因此，本課題組推測120 s保載時間的彈性模量可能是一個誤差數(shù)據(jù)。

綜上可得，60 s是SD大鼠合適的保載時間。探索出合適的保載時間后，可以進一步更準確的測量各組去勢大鼠股骨標本的微觀力學(xué)性質(zhì)，從而研究SD大鼠骨微觀力學(xué)隨去勢時間的變化規(guī)律。