魯世金 孫長英 車艷軍 裴衛(wèi)衛(wèi)

長治醫(yī)學(xué)院，山西 長治 046000

引 言

雌激素受體雌激素受體α(Estrogen receptor α，ERα)和雌激素受體β(Estrogen receptor β，ERβ)均存在于成骨細胞及它們的前體中[1]，在骨骼發(fā)育和維持過程中起著重要作用。根據(jù)資料，許多研究主要聚焦于ERα，認為ERα在骨骼發(fā)育和維持過程中通過調(diào)節(jié)破骨細胞活性而發(fā)揮骨保護作用[2]，明顯影響骨礦物質(zhì)的代謝[3]。ERβ通過與ERα形成二聚體抑制ERα與雌激素反應(yīng)元件結(jié)合而負調(diào)控ERα轉(zhuǎn)錄活性[4, 5]。但最近也有研究證明，ERβ也在調(diào)控成骨細胞增殖和分化過程起著重要作用[6]。Bhargavan[7]等研究證明ERβ也能夠提高促骨生成基因的表達和成骨細胞功能。通過研究ERβ基因敲除鼠，證明ERβ調(diào)節(jié)成年雌性鼠的骨小梁的重建，相對于野生型鼠， 成年雌性ERβ基因敲除鼠皮質(zhì)骨形成增加，骨小梁礦物質(zhì)含量較高[8, 9]。Sniekers[10]等研究ERalpha-/-beta-/-6個月小鼠，觀察到骨贅的數(shù)量和/或體積增加，并且外側(cè)軟骨板變薄。在ERα-/-和ERβ-/ - 小鼠比較，軟骨損傷評分、骨贅形成、軟骨板厚度沒有顯著差異。在ER alpha-/-小鼠的骨骺骨小梁體積不變， 但是，ERbeta/ - 小鼠則增加，并在ERalpha-/-beta-/-雙敲除小鼠中則下降, 提示兩種受體可能存在一定的代償功能。最近的研究表明ERβ和ERα的激活對骨具有相似的作用[11]，當(dāng)ERα功能降低時，ERβ在一定程度上可以補償其功能[10]。總之，ERβ和ERα在調(diào)控成骨細胞增殖和分化中的相互作用一直存在爭議，并且ERβ通過什么信號途徑發(fā)揮功能一直不清楚。

Huang 等[12]研究證明SOST基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游10 kb 區(qū)域存在3 個潛在的雌激素受體反應(yīng)元件ERE，SOST是雌激素調(diào)控的靶基因之一。趙薇等[13]報道絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥婦女血清SOST 水平與雌二醇(E2)呈負相關(guān)。由于絕經(jīng)后婦女體內(nèi)雌激素水平降低, 導(dǎo)致更容易患骨質(zhì)疏松癥,因此雌激素很可能抑制SOST基因的表達。SOST基因位于染色體17q12-21，骨細胞[14]和關(guān)節(jié)軟骨細胞[15]中表達的SOST基因編碼sclerostin[16]。當(dāng)硬化蛋白與成骨細胞表面的受體結(jié)合時，細胞內(nèi)下游信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)被啟動，以抑制成骨細胞的骨形成。人類罕見的遺傳性骨骼疾病(如sclerosteosis和Van Buchem病)中，硬化蛋白水平低，表現(xiàn)為較高的骨礦物質(zhì)密度(BMD)，骨折的風(fēng)險較低。SOST基因敲除小鼠的骨形成、骨密度和骨強度均有所增加[17]; 在嚙齒類[18]和靈長類動物[19]中, 用單克隆抗體抑制SOST蛋白可增加骨的形成和促進骨折愈合。硬化蛋白與成骨細胞表面的LRP5/ 6和Frizzled共同受體結(jié)合，抑制Wnt/β-catenin信號傳遞[20]，從而抑制成骨細胞分化、增殖和活性，導(dǎo)致成骨細胞的骨形成減少[21]。然而，ERβ是否通過調(diào)控SOST基因表達發(fā)揮對成骨細胞的調(diào)控功能，目前尚不清楚。

本文假說， 在成骨細胞中ERβ對ERα活性發(fā)揮平衡作用，當(dāng)ERα活性高時，ERβ抵抗ERα在骨形成中的刺激作用；當(dāng)ERα活性減弱或喪失后，ERβ的表達補償ERα的作用，刺激成骨細胞的增殖和分化，這種作用是通過ERβ抑制SOST表達獨立發(fā)揮作用的。

1 材料與方法

設(shè)計：隨機對照研究。時間及地點：本實驗于2012年10月—2014年12月完成于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院國家重點遺傳實驗室。

1.1 材料

小鼠前體成骨細胞株MC3T3-E1購于中國細胞庫。超凈工作臺、倒置顯微鏡、細胞培養(yǎng)箱、BD vantage流式細胞儀、酶標(biāo)儀、Forma 420 型空氣搖床和電泳儀等儀器均由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院國家重點遺傳實驗室提供。MTT、EDTA、DPN、PPT、胰酶、DMSO、β-磷酸甘油購于Sigma公司；Triton X-100購于CalBiochem公司；DMEM購于GIBCO公司；LipofectamineTM2000購于Invitrogen公司；FBS購于Hyclone公司； Tris·Cl購于amresco公司； ERα-shRNA-PLL3.7、 ERβ-shRNA-PLL3.7慢病毒載體由本文第一作者設(shè)計構(gòu)建，經(jīng)鑒定能夠高效打靶并沉默目的基因表達后包裝為病毒顆粒(另文報告)。

1.2 實驗方法

取小鼠前體成骨細胞株MC3T3-E1，首先設(shè)立4組。即ERαRNAi組：轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒ERα-shRNA-PLL3.7慢病毒顆粒； ERβRNAi組：轉(zhuǎn)染重組細胞ERβ-shRNA-PLL3.7慢病毒顆粒；聯(lián)合沉默組(ERα-ERβRNAi組，E組)：同時轉(zhuǎn)染重組質(zhì)料ERα-shRNA-PLL3.7和ERβ-shRNA-PLL3.7慢病毒顆粒；空白對照組(F組)：不對細胞做任何干預(yù)。然后對ERαRNAi組再分兩個亞組，即ERβ激動組(A組)：轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒ERα-shRNA-PLL3.7慢病毒顆粒，同時在細胞培養(yǎng)液中加入選擇性ERβ激動劑(2,3-bis (4-hydroxyphenyl) -propionitrile，DPN)；ERβ正常組(B組)，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒ERα-shRNA-PLL3.7慢病毒顆粒，但不干預(yù)ERβ的表達。對ERβRNAi組同樣再分兩個亞組，即ERα激動組(C組)：轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒ERβ-shRNA-PLL3.7慢病毒顆粒，同時在細胞培養(yǎng)液中加入選擇性ERα激動劑(1,3,5-tris(4-hydroxyphenyl)-4-propyl- 1H-pyrazole，PPT)；ERα正常組(D組)，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒ERβ-shRNA-PLL3.7慢病毒顆粒，但不干預(yù)ERα的表達。

以上各組全培養(yǎng)液為DMEM+10%FBS+青霉素(100μg/ml)+鏈霉素(100 μg/ml)，培養(yǎng)液中加入17β-雌二醇(20 ng/ml)。待細胞生長至匯合度約70%-80%左右時，行重組質(zhì)粒慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染及干預(yù)處理。

1.3 流式細胞光度術(shù)分析細胞周期

取6孔板中轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期MC3T3-E1細胞，用0.25%的胰酶消化，離心收集細胞，棄上清，用預(yù)冷PBS洗細胞兩次。加入預(yù)冷70%乙醇，于4℃過夜固定。離心收集細胞，以1 ml的PBS洗細胞1次，加入500 μl PBS(含50 μg/ml溴化乙錠(PI)，100 μg/ml RNase A， 0.2% Triton X-100)4℃避光孵育30分鐘。然后，以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細胞儀檢測，一般計數(shù)2～3萬個細胞，結(jié)果用細胞周期擬和軟件ModFit分析。

1.4 MTT法測各組細胞的生長曲線的影響

取轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期MC3T3-E1細胞， 制成相同密度的細胞懸液(6 ×105/ml)，接種于96孔平板，每孔100 μl，每板每個亞組樣品接種4孔，共接種5塊板。并且，每板中設(shè)4孔陰性對照，不接種細胞，只加入細胞培養(yǎng)液。于37℃、5%CO2培養(yǎng)，分別于第1、3、5、7、9天各取1塊板，于每個孔中加入10 μl 的MTT液(2 g/L)，培養(yǎng)4 h后再加DMSO100 μl，用自動酶標(biāo)儀測490 nm波長處的吸光度值(OD值 )。結(jié)果取4孔均值，以培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，繪制細胞的生長曲線圖。

1.5 用Realtime-PCR檢測各組中SOST、OPG和RunX2基因表達

取所設(shè)計各個亞組細胞，將細胞密度調(diào)整為6 ×105/ml的懸液，接種于6孔平板各孔中，每孔2 ml，每個樣品重復(fù)接種4個孔，放置在37℃、5%CO2全濕培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10天，裂解細胞，提取總RNA，經(jīng)RT為總cDNA后進行Realtime-PCR檢測分析。計算各處理組目的基因相對于空白對照組表達增加的倍數(shù)，計算過程為：ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)；ΔΔCt=ΔCt(實驗組)-ΔCt(對照組)；2-ΔΔCt表示實驗組目的基因的表達相對于對照組增強的倍數(shù)。如果2-ΔΔCt的計算結(jié)果均值小于1，表示目的基因表達減弱，則用-1/2-ΔΔCt換算成目的基因相對于空白對照組表達增強的負倍數(shù)。 設(shè)計基因檢測引物，Sost 基因( ID:74499) Forward：5′-TGCCGCGAGCTGCACTACAC-3′，Reverse： 5′-CACCACTTCACGCGCCCGAT-3′。 OPG基因(ID:18383 )：Forward：5′- GTTCCTGCACAGC TTCACAA -3′；Reverse：5′- AAACAGCCCAGTGACCATTC -3′，擴增片段121bp。Runx2基因(ID:12393)：Forward： 5′- GACGAGGCAAGAGTTTCACC -3′；Reverse：5′- CTGAGGCGATCAGAGAACAA -3'，擴增片段178bp。用肌動蛋白(mouse GAPDH )基因(ID:14433)作為內(nèi)參對照，上游引物: 5′- GGT GAA GGT CGG TGT GAA CG -3′，下游引物: 5′- CTC GCT CCT GGA AGA TGG TG -3′，擴增產(chǎn)物長度233 bp。第次每個樣品檢測4個重復(fù)樣品，將對照組基因表達設(shè)置為100%。計算公式為：ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)；ΔΔCt=ΔCt(實驗組)-ΔCt(對照組)；2-ΔΔCt表示待檢測目的基因的表達相對于空白對照組增強的倍數(shù)。

1.6 ELISA檢測各組OPG、Runx2蛋白表達水平

將各組細胞以及陰性對照細胞計數(shù)后以15萬/孔接種至12孔板內(nèi)，24 h后收集培養(yǎng)上清，培養(yǎng)上清1 000 rpm×10 min后取上清備用。按加拿大CEDARLANE公司的OPG、RunX2 ELISA檢測試劑盒操作說明書和程序進行檢測。按實驗需要的孔數(shù)，使用試劑盒內(nèi)的Capture Antibody稀釋后包被酶標(biāo)板，100 μl/孔，22℃×2 h；0.1% PBS-Tween 20洗孔3次；將標(biāo)準(zhǔn)血漿等比稀釋，每孔加入稀釋的標(biāo)準(zhǔn)血漿或樣品100 μl，并且每個樣本需做兩個孔，22℃×90 min；0.1% PBS-Tween 20洗孔3次，加入稀釋的detecting antibody 100 μl/孔，22 ℃×90 min；0.1% PBS-Tween 20洗孔3次，加入100 μl/孔新鮮配制的 OPD底物，室溫反應(yīng)5～10 min，然后加2.5 mol/L硫酸50 μl/孔終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀上測量490 nm信號，使用標(biāo)準(zhǔn)血漿數(shù)據(jù)繪制對數(shù)-對數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)R2應(yīng)大于0.990，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各樣品的濃度。

1.7 主要觀察指標(biāo)

細胞生長周期，SOST、OPG和RunX2表達水平等。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ERα在E2誘導(dǎo)成骨細胞增殖過程中的作用

ERα表達正常的情況下，單獨沉默ERβ的表達(D組)，處于細胞周期G1細胞數(shù)量稍減少而處于S和G2期細胞數(shù)量稍增加(見圖1-D，表1，表2)，但與空白對照組(F組)比較，沒有顯著性差異，P>0.05(見圖2-B)。同時沉默ERα和ERβ(E組)時，處于細胞周期G1期細胞數(shù)明顯增多，處于G2期細胞數(shù)量明顯減少(見圖1-E)，與空白對照組(F組)和B組比較，有顯著性差異，P<0.05(見圖2-C，表1，表2)。

通過對細胞培養(yǎng)第1、3、5、7、9天分別用MTT法測各組細胞的吸光度值(OD值)并繪制細胞生長曲線，結(jié)果顯示第1天時，各組與空白對照組比較，無顯著性差異，P>0.05；而第3、5、7、9天每次檢測時， D組細胞OD值高于空白對照組，差異有顯著性，P<0.05。E組細胞OD值明顯小于空白對照組，差異有顯著性，P<0.05。(見表3、表4，圖3、圖4)。

2.2 沉默ERβ表達時， 激動ERα對調(diào)控成骨細胞增殖的影響

單獨沉默ERβ而ERα表達正常(D組)時，處于細胞周期G1細胞百分比稍減少而處于S和G2期細胞百分比稍增加(見圖1-D)，與空白對照組(F組)比較沒有顯著性差異，P>0.05(見圖2-B)；但是，單獨沉默ERβ而激動ERα表達(C組)時，處于細胞周期G1細胞百分比明顯減少而處于S和G2期細胞百分比明顯增加(見圖1-C)，與空白對照組(F組)比較有顯著性差異，P<0.01(見圖2- D)。并且和D組比較，C組細胞周期G1細胞百分比減少而G2期細胞百分比明顯高增高，兩比較有顯著性差異，P<0.05(見圖2-E)。MTT法檢測C組和D組細胞吸光度值(OD值)均高于空白對照組，差異有顯著性，P<0.05；并且當(dāng)沉默ERβ表達時， ERα激動劑顯著增高細胞吸光度值(OD值)，C組與D組比較，差異有顯著性，P<0.05。(見表3，表4，圖3)

2.3 在ERα表達減弱時，激動ERβ對ERα介導(dǎo)E2調(diào)控成骨細胞增殖的作用，

如果沉默ERα表達而保持ERβ正常表達(B組)時，成骨細胞增殖能力明顯減弱，和空白對照組(F組)比較，處于細胞周期G1期細胞數(shù)明顯增多，處于G2期細胞數(shù)量明顯減少(見圖1-B，圖1-F)，差異有顯著性P<0.05(圖2-A)。如果在沉默ERα表達的基礎(chǔ)上同時沉默ERβ的表達(E組)，處于細胞周期G1期細胞百分比進一步增多，處于G2期細胞百分比進一步減少(見圖1-E)，與B組比較，有顯著性差異，P<0.05(見圖2-C)。相反，如果在沉默ERα表達的基礎(chǔ)上應(yīng)用ERβ激動劑使ERβ過表達(A組)，與B組和E組比較，處于細胞周期G1期細胞百分比均明顯減少，處于G2期細胞百分比均明顯增多(見圖1-A)，有顯著性差異，P<0.05(圖2-F)。

圖1 流式細胞儀檢測各組細胞周期圖A、B、C、D、E、F分別為A組(ERαRNAi+ ERβ激動組)、B組(ERαRNAi+ ERβ正常表達組)、C組(ERβRNAi組+ ERα激動組)、D組(ERβRNAi組+ ERα正常表達組)、E組(ERα-ERβRNAi組)、F組(空白對照組)的流式細胞儀檢測細胞周期圖。Fig.1 The cell cycle was detected by flow cytometry in each group respectively. Figure A, B, C, D, E, F indicated the cell cycles were detected by flow cytometry in the group A (ERαRNAi + ERβ activation group), group B (ERαRNAi + ERβ normal expression group), group C (ERβRNAi group + ERα activation group), group D (ERβRNAi group + ERα normal expression group), group E (ERα-ERβRNAi group), group F (control group), respectively.

表1 各組細胞流式細胞儀檢測結(jié)果列表Table 1 The results of the cell cycles detected by flow cytometry in each group

表2 各組細胞細胞周期兩兩比較測統(tǒng)計結(jié)果列表Table 2 The list of statistical results of cell cycles between each two groups

圖2 各組細胞周期比較統(tǒng)計圖Fig.2 The chart of Comparison of cell cycles in each group

表3 各組細胞分別于1、3、5、7、9天測得OD值列表Table 3 The chart of Comparison of OD values of cells in each group at the 1d.3d.5d.7d.9d

注：經(jīng)重復(fù)測量多因素方差分析統(tǒng)計結(jié)果顯示：組內(nèi)因素比較，各測量時間之間有顯著性差異，F(xiàn)=31579.90，P=0.000；組間因素比較有顯著性差異，F(xiàn)=222.94，P=0.000；各組間連續(xù)測量OD值兩兩比較見表4。Note: Thestatistical results of repeated measures multivariate analysis. The tests of within-subjects show a significant differences, F=31579.90, P=0.000; the tests of between-subjects show that there was a significant difference, F=222.94, P=0.000; The LSD of the OD values of each group were shown in Table 4.

圖3 MTT法測得各組細胞分別于1、3、5、7、9天的 OD值繪制的生長曲線Fig.3 growth curve were plotted drawn according to OD values of cells measured by MTT assay in each group at 1,3,5,7,9 days, respectively.

圖4 各組細胞在各觀測時間點OD值比較圖示Fig.4 The chart of Comparison of OD values of cells in each group at the appropriate time point

表4 各組細胞OD值兩兩比較統(tǒng)計結(jié)果Table 4 The list of statistical results of Comparison of OD values of cells in each group

2.4 在ERα表達減弱時，激動ERβ對SOST基因表達的影響

各組成骨細胞SOST基因表達經(jīng)Realtime-PCR檢測結(jié)果顯示，沉默ERα表達而保持ERβ正常表達(B組)時，成骨細胞SOST基因表達約為空白對照組的0.1109±0.0302倍，即相對增強了-12.31±6.53倍。而在沉默ERα表達的基礎(chǔ)上應(yīng)用ERβ激動劑使ERβ過表達(A組)，則成骨細胞SOST基因表達進一步顯著降低，約為空白對照組的0.0008±0.0003倍，即相對增強了-1510.39±660.69倍。相反，如果在沉默ERα表達的基礎(chǔ)上同時沉默ERβ的表達(E組)，成骨細胞SOST基因表達反而增強，約為空白對照組的474.523±132.524倍。三組間兩兩比較，差異均有顯著性，P<0.05(見表5，表6，表7; 圖5)。

表5 Realtime-PCR檢測各組間成骨細胞SOST 、OPG 和Runx2基因表達Table 5 SOST, OPG and Runx2 gene expression in osteoblasts detected by Realtime-PCR in each group

表6 各組間成骨細胞SOST 、OPG 和Runx2基因表達相對于空白對照組增強倍數(shù)Table 6 The enhanced multiples of gene expression of SOST, OPG and Runx2 in osteoblastic cells in each group compared with control groups

注：ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因);ΔΔCt=ΔCt(實驗組)-ΔCt(對照組);2-ΔΔCt表示待檢測目的基因的表達相對于空白對照組增強的倍數(shù);-1/2-ΔΔCt表示待檢測目的基因的表達相對于空白對照組減弱的倍數(shù)(即增強的負倍數(shù))。Note: ΔCt = Ct (target gene) -Ct (reference gene);ΔΔCt = ΔCt (experiment group) -ΔCt (control group);2-ΔΔCt indicates increased multiples of the expression of the target gene compared with control group;-1/2-ΔΔCt indicates decreased multiples of the expression of the target gene compared with control group (ie. negative enhanced multiples)

表7 各組SOST基因表達兩兩比較統(tǒng)計列表Table 7 The list of statistical results of LSD of gene expression of SOST in each group

2.5 在ERα表達減弱時，激動ERβ對成骨細胞中OPG和RunX2的表達的作用

如果在沉默ERα表達的基礎(chǔ)上同時沉默ERβ的表達(E組)，成骨細胞中OPG和RunX2的表達相對于空白對照組顯著減弱，分別約為正常表達的0.0005±0.000倍和0.0005±0.000倍，即相當(dāng)基因表達增強了-1990.01±438.64倍和-2404.42±845.68倍。如果沉默ERα表達而保持ERβ正常表達(B組)，成骨細胞中OPG和RunX2的表達相對于空白對照組明顯減弱，分別約相當(dāng)于空白對照組表達的0.0010±0.000倍和0.0017±0.001倍，即相當(dāng)基因表達增強了-999.26±229.48倍和-647.66±191.64倍；但和E組比較，OPG和RunX2的表達明顯增強，兩組比較，差異有顯著性，P<0.05。如果在沉默ERα表達的基礎(chǔ)上應(yīng)用ERβ激動劑使ERβ過表達(A組)，成骨細胞中OPG和RunX2的表達分別為相當(dāng)于空白對照組表達的0.1329±0.061倍和0.1484±0.031倍，但和B組比較，二者均明顯增強，差異有顯著性，P<0.05。(見表5，表6，表7； 圖5)

2.6 在ERα表達減弱時，應(yīng)用SOST單克隆抗體對沉默ERβ基因表達引起OPG和RunX2表達的影響

為了進一步研究ERβ活性改變是否通過調(diào)節(jié)SOST基因表達而影響成骨細胞特征性細胞因子的表達。本研究進一步將ERα-ERβRNAi組(E組)細胞再分出一個SOST抗體組(即G組)，在同時沉默ERα和ERβ基因表達的同時，在細胞培養(yǎng)液中再加入SOST抗體。經(jīng)ELISA檢測各組OPG和RunX2的蛋白表達。結(jié)果顯示，如果沉默ERα表達而保持ERβ正常表達(B組)，成骨細胞中OPG和RunX2的蛋白表達明顯減弱，和空白對照組(F組)比較，差異有顯著性，P<0.05。如果在沉默ERα表達的基礎(chǔ)上同時沉默ERβ的表達(E組)，成骨細胞中OPG和RunX2蛋白表達更進一步減弱，與B組比較，差異有顯著性，P<0.05。如果在E組細胞的培養(yǎng)液中加入SOST抗體(G組)逆轉(zhuǎn)細胞中OPG和RunX2蛋白表達的降低，和E組比較，OPG和RunX2蛋白表達明顯增強，兩組間差異有顯著性，P<0.05；這一結(jié)果與A組中應(yīng)用ERβ激動劑有相似作用，G組細胞OPG和RunX2蛋白表達雖然較A組略低，但兩組間差異沒有顯著性，P>0.05(見表10，表11，表12)。

3 討論

在人類，無認男性還是女性，雌激素在骨骼代謝中均起主要作用[22]，并且具有性別和年齡的依賴性[23]。雌激素受體α(Estrogen receptor α，ERα)和雌激素受體β(Estrogen receptor β，ERβ)均存在于成骨細胞及它們的前體中[1]，ERs基因突變可以引起骨骼生長異常和骨質(zhì)丟失[24]。然而，ERα和ERβ對骨代謝的調(diào)控機制相當(dāng)復(fù)雜，至今尚不清楚。以前的研究多認為，ERα在骨骼發(fā)育和維持過程中起著重要作用[3, 25, 26]。ERβ可以調(diào)節(jié)ERα的活性，抵抗ERα在骨形成中的刺激作用[8-10]。然而，也有研究證明， ERβ和ERα的激活對骨代謝具有相似的作用[11]，Bhargavan[7]等證明ERβ也能夠提高促骨生成基因的表達和成骨細胞功能。Sims NA[27]等認為女性骨重建受兩種核受體共同調(diào)節(jié)，且兩種受體亞型相互補償。當(dāng)ERα功能降低時，ERβ在一定程度上可以補償其功能[10]?？傊?，ERβ和ERα在調(diào)控成骨細胞增殖和分化中的相互作用一直存在爭議。為了進一步研究ERβ和ERα在調(diào)控骨代謝中的相互作用，本實驗結(jié)果顯示，如果ERα表達正常的情況下，單獨沉默ERβ的表達(D組)，小鼠前體成骨細胞增殖能力并沒有降低，反而略有增強，但和空白對照組比較沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。如果應(yīng)用ERα激動劑使ERα過表達的情況下，單獨沉默ERβ的表達(C組)，則成骨細胞增殖能力明顯增強。這證明ERα在調(diào)節(jié)成骨細胞增殖和分化過程發(fā)揮主要作用，并且在ERα表達水平正常時，ERβ對ERα起著抑制作用。為進一步研究在ERα表達減弱時，ERβ的作用，本研究在沉默ERα表達的同時，干預(yù)ERβ的表達，結(jié)果顯示如果沉默ERα表達而保持ERβ正常表達(B組)時，成骨細胞增殖能力明顯減弱(見圖1-B，圖1-F，圖2-A)；如果在沉默ERα表達的基礎(chǔ)上同時沉默ERβ的表達(E組)，成骨細胞增殖能力更進一步減弱(見圖2-C)。相反，如果在沉默ERα表達的基礎(chǔ)上應(yīng)用ERβ激動劑使ERβ過表達(A組)，則成骨細胞增殖能力反而得到補償(見圖1-A，圖2-F)。這說明，當(dāng)ERα表達減弱時，ERβ的表達可以補償ERα的作用，部分增強成骨細胞的增殖分化。

表8 各組OPG表達改變倍數(shù)值兩兩比較統(tǒng)計列表Table 8 The list of statistical results of LSD of gene exprewwion of OPGin each group

圖6 OPG和Runx2蛋白表達比較統(tǒng)計圖Fig.6 The chart of Comparison of protein expression of OPG and Runx2 in each group

表9 各組RunX2表達改變倍數(shù)值兩兩比較統(tǒng)計列表Table 9 The list of statistical results of LSD of gene exprewwion of Runx2 in each group

表10 ELISA檢測各組間成骨細胞OPG、Runx2蛋白表達列表Table 10 The list of protein expression of OPG, Runx2 in osteoblasts detected by ELISA in each group

表11 各組間成骨細胞OPG表達差異統(tǒng)計列表Table 11 The list of statistical results of LSD of protein exprewwion of OPG in each group

表12 各組間成骨細胞Runx2表達差異統(tǒng)計列表Table 12 The list of statistical results of LSD of protein expression of Runx2 in each group

目前研究證明，成骨細胞重要的標(biāo)志性細胞因子SOST、OPG、RunX2等的表達均與雌激素的作用密切相關(guān)。骨細胞[14]和關(guān)節(jié)軟骨細胞[15]中表達的SOST基因編碼硬化蛋白(sclerostin)[16]。Huang 等[12]發(fā)現(xiàn)SOST基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游10 kb 區(qū)域存在3 個潛在的雌激素受體反應(yīng)元件ERE，因此他們認為SOST是雌激素調(diào)控的靶基因之一。趙薇等[13]報道絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥婦女血清SOST 水平與雌二醇(E2)呈負相關(guān)。由于絕經(jīng)后婦女體內(nèi)雌激素水平降低, 導(dǎo)致更容易患骨質(zhì)疏松癥,因此雌激素很可能抑制SOST基因的表達。當(dāng)硬化蛋白與成骨細胞表面的受體結(jié)合時，細胞內(nèi)下游信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)被啟動，以抑制成骨細胞的骨形成。SOST基因敲除小鼠的骨形成、骨密度和骨強度均有所增加[17]; 在嚙齒類[18]和靈長類動物[19]中, 用單克隆抗體抑制SOST蛋白可增加骨的形成和促進骨折愈合。硬化蛋白與成骨細胞表面的LRP5/ 6和Frizzled共同受體結(jié)合，抑制Wnt/β-catenin信號傳遞[20]，從而抑制成骨細胞分化、增殖和活性，導(dǎo)致成骨細胞的骨形成減少[21]。Runx2 屬于Runt box(Runx)是一個亞型，也稱核結(jié)合因子a1 ( core binding factor a1,Cbfa1)，主要與硬骨及軟骨的形成以及一些骨疾病有關(guān)[28]，是成骨細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[29]。研究證明，SOST臨近啟動子上游有一個140 bp 的元件, 含有兩個E-boxes、C/EBP和Runx2 的結(jié)合位點, 該元件是SOST基因轉(zhuǎn)錄活性所必需的[30]。因此，SOST可以影響細胞因子Runx2的表達。

然而，當(dāng)ERα表達減弱時，ERβ激活對SOST信號傳遞及其對OPG和RunX2等細胞因子的調(diào)控作用尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，如果沉默ERα表達而保持ERβ正常表達(B組)時，成骨細胞SOST基因表達略有降低，成骨細胞中OPG和RunX2的表達相對于空白對照組卻明顯減弱；如果在沉默ERα表達的基礎(chǔ)上應(yīng)用ERβ激動劑使ERβ過表達(A組)，則成骨細胞SOST基因表達顯著性降低，而成骨細胞中OPG和RunX2的表達反而明顯增強；相反，如果在沉默ERα表達的基礎(chǔ)上同時沉默ERβ的表達(E組)，成骨細胞SOST基因表達反而明顯增強，而成骨細胞中OPG和RunX2的表達卻顯著減弱(見表5，表6，表7; 圖5)，說明當(dāng)ERα表達減弱時，ERβ的活化抑制SOST基因的表達，而對OPG和RunX2的表達具有激動作用。如果同時沉默ERα和ERβ的表達，并在細胞培養(yǎng)液中加入SOST單克隆抗體(G組)，則成骨細胞中OPG和RunX2蛋白表達不但沒有進一步降低，反而顯著增強(見表10，圖6)，說明當(dāng)ERα表達減弱時，ERβ的表達補償ERα的作用而增強成骨細胞的增殖分化，是通過抑制SOST基因表達來實現(xiàn)的。Galea 等[31]也認為ERβ介導(dǎo)應(yīng)力和雌二醇引起的SOST快速下調(diào)，與本研究結(jié)果有相似之處。

綜上所述， ERβ與ERα的相互作用隨ERα表達水平的變化而異，當(dāng)ERα正常表達或活性增高時，ERβ抵抗ERα在骨形成中的刺激作用；當(dāng)ERα活性減弱或喪失后，ERβ的激活補償ERα的作用，刺激成骨細胞的增殖和分化，并且這種補償作用是通過ERβ抑制SOST表達而增強成骨細胞增殖相關(guān)細胞因子OPG和RunX2等的表達獨立發(fā)揮作用。