劉秀紅，徐錦忠（.江西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心，江西南昌330038；.江蘇中譜檢測(cè)有限公司，江蘇南京003）

蜂王漿制品中摻入人工癸烯酸的鑒別和測(cè)定

劉秀紅1，徐錦忠2
（1.江西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心，江西南昌330038；2.江蘇中譜檢測(cè)有限公司，江蘇南京210032）

采用高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜為分析手段對(duì)蜂王漿/蜂王漿凍干粉中摻入的人工合成癸烯酸進(jìn)行鑒別和測(cè)定。方法通過對(duì)比摻入人工合成癸烯酸標(biāo)準(zhǔn)品的陽(yáng)性樣品和天然蜂王漿的LC-MS/MS圖譜的差別，發(fā)現(xiàn)了人工合成癸烯酸的特征離子峰，該特征離子峰在天然的蜂王漿和蜂王漿凍干粉中是不存在的，而是只存在于摻入了人工合成的癸烯酸的陽(yáng)性樣品中。此外，該方法在摻假食品檢測(cè)領(lǐng)域具有創(chuàng)新性，前處理簡(jiǎn)單。該方法對(duì)于蜂王漿/蜂王漿凍干粉中摻入的人工合成癸烯酸的檢測(cè)限可以達(dá)到40μg/L。

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；蜂王漿；蜂王漿凍干粉；人工合成癸烯酸

癸烯酸，即10-羥基-α-癸烯酸，又稱王漿酸，簡(jiǎn)稱10-HDA，是蜂王漿中所含的一種特有的高效生物活性物質(zhì)，因此是蜂王漿的一種標(biāo)志物。純正天然的蜂王漿中一般含有1.4%～2.0%的癸烯酸。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定蜂王漿中10-HDA含量達(dá)到1.4%為合格品，達(dá)到1.8%時(shí)為優(yōu)等品；蜂王漿凍干粉中10-HDA含量達(dá)到5.0%為一等品，達(dá)到4.0%為二等品［1-2］。10-HDA含量的高低，直接影響了產(chǎn)品的價(jià)格。由于一方面10-HDA指標(biāo)的重要性，另一方面人工合成的10-HDA已經(jīng)進(jìn)入市場(chǎng)，因此一些不法商販將人工合成的癸烯酸添加到蜂王漿及其制品如凍干粉中，以次充好，以假充真，牟取利益，這種摻假不但會(huì)極大的損害了消費(fèi)者的身體健康，而且也會(huì)擾亂了蜂王漿市場(chǎng)的正常秩序，如不盡快提出先進(jìn)的檢測(cè)方法，一旦爆發(fā)，又將一次對(duì)蜂王漿行業(yè)乃至全國(guó)的食品安全問題產(chǎn)生極大的影響。

研究蜂王漿和蜂王漿凍干粉中癸烯酸的檢測(cè)方法文獻(xiàn)有較多，如陳杰等提出的HPLC法［3-5］，但是至今為止這些方法只能對(duì)蜂王漿和蜂王漿凍干粉中存在的天然王漿酸進(jìn)行檢測(cè)，至今鮮有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)已經(jīng)摻入人工合成的10-HDA的蜂王漿和蜂王漿凍干粉進(jìn)行鑒別，因此，急需研發(fā)一種新的檢測(cè)方法用于鑒別蜂王漿和蜂王漿凍干粉中是否摻入了人工合成10-HDA。本文采用高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜為分析手段，將人工合成的癸烯酸按不同比例摻入到天然的蜂王漿及其凍干粉制品中制成陽(yáng)性樣品，并收集天然蜂王漿和蜂王漿凍干粉樣品作為參比樣品，先對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行全掃描，找出陰性樣品和陽(yáng)性樣品的全掃描圖譜的差異；然后對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行正離子SRM掃描，通過對(duì)比摻入人工合成癸烯酸標(biāo)準(zhǔn)品的陽(yáng)性樣品和天然蜂王漿的LC-MS/MS圖譜的差別，發(fā)現(xiàn)了人工合成癸烯酸的特征離子峰，該特征離子峰在天然的蜂王漿和蜂王漿凍干粉中是不存在的，而是只存在于陽(yáng)性樣品中；最后通過檢測(cè)該特征離子可以有效的鑒別蜂王漿中是否添加人工合成的癸烯酸，并對(duì)加入的人工合成癸烯酸進(jìn)行精確定量。本文提出的檢測(cè)思路在摻假食品檢測(cè)領(lǐng)域內(nèi)創(chuàng)新性較強(qiáng)，前處理簡(jiǎn)單，分析速度快，定量準(zhǔn)確性高，可以推廣應(yīng)用。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

HES-II高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有Electrospray ion source）：Thermo Finnigan TSQ Quantum Ultra；BSA224S天平：Satorius；25 mL容量瓶；微孔濾膜（0.22 μm，水相）：Agela technologies。

無水乙醇（分析純）、無水甲醇（色譜純）、甲酸（色譜純）：Honeywell；去離子水；人工合成10-HDA（99%）：江蘇省食品藥品檢驗(yàn)所提供。

1.2色譜條件

1.2.1高效液相色譜條件

色譜柱選用SepaxBR-C18（2.1 mm×100 mm，5 μm）；柱溫為35℃；流動(dòng)相為A.甲醇-B.0.1%甲酸水溶液，流速為0.25 mL/min；采用梯度洗脫的方式，以體積百分比計(jì)，0 min～1 min，A：30%、B：70%；1 min～3.5 min，A：30%～95%，B：70%～5%；3.5 min～5.5 min，A：95%，B：5%；5.51 min～7.0 min，A：95%～70%，B：5%～30%。液相分離采用在線閥切換技術(shù)。進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.2質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源（ESI）；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流量（氮?dú)猓? L/min；鞘氣溫度：400℃；霧化器壓力：50 psig的條件下，進(jìn)行正離子SRM掃描。人工合成癸烯酸檢測(cè)的母離子為225 m/z，子離子包括163 m/z和181 m/z。

1.3樣品前處理

稱取樣品0.100 g（精確到0.1 mg）于25 mL容量瓶，無水乙醇溶解、定容，超聲提取30 min，過微孔濾膜待進(jìn)樣。同時(shí)配制人工10-HDA的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。（規(guī)定0.100 g人工10-HDA標(biāo)準(zhǔn)品定容于25 mL容量瓶，人工合成癸烯酸的濃度為100%）。

1.4人工10-HDA的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精確稱量0.100 g人工10-HDA標(biāo)準(zhǔn)品，用無水乙醇定容于25 mL容量瓶中，然后取該標(biāo)準(zhǔn)溶液用無水乙醇分別稀釋成0.05%、0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、2.0%和5.0%6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5樣品添加回收試驗(yàn)

對(duì)天然蜂王漿及其凍干粉添加3個(gè)濃度點(diǎn)（包括0.05%、0.5%、5.0%）的人工合成癸烯酸，每一個(gè)濃度點(diǎn)做3個(gè)平行試驗(yàn)。

2　結(jié)果與分析

我們將摻入不同比例人工合成癸烯酸標(biāo)準(zhǔn)品的陽(yáng)性樣品和天然的蜂王漿和蜂王漿凍干粉樣品均按照步驟1.3進(jìn)行前處理，然后按照步驟1.2中的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。先對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行全掃描（從100 m/z到1 000 m/z），找出全掃描圖譜的差異；然后對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行正離子SRM掃描，通過對(duì)比陽(yáng)性樣品和天然蜂王漿及其凍干粉制品的LC-MS/MS圖譜的差別，發(fā)現(xiàn)了陽(yáng)性樣品中人工合成癸烯酸的特征離子峰，該特征離子峰在天然的蜂王漿和蜂王漿凍干粉中是不存在的，特征離子峰的母離子為225 m/z，子離子包括163 m/z 和181 m/z，特征離子峰的保留時(shí)間為5.00 min；最后通過檢測(cè)該特征離子能有效的鑒別蜂王漿中是否添加入人工合成癸烯酸。該方法通過信噪比（S/N=3）計(jì)算得出該方法人工10-HDA含量的檢出限為0.001%（相當(dāng)于樣品中人工10-HDA的濃度為40 μg/L）；同時(shí)判定蜂王漿和蜂王漿凍干粉中人工10-HDA的含量＜0.1%為陰性，≥0.1%為陽(yáng)性。蜂王漿凍干粉中人工10-HDA陰、陽(yáng)性樣品色譜圖分別見圖1和圖2。

圖1 天然蜂王漿凍干粉中人工10-HDA陰性樣品色譜圖Fig.1　Chromatogram of pure royal jelly/lyophilized royal jelly sample that no synthetic 10-hydroxy-α-decanoic acid was detected

圖2 蜂王漿凍干粉中人工10-HDA陽(yáng)性樣品色譜圖Fig.2　Chromatogram of royal jelly/lyophilized royal jelly sample that adulterated with synthetic 10-hydroxy-α-decanoic acid

2.1線性范圍討論

取1.4中已配制好的人工10-HDA的標(biāo)準(zhǔn)品溶液用無水乙醇分別稀釋成0.05%、0.1%、0.2%、0.5%、1.0%、2.0%和5.0%6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)進(jìn)樣，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，以濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.223×103+7.759×105X，R2= 0.999，在該標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2精密度試驗(yàn)

選擇0.1%標(biāo)準(zhǔn)濃度點(diǎn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量為10 μL，記錄色譜峰的峰面積，計(jì)算得出RSD值為1.24%。

2.3重復(fù)性試驗(yàn)

選擇一個(gè)樣品，平均分成6份，按照1.3樣品前處理方法進(jìn)行處理，試驗(yàn)結(jié)果的RSD值為1.78%，表明本方法的重現(xiàn)性良好。

2.4加標(biāo)回收率試驗(yàn)

對(duì)天然蜂王漿及其凍干粉添加3個(gè)濃度點(diǎn)（包括0.05%、0.5%、5.0%）的人工合成癸烯酸，每一個(gè)濃度點(diǎn)做3份平行試驗(yàn)。回收率范圍在85.1%～108.3%。

2.5樣品測(cè)定

從市場(chǎng)上隨機(jī)抽取20份樣品，其中10份為蜂王漿，10份為蜂王漿凍干粉。按照步驟1.3進(jìn)行樣品前處理，每個(gè)樣品做2份平行樣，將所得峰面積代人標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計(jì)算其含量，結(jié)果見表1。

表1　市場(chǎng)中的蜂王漿和蜂王漿凍干粉樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)Table 1　Experiments data of royal jelly/lyophilized royal jelly samples collected from market

續(xù)表1　市場(chǎng)中的蜂王漿和蜂王漿凍干粉樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)Continue table 1　Experiments data of royal jelly/lyophilized royal jelly samples collected from market

從表1可以看出市場(chǎng)上的確已經(jīng)存在部分摻入了人工合成癸烯酸的蜂王漿和蜂王漿凍干粉了。

3　結(jié)論

本文針對(duì)目前市場(chǎng)上存在一些往蜂王漿和蜂王漿凍干粉中摻入人工合成癸烯酸從而牟取高額利潤(rùn)的伎倆，開發(fā)出了一種可以快速、準(zhǔn)確地對(duì)蜂王漿和蜂王漿凍干粉中的人工合成癸烯酸標(biāo)志物定性、定量的方法。該方法以高效液相色譜串聯(lián)對(duì)質(zhì)荷比為225 m/z（母離子）、163 m/z（子離子）和181 m/z（子離子）的特征檢測(cè)峰的進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)摻入了人工合成癸烯酸的蜂王漿及其凍干粉制品進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。該方法前處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短，可應(yīng)用于對(duì)蜂王漿和蜂王漿凍干粉中是否摻入了人工合成癸烯酸進(jìn)行鑒別和準(zhǔn)確定量檢測(cè)。本文提出的針對(duì)摻假食品的檢測(cè)思路創(chuàng)新性強(qiáng)。

［1］中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB 9697-2008蜂王漿［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008

［2］中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 21532-2008蜂王漿凍干粉［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008

［3］陳杰.HPLC法測(cè)定蜂王漿及蜂王漿凍干粉中的10-羥基-α-癸烯酸［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，18（6）：1077-1082

［4］王粉琴，王桂云.蜂王漿凍干粉中的10-羥基-α-癸烯酸的檢測(cè)方法研究［J］.中國(guó)蜂業(yè)，2008，59（9）：8-11

［5］ 郭小莉.高效液相色譜法測(cè)定蜂王漿中10-羥基-2-癸烯酸的含量［J］.食品研究與開發(fā)，2006，27（6）：134-135

Identification and Determination of Synthetic 10-Hydroxy-α-decanoic Acid in Adulterated Royal Jelly Products

LIU Xiu-hong1，XU Jin-zhong2
（1.Comprehensive Technology Center of Jiangsu Entry and Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanchang 330038，Jiangxi，China；2.Jiangsu Sinography Testing Co.，LTD.，Nanjing 210032，Jiangsu，China）

A new method to detect if synthetic 10-hydroxy-α-decanoic acid was added into pure royal jelly/ lyophilized royal jelly was proposed.This method was conducted by comparing the HPLC/MS/MS spectrum of pure royal jelly/lyophilized royal jelly with those of adulterated samples in order to detect the differences between both sample groups.The maker was found to be presented in royal jelly/lyophilized royal jelly samples adulterated with synthetic 10-hydroxy-α-decanoic acid while could not be detected in any of pure royal jelly/lyophilized royal jelly samples analyzed.In addition，this method is a great innovation in detecting adulterated samples and the pre-processing approch is very simple.This method allowed the detection of synthetic 10-hydroxy-α-decanoic acid in adulterated royal jelly/lyophilized royal jelly samples in concentrations as low as 40 μg/L.

HPLC-MS/MS；royal jelly；lyophilized royal jelly；10-hydroxy-α-decanoic acid

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.036

劉秀紅（1985—），女（漢），博士研究生，研究方向：食品和工業(yè)品檢測(cè)技術(shù)開發(fā)。

2015-03-31