趙娜，劉鑫，周利娟，白曉曄，王榮平，烏云達來，*（.包頭市農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督管理中心，內(nèi)蒙古包頭0400；.江蘇漢邦科技有限公司，江蘇南京005；.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，內(nèi)蒙古呼和浩特0008）

瑞士乳桿菌AJT產(chǎn)細菌素的發(fā)酵條件優(yōu)化

趙娜1，劉鑫1，周利娟2，白曉曄3，王榮平3，烏云達來3，*
（1.包頭市農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督管理中心，內(nèi)蒙古包頭014010；2.江蘇漢邦科技有限公司，江蘇南京223005；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

瑞士乳桿菌AJT是一株廣譜抗菌活性菌株，對革蘭氏陽性、革蘭氏陰性細菌和真菌均有較好的抑制作用。通過優(yōu)化試驗確定其最優(yōu)的培養(yǎng)基成分為：乳糖15.0 g/L、酵母浸出粉7.0 g/L、胰蛋白胨6.0 g/L、牛肉浸膏12.0 g/L、乙酸鈉7.0g/L、檸檬酸鈉7.0 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L、硫酸鎂200 mg/L、硫酸錳40 mg/L，吐溫-80 1.0 g/L，起始pH6.5；最佳培養(yǎng)條件：接種量2.0%，37℃培養(yǎng)20h。與未優(yōu)化發(fā)酵條件相比，粗提取的瑞士乳桿菌AJT細菌素對蠟狀芽孢桿菌的抗菌活性提高了53.8%，對黃色鐮孢的抗菌活性提高了41.5%，對大腸桿菌的抗菌活性提高了68%。

瑞士乳桿菌；細菌素；發(fā)酵條件；優(yōu)化

乳酸菌素（Bacteriocins of LAB）指由乳酸菌產(chǎn)生的具有抗菌活性的多肽或前體多肽。因其安全、無毒、抗菌性能穩(wěn)定等特性，成為防腐劑開發(fā)的熱點［1］。做為國內(nèi)外公認的人用益生乳桿菌之一，瑞士乳桿菌有較強的保健功能［2］。目前對其研究大部分集中在利用發(fā)酵特性開發(fā)乳制品及生產(chǎn)功能性多肽方面，對其細菌素研究報道相對較少。國外已報道的瑞士乳桿菌抗菌物質(zhì)有瑞士乳桿菌G51細菌素、瑞士乳桿菌素27、瑞士乳桿菌細菌素V1829、瑞士乳桿菌CNRZ450抗菌物質(zhì)和Helveticin J等，其中研究最為深入的是瑞士乳桿菌481產(chǎn)生的Helveticin J，已展開對該細菌素的編碼基因的研究［3］。國內(nèi)僅對瑞士乳桿菌細菌素HF08的研究較為深入，正在探索其抑菌有效成分和機理［4］。

經(jīng)過逐步純化的菌株AJT細菌素，對蠟狀芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌、大腸桿菌等革蘭氏陰性菌和黃色鐮孢等真菌均具有較強抑制作用，是廣譜抗菌活性細菌素［5］。本文通過單因素和正交試驗，確定了瑞士乳桿菌AJT產(chǎn)細菌素的最佳發(fā)酵條件，大大提高了細菌素的產(chǎn)量和活性，為其開發(fā)應用提供理論數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌株與培養(yǎng)基

菌株：瑞士乳桿菌AJT，從內(nèi)蒙古地區(qū)酸馬奶中分離；大腸桿菌ACCC10145、蠟狀芽孢桿菌AS1.1688、黃色鐮孢ACCC32249，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品質(zhì)量與安全實驗室保藏菌株。

培養(yǎng)基：脫脂乳培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、TPY培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、NYD培養(yǎng)基、Landy培養(yǎng)基、BPY培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，按文獻［6］方法配制。

1.2主要儀器

ZHJH-C1214C超凈工作臺：上海智城公司；PB-10 pH計：Sartorius集團；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海恒科公司；PL303電子天平：Mettler Toledo公司；CX31RTSF光學顯微鏡：OLYMPUS公司。

1.3方法

1.3.1瑞士乳桿菌AJT活化

將保存的菌株在脫脂乳培養(yǎng)基中活化2代后，MRS液體培養(yǎng)基活化3代。

1.3.2無菌上清液制備和細菌素粗提取

瑞士乳桿菌AJT接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min離心10 min，收集上清液并經(jīng)0.45 μm孔徑濾菌器濾菌，得無菌上清液。取無菌上清液200 mL，60℃濃縮20 min，至50 mL左右。用乙酸乙酯搖瓶萃取過夜后靜置6 h取上層液體濃縮干燥，甲醇抽提2次。8 000 r/min離心10 min，上清液濃縮干燥后，用滅菌蒸餾水溶解，經(jīng)0.45 μm孔徑濾菌器濾菌后即為粗提取的瑞士乳桿菌AJT細菌素。

1.3.3指示菌培養(yǎng)

將指示用細菌接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)20 h左右（藤黃微球菌30℃培養(yǎng)）；將接種于PDA斜面培養(yǎng)基的霉菌，在28℃條件下培養(yǎng)5 d～7 d。

1.3.4指示平板制備

用20 mL滅菌生理鹽水洗脫在斜面培養(yǎng)基上生長的細菌，制成OD600 nm為0.5的菌懸液，按10%體積比將菌懸液混入冷卻至55℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，搖勻后傾注平皿；用20 mL滅菌生理鹽水洗脫在PDA斜面培養(yǎng)基上生長的霉菌，制成菌懸液，按10%體積比將菌懸液混入冷卻至55℃的PDA培養(yǎng)基，傾注平皿。

1.3.5瑞士乳桿菌AJT產(chǎn)細菌素最適培養(yǎng)基的篩選

將瑞士乳桿菌AJT分別按2.0%接種量接種于1.1培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)36 h，做牛津杯抑菌試驗。

1.3.6最佳培養(yǎng)時間確定

將瑞士乳桿菌AJT按體積比2.0%接種于MRS液體培養(yǎng)基，每隔2 h測定其OD600nm和pH。以大腸桿菌為指示菌，做牛津杯法抑菌試驗，確定不同培養(yǎng)時間菌株AJT的無菌上清液的抗菌活性。

1.3.7最佳接種量確定

分別以0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%接種量（體積分數(shù)）將瑞士乳桿菌AJT接種于MRS液體培養(yǎng)基中，通過牛津杯法抑菌試驗，測定不同接種量時發(fā)酵上清液的抑菌活性。

1.3.8最佳培養(yǎng)溫度確定

將瑞士乳桿菌AJT按體積比2.0%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，分別在31、34、37、40、43℃條件下培養(yǎng)20 h，通過牛津杯法抑菌試驗，測定不同培養(yǎng)溫度下發(fā)酵上清液的抑菌活性。

1.3.9起始pH確定

用1.0 mol/L HCl和2.0 mol/L NaOH將MRS液體培養(yǎng)基起始pH分別調(diào)節(jié)至4.5、5.5、6.5、7.5、8.5。按2.0%體積比接入瑞士乳桿菌AJT后37℃培養(yǎng)20 h，取無菌上清液，做抑菌試驗。

1.3.10碳源、氮源優(yōu)化

通過API 50 CHL糖發(fā)酵試驗，發(fā)現(xiàn)菌株AJT能夠利用的糖為D-葡萄糖、D-甘露糖、D-乳糖、N-乙酰葡萄糖酰胺和D-半乳糖［7］。D-甘露糖和N-乙酰葡萄糖酰胺價格較貴，生產(chǎn)成本大，故用乳糖、半乳糖、葡萄糖做為MRS培養(yǎng)基的碳源。按20.0 g/L的添加量分別加入3種糖（其他成分不變），設置對照組。按2.0%（體積分數(shù)）接種量接入瑞士乳桿菌AJT，取培養(yǎng)20 h的無菌上清液，做牛津杯抑菌試驗。

分別以牛肉浸膏、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、大豆分離蛋白、硝酸銨和尿素作為氮源，配制MRS液體培養(yǎng)基（其他成分不變），設置對照組。按體積比2.0%接入瑞士乳桿菌AJT，培養(yǎng)20 h后取無菌上清液做抑菌試驗，確定氮源種類。

按正交試驗設計（表1）配制培養(yǎng)基，分別取上清液做抑菌試驗，確定最佳碳源、氮源種類。

1.3.11無機鹽含量確定

對培養(yǎng)基中緩沖鹽乙酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸氫二鉀配比優(yōu)化的正交試驗設計如表2。

取不同培養(yǎng)基的發(fā)酵上清液做抑菌試驗，確定乙酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸氫二鉀的最佳配比。

1.3.12金屬離子含量確定

按0、100、200、300、400、500、600、700、800mg/L的Mg2+（MgSO4）添加量配制MRS培養(yǎng)基（已優(yōu)化的成分按優(yōu)化后的量添加），2.0%（體積分數(shù)）接種量接入瑞士乳桿菌AJT，培養(yǎng)20 h后做抑菌試驗。

按 0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mg/mL分別在優(yōu)化的MRS液體培養(yǎng)基中加入Mn2+。按2.0%（體積分數(shù)）接種量接入瑞士乳桿菌AJT，培養(yǎng)20 h后做抑菌試驗。

1.3.13吐溫-80含量確定

配制不同濃度Tween-80的MRS液體培養(yǎng)基，添加量分別為0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L，起始pH6.5、37℃培養(yǎng)20 h后做抑菌試驗。

1.3.14優(yōu)化結(jié)果驗證

按優(yōu)化后配方配制MRS液體培養(yǎng)基，起始pH6.5，接種量2.0%，37℃培養(yǎng)20 h，以未優(yōu)化的MRS液體培養(yǎng)基做為對照，取無菌上清液做牛津杯法抑菌試驗。

表1C∶N優(yōu)化因素水平表Table 1　Factors and levels of carbohydrate：nitrogen source

表2　無機鹽含量優(yōu)化因素水平表Table 2　Factors and levels of inorganic salts

2　結(jié)果與分析

2.1瑞士乳桿菌AJT抗菌物質(zhì)最適培養(yǎng)基篩選

在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h的瑞士乳桿菌抗菌物質(zhì)的抑菌結(jié)果見表3。

菌株AJT在MRS、TPY、PDA、Landy和BPY培養(yǎng)基中培養(yǎng)的無菌上清液具有抗菌活性，其中MRS發(fā)酵上清液抗菌活性最強。因此確定MRS培養(yǎng)基為最適培養(yǎng)基。

表3　不同種類培養(yǎng)基對抗菌能力的影響Table 3　The influence of different medium to the bacteriocin antimicrobial activity

2.2最佳培養(yǎng)時間

瑞士乳桿菌AJT發(fā)酵上清液抗菌趨勢如圖1，培養(yǎng)20 h的發(fā)酵上清液的抗菌活性最強。

圖1 菌株AJT生長曲線及抑菌活性Fig.1　Growth and bacteriostatic activity curves of strain AJT

2.3最適接種量

接種量對抗菌能力的影響見表4。

表4 接種量對抗菌能力的影響Table 4　Effect of inoculum size on the antimicrobial activity of strain AJT

結(jié)果表明：接種量為2.0%（體積分數(shù)），培養(yǎng)時間為20 h的瑞士乳桿菌AJT細菌素的抗菌活性最強。

2.4最適培養(yǎng)溫度

培養(yǎng)溫度對對抗菌能力的影響見表5。

培養(yǎng)溫度試驗結(jié)果表明，37℃培養(yǎng)時最利于抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生，上清液抑菌圈直徑大于23.0 mm。

表5 培養(yǎng)溫度對抗菌能力的影響Table 5　Effect of culture temperature on the bacteriocin antimicrobial activity

2.5最適起始pH

培養(yǎng)基起始pH不但影響乳酸菌的生長，而且影響細菌素的產(chǎn)量和活性［8］。為確定瑞士乳桿菌AJT產(chǎn)細菌素的最佳起始pH，分別將菌株接種于不同起始pH的培養(yǎng)基中，結(jié)果表明：在pH4.5～6.5間，隨著起始pH的增加，發(fā)酵上清液抗菌活性逐漸增加，在pH6.5時活性達到最高；之后不斷下降，且在pH8.5時完全喪失抗菌活性。最終確定瑞士乳桿菌AJT產(chǎn)細菌素的起始pH為6.5。

乳酸菌生長的pH是影響細菌素抗菌能力和胞外產(chǎn)量的重要因素，不同種類的乳酸菌素所要求的起始pH不同，因此確定產(chǎn)細菌素乳酸菌最佳起始pH具有重要意義。早在1997年，已經(jīng)證明細菌素和靶細胞膜的親和力跟pH有關，如把pH從7.5降低到6.0，能夠增加細菌素PA-1與膜的結(jié)合力和滲透入細胞的能力［9］；起始pH還會影響細菌素向細胞外的分泌，如Parvez等通過實驗發(fā)現(xiàn)，將產(chǎn)Nisin的乳酸菌的生長pH調(diào)節(jié)為6.7，此時合成的Nisin就會留在細胞內(nèi)［10］。

2.6碳源、氮源優(yōu)化

與乳酸菌素產(chǎn)量關系最密切的糖類為葡萄糖和乳糖兩種，有報道稱葡萄糖對乳酸菌素的產(chǎn)生具有促進作用，如葡萄糖作為碳源能夠提高乳酸菌IO-1產(chǎn)生的Nisin Z的抗菌活力［8］，也能夠提高片球菌素AcH的抗菌效果。但有報道稱葡萄糖是乳酸菌增值的最佳碳源，乳糖是提高抗菌物質(zhì)活性和產(chǎn)量的最佳碳源［11］。本文通過對多種糖的篩選，最終發(fā)現(xiàn)以乳糖作為碳源時，能夠大幅提高菌株AJT的抗菌活力。

試驗表明在一定范圍內(nèi)，Nisin的產(chǎn)量與氮的含量成正比［12］。因此，確定培養(yǎng)基中N源的含量對乳酸菌素產(chǎn)量的提高具有重要意義。通過不同種類有機氮、無機氮對菌株AJT生長及抗菌物質(zhì)活性影響的試驗，發(fā)現(xiàn)以有機氮源酵母粉、胰蛋白胨、牛肉浸膏作為唯一N源時能夠產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，故以乳糖、酵母粉、胰蛋白胨、牛肉浸膏作為碳、氮來源并做正交試驗，結(jié)果見表6和圖2。

表6　碳源、氮源正交試驗Table 6　Results of orthogonal test of carbohydrate and nitrogen source

圖2　因素總評分和極差對比Fig.2　Total scores of factors and comparison on ranges of factors

以乳糖、酵母粉、胰蛋白胨、牛肉浸膏做碳源、氮源優(yōu)化的L16（45）試驗設計，結(jié)果如下：

1）16組正交試驗反應的結(jié)果為，第8組A2B4C3D2（乳糖15.0 g/L、酵母粉7.0 g/L、胰蛋白胨10.0 g/L、牛肉浸膏8.0 g/L）培養(yǎng)基培養(yǎng)的瑞士乳桿菌AJT，其無菌上清液的抑菌效果最好，抑菌圈直徑達到26.70 mm，第6 組A2B2C1D4和第10組A3B2C4D3培養(yǎng)的菌株AJT的抑菌效果居次位，抑菌圈直徑為25.80 mm。

2）通過因素評分對比和極差分析，發(fā)現(xiàn)碳源、氮源對菌株AJT抗菌物質(zhì)活性的影響依次為：A（乳糖）＞B（酵母粉）=C（胰蛋白胨）＞D（牛肉浸膏）。菌株AJT抗菌物質(zhì)活性最強的碳源、氮源組合為A2B4C1D4（乳糖15.0 g/L、酵母粉7.0 g/L、胰蛋白胨6.0 g/L、牛肉浸膏12.0 g/L），與16組正交試驗結(jié)果不一致。

為驗證抗菌活性最強的碳源、氮源配比，對A2B4C1D4和A2B4C3D2兩個組合進行對比試驗。發(fā)現(xiàn)最佳配比組無菌上清液的抑菌效果優(yōu)于正交試驗第8組，最終確定瑞士乳桿菌AJT抗菌物質(zhì)產(chǎn)生的最優(yōu)碳源、氮源分別為：乳糖15.0 g/L、酵母粉7.0 g/L、胰蛋白胨6.0 g/L、牛肉浸膏12.0 g/L。

2.7無機鹽含量確定

對乙酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸氫二鉀的正交優(yōu)化結(jié)果見表7和圖3。

表7　無機鹽正交試驗Table 7　Results of orthogonal test of inorganic salts

圖3　因素總評分和極差對比Fig.3　Total scores of factors and comparison on ranges of factors

由表7和圖3可知：

1）無菌上清液抑菌效果最佳的試驗組為表7的第9組試驗組合（A3B3C2），即乙酸鈉7.0 g/L、檸檬酸鈉7.0 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L。

2）因素評分和極差對比分析表明，影響菌株AJT抗菌物質(zhì)產(chǎn)生的3種無機鹽主次關系為：A（乙酸鈉）＞C（磷酸氫二鉀）＞B（檸檬酸鈉）。上清液抑菌效果最優(yōu)的緩沖鹽配比為A3B3C2，與第9組試驗一致。故菌株AJT抗菌物質(zhì)活性最強的無機鹽配比為乙酸鈉7.0 g/L、檸檬酸鈉7.0 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L。

2.8金屬離子含量確定

Mg2+和Mn2+對菌株AJT上清液抗菌活力的影響見圖4，當MgSO4添加量為200 mg/L、MnSO4添加量為40 mg/L時，最利于抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生。

圖4Mg2+、Mn2+對抗菌能力的影響Fig.4　Effect of Mg2+and Mn2+on the bacteriocin antimicrobial activity

2.9吐溫-80含量確定

不同吐溫-80含量對菌株AJT抗菌活性的影響見圖5。

圖5 吐溫-80對抗菌能力的影響Fig.5　Effect of tween-80 on the bacteriocin antimicrobial activity

含量為1.0 g/L時抗菌活性最強，之后作用不明顯，故確定吐溫-80的含量為1.0 g/L。與報道的吐溫-80能夠明顯提高一些細菌素產(chǎn)量吻合［9］。

2.10優(yōu)化結(jié)果驗證

通過對瑞士乳桿菌AJT培養(yǎng)基的優(yōu)化，結(jié)果如圖6所示。

圖6優(yōu)化結(jié)果驗證Fig.6　The result of fermentation condition optimization

粗提取的細菌素對蠟狀芽孢桿菌的抑制能力提高53.8%，對黃色鐮孢的抑制能力提高41.5%，對大腸桿菌的抑制能力提高68.0%。

3　結(jié)論

乳酸菌細菌素的產(chǎn)生與培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的種類和含量關系密切［13］，優(yōu)化培養(yǎng)基成分對乳酸菌素活性具有重要意義。本文通過對各成分的優(yōu)化，確定了菌株AJT產(chǎn)細菌素的培養(yǎng)基成分：乳糖15.0 g/L、酵母浸出粉7.0 g/L、胰蛋白胨6.0 g/L、牛肉浸膏12.0 g/L、乙酸鈉7.0 g/L、檸檬酸鈉7.0 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L、MgSO4200 mg/L、MnSO440 mg/L，吐溫-80 1.0 g/L；培養(yǎng)條件：起始pH6.5，接種量2.0%，37℃培養(yǎng)20 h。

與未優(yōu)化發(fā)酵條件相比，粗提取的瑞士乳桿菌AJT細菌素對蠟狀芽孢桿菌的抗菌活性提高53.8%，對黃色鐮孢的抗菌活性提高41.5%，對大腸桿菌的抗菌活性提高68%，由此說明，優(yōu)化試驗對菌株AJT細菌素的產(chǎn)量和活性提高具有顯著作用，對瑞士乳桿菌AJT抗菌物質(zhì)的工業(yè)化開發(fā)、應用具有重要意義。

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Optimization of Fermentation Conditions for Bacteriocin Production by Lactobacillus helveticus AJT

ZHAO Na1，LIU Xin1，ZHOU Li-juan2，BAI Xiao-ye3，WANG Rong-ping3，Wuyundalai3，*
（1.Baotou Livestock Products Quality and Security Supervisin and Management Center，Baotou 014010，Inner Mongolia，China；2.Jiangsu Hanbang Technology CO.，LTD，Nanjing 223005，Jiangsu，China；3.College of Food Science and Engineering，Inner Monglia Agricultural University，Hohhot 010018，Inner Mongolia，China）

Lactobacillus helveticus AJT is a broad antibacterial lactobacillus has strong antibacterial activity against Gram-positive，Gram-negative and fungi strains.Single factor and orthogonal tests were conducted to de termine the media for optimum antibacterial activity culture，and the optimized ingredient was：lactose 15.0 g/L，yeast extract 7.0 g/L，peptone 6.0 g/L，beef extract 12.0 g/L，sodium citrate hydrate 7.0 g/L，sodium acetate 7.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 200 mg/L，MnSO4·5H2O 40 mg/L and tween-80 1.0 g/L，with initial pH at 6.5，the optimum incubation parameters were incubated at 37℃for 20 h with 2%（volume fraction）concentration.Its antibacterial activity of the extract increased 53.8%，41.5%and 68%acting on Bacillus cereus ，F(xiàn)usarium culmorum and Escherichia coli respectively compared to the unoptimized fermentation condition.

Lactobacillus helveticus；bacteriocin；fermentation condition；optimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.043

內(nèi)蒙古自治區(qū)應用技術研發(fā)資金計劃項目（20130438）；內(nèi)蒙古自然科學基金面上項目（2014MS0358）

趙娜（1988—），女（漢），助理工程師，碩士，研究方向：農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全。
*

烏云達來（1975—），男，副教授，研究方向：益生菌研究與開發(fā)。

2015-06-06