陳熙 郭健民 元宇 張玲莉 吳雋旎 孫忠廣 陳炳霖 鄒軍

1.上海體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)科學(xué)學(xué)院，上海 200438 2.溫州醫(yī)科大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院，溫州 325035 3.上海體育學(xué)院發(fā)展規(guī)劃處，上海 200438

在人體內(nèi)，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡維持了體內(nèi)的骨量[1]。機(jī)械應(yīng)力刺激則是其平衡的重要調(diào)節(jié)因素，在骨生長和骨重建過程中發(fā)揮著重要的作用。較多的研究指出，各種機(jī)械應(yīng)力如剪切力、牽張力、壓力等都可以對(duì)骨細(xì)胞以及成骨細(xì)胞進(jìn)行刺激，并促進(jìn)成骨增殖和分化[2-4]。但是不同的應(yīng)力強(qiáng)度，頻率及刺激時(shí)間對(duì)成骨細(xì)胞的影響也不同，不適宜的牽張力則不利于成骨分化，甚至還會(huì)引起細(xì)胞凋亡[5]。另外，研究也指出，Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在骨的生長發(fā)育以及應(yīng)力影響成骨分化中具有重要作用[1, 6]。因此，本研究采用不同強(qiáng)度和時(shí)間對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械牽張干預(yù)，觀察牽張應(yīng)力對(duì)成骨細(xì)胞分化及Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，探討促進(jìn)成骨分化的適宜機(jī)械牽張應(yīng)力及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與主要試劑

Flexcell-FX5000細(xì)胞力學(xué)系統(tǒng)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，USA)；熒光定量PCR儀(ABI StepOne 7300，USA)；蛋白電泳儀、(BioRad，USA)；酶聯(lián)免疫檢測儀(BioTek，USA)；α-MEM(Hyclone，USA)；胎牛血清(FBS)(Gibco，Australia)；0.25%胰酶、青霉素、鏈霉素、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(碧云天)；抗壞血酸L、β-甘油磷酸鈉(Sigma，USA)；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒；SYBR熒光定量試劑盒(Takara，寶生物)；β-actin、Phosphor-33/37-β-catenin(cell signal technology, USA)；Wnt1、β-catenin(abcam，USA)；引物合成于上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

成骨細(xì)胞系MC3T3-E1(ATCC，CRL-2594)復(fù)蘇后采用α-MEM培養(yǎng)液(含10%FBS+100 U/ml青霉素+0.1 mg/ml鏈霉素)，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)。每3天換一次液，細(xì)胞長至70-80%融合時(shí)進(jìn)行傳代。

1.3 施加牽張應(yīng)力

生長良好的MC3T3-E1細(xì)胞，在胰酶消化后進(jìn)行重懸，調(diào)整至1×105濃度接種于Flexcell公司生產(chǎn)的底部具有彈性模的專用6孔板(BioFlex? Plate彈性膜6孔板)，正常培養(yǎng)2d后，換成含誘導(dǎo)分化劑的培養(yǎng)液(含抗壞血酸L、β-甘油磷酸鈉)后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行牽張應(yīng)力的干預(yù)(Flexcell-FX5000 tension System，USA)。分別采用3%，6%，12%的形變幅度的正弦波，0.5 Hz的頻率，牽拉時(shí)間分別為2，4，8 h，對(duì)照組細(xì)胞不進(jìn)行干預(yù)正常培養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后即刻收集細(xì)胞。每組3個(gè)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

1.4 ALP活性測定

牽張應(yīng)力干預(yù)結(jié)束后吸除孔內(nèi)培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，每孔加入的0.2% TritonX-100 2ml裂解細(xì)胞后置于4℃過夜制備樣本，按照ALP檢測試劑盒說明檢測ALP活性：每孔取10 ul細(xì)胞裂解液放入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(以加PBS的空白管做空白對(duì)照)，之后分別加入40 ul檢測緩沖液和50 ul顯色底物，混勻后于37℃孵育10 min，加入100 ul反應(yīng)終止液終止反應(yīng)。在405 nm波長下測定吸光度值(BioTek酶標(biāo)儀)，并減去空白對(duì)照管吸光度值后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 Real time-PCR分析

采用Trizol提取每孔細(xì)胞的總RNA，測定RNA濃度后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后對(duì)cDNA進(jìn)行SYBR熒光定量擴(kuò)增分別檢測骨鈣蛋白(Osteocalcin，OC)、Runx2、Osterix、Wnt1、β-catenin、DKK-1、GAPDH mRNA的表達(dá)(各基因引物設(shè)計(jì)見表1)，采用兩步法行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取均值得出Ct值，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct計(jì)算出所有指標(biāo)mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 各基因引物設(shè)計(jì)Table 1 Design of gene primers

1.6 Western blot檢測

牽拉干預(yù)結(jié)束后加4℃預(yù)冷的PBS洗3次，每孔加入100 ul的RIPA(碧云天)裂解液后用刮刀收集細(xì)胞于EP管，之后于4℃冰上裂解細(xì)胞30 min，12000 rpm 4 ℃離心10 min，提取上清液即為細(xì)胞總蛋白，采用BCA試劑盒對(duì)蛋白濃度測定并調(diào)平蛋白濃度，與SDS-PAGE上樣緩沖液(6×)按5∶1混合，100℃煮沸10 min，分裝后-20℃保存。進(jìn)行Western blot檢測時(shí)采用8% SDS-聚丙烯酰胺凝膠使蛋白分離后，以300 mA恒流電轉(zhuǎn)2 h。PVDF膜在5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，一抗于4℃孵育過夜，TBST洗三次后采用HRP結(jié)合的二抗室溫孵育2 h，TBST洗三次后采用ECL發(fā)光液于暗室顯影，并用膠片進(jìn)行掃描后保存。采用image J軟件對(duì)所有條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示， 先用雙因素方差分析強(qiáng)度和時(shí)間因素對(duì)成骨分化的作用，再采用單因素方差分析分別對(duì)時(shí)間因素和強(qiáng)度因素進(jìn)行分析，用Bonferrori法進(jìn)行組間兩兩比較。以P<0.05為具有顯著性差異。

圖2 各強(qiáng)度組不同時(shí)間牽拉干預(yù)后OC、Runx2和Osterix mRNA的相對(duì)表達(dá)Fig.2 The expression of OC.Runx2 and Osterix mRNA in different mechanical loading and duration groups.

圖3 各強(qiáng)度組不同時(shí)間牽拉干預(yù)后Wnt1、β-catenin和DKK-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)Fig.3 The expression of Wnt1, β-catenin, and DKK-1 mRNA in different mechanical loading and duration groups.

圖1 各強(qiáng)度組不同時(shí)間連續(xù)牽拉干預(yù)后ALP活性值Fig.1 ALP results in different mechanical loading and duration groups

2 結(jié)果

2.1 ALP活性

如圖1所示，3%和6%強(qiáng)度的牽拉均可以增加MC3T3細(xì)胞的ALP活性，其中6%強(qiáng)度的應(yīng)力刺激ALP活性升高的幅度更大，而12%強(qiáng)度的牽拉組的ALP活性出現(xiàn)下降的趨勢，在8 h連續(xù)干預(yù)時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在時(shí)間效應(yīng)上，3%和6%強(qiáng)度組均在4 h時(shí)ALP活性達(dá)到峰值，8 h時(shí)略有下降。

2.2 mRNA表達(dá)水平變化

如圖2所示，3%和6%強(qiáng)度的連續(xù)牽拉干預(yù)均使成骨細(xì)胞OC和Runx2的mRNA表達(dá)增加，6%強(qiáng)度增加的幅度大于3%強(qiáng)度。6%強(qiáng)度的牽拉干預(yù)還可以使Osterix mRNA的表達(dá)增加，而3%強(qiáng)度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在時(shí)間效應(yīng)上，兩組OC、Runx2和Osterix mRNA表達(dá)的峰值均在4 h時(shí)。另外12%強(qiáng)度的連續(xù)牽拉干預(yù)后Runx2和Osterix mRNA的表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而OC mRNA的表達(dá)減少了，在4-8 h的干預(yù)后減少的幅度最大。

如圖3所示，3%和6%強(qiáng)度的連續(xù)牽拉干預(yù)后，成骨細(xì)胞Wnt1和β-catenin的mRNA表達(dá)均升高，6%強(qiáng)度組的升高幅度大于3%強(qiáng)度組，且在4h時(shí)升高的幅度最大；DKK-1 mRNA的表達(dá)則降低了，6%強(qiáng)度時(shí)2 h就開始有顯著下降，而3%強(qiáng)度時(shí)則到4 h時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。12%強(qiáng)度牽拉干預(yù)后Wnt1、β-catenin 和DKK-1 mRNA的表達(dá)均無顯著性差異。

2.3 蛋白表達(dá)水平變化

如圖4所示，3%和6%強(qiáng)度的連續(xù)牽拉干預(yù)后，成骨細(xì)胞的Wnt1和β-catenin的蛋白均增加了，P-β-catenin蛋白(失活狀態(tài)的β-catenin)則出現(xiàn)下降趨勢，故β-catenin/P-β-catenin的比值顯著升高，且6%強(qiáng)度增加的幅度大于3%強(qiáng)度，4小時(shí)干預(yù)的增加幅度最大。 12%強(qiáng)度干預(yù)后，成骨細(xì)胞的Wnt1蛋白和β-catenin/P-β-catenin的比值均出現(xiàn)下降趨勢，在4 h和8 h干預(yù)后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 各強(qiáng)度組不同時(shí)間牽拉干預(yù)后Western blot代表圖和蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig.4 The protein expression and representing Western blot chart in different mechanical loading and duration groups

3 討論

在人體內(nèi)，骨對(duì)機(jī)械應(yīng)力刺激具有適應(yīng)作用，在應(yīng)力高的區(qū)域則骨形成大于骨吸收，相反在減少應(yīng)力的作用下，則會(huì)引起人體骨量的丟失，如長期臥床病人，宇航員，減肥等[7]，因此，機(jī)械力學(xué)刺激對(duì)骨代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用。較多的研究指出，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞都可以感受外界的機(jī)械應(yīng)力刺激，并做出應(yīng)答[8-10]。而機(jī)械應(yīng)力的方式、刺激強(qiáng)度大小、頻率等均會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不同的影響。近些年，國內(nèi)外采用牽張應(yīng)力對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械干預(yù)成為研究的熱點(diǎn)，故本研究采用牽張力為干預(yù)方式，采用了國際上公認(rèn)的Flexcell細(xì)胞應(yīng)力加載系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行周期性牽張應(yīng)力刺激。

本次研究發(fā)現(xiàn)，在中低強(qiáng)度(3%-6%強(qiáng)度)的應(yīng)力刺激可以促進(jìn)MC3T3細(xì)胞ALP的分泌，同時(shí)促進(jìn)OC、Runx2、Osterix mRNA的表達(dá)。ALP的是成骨細(xì)胞早期分化的標(biāo)志，OC是成骨細(xì)胞向礦化發(fā)生期分化的標(biāo)記之一，是其晚期分化的標(biāo)志，說明中低強(qiáng)度的牽張應(yīng)力刺激可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。Runx2和Osterix則是成骨細(xì)胞分化所必需的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化的過程中扮演了重要的角色[11, 12]。本次研究中，Runx2和Osterix的mRNA表達(dá)水平的升高也說明了牽張應(yīng)力有較好促進(jìn)成骨分化作用，與Zhong等人的研究結(jié)果一致[4]。

高強(qiáng)度(12%)牽張應(yīng)力刺激后MC3T3細(xì)胞的ALP分泌減少，OC mRNA表達(dá)水平下降，提示高強(qiáng)度的機(jī)械刺激不利于成骨細(xì)胞分化。Koike等對(duì)ST2細(xì)胞系進(jìn)行牽張應(yīng)力干預(yù)后也發(fā)現(xiàn)，高強(qiáng)度應(yīng)力(10%和15%)刺激后細(xì)胞的ALP活性出現(xiàn)下降趨勢[13]。Jacobs等對(duì)HOB成骨細(xì)胞系進(jìn)行10%的牽張應(yīng)力干預(yù)也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的ALP活性下降，OPG mRNA表達(dá)下降[14]，與本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。但李菲菲等的研究也發(fā)現(xiàn)，12%的牽張應(yīng)力刺激可以促進(jìn)Sao-2成骨細(xì)胞系A(chǔ)LP活性和OC mRNA的表達(dá)增加，促進(jìn)成骨分化[15]?？紤]可能是不同細(xì)胞系對(duì)應(yīng)力刺激的敏感性和耐受性不同，因此細(xì)胞適應(yīng)的生理刺激強(qiáng)度也會(huì)因細(xì)胞的不同而有所變化。

另外，有研究指出高頻率牽張應(yīng)力會(huì)使成骨細(xì)胞分化減少，故本研究采用0.5Hz的實(shí)驗(yàn)方案[16]。時(shí)間效應(yīng)上，本次研究顯示中小強(qiáng)度牽張應(yīng)力干預(yù)2h，4h時(shí)，成骨細(xì)胞的分化隨著干預(yù)時(shí)間的增加而增加，但是8h牽張干預(yù)后比起4h干預(yù)各項(xiàng)成骨分化指標(biāo)均呈現(xiàn)下降趨勢，原因可能是長時(shí)間機(jī)械應(yīng)力刺激可能會(huì)超過細(xì)胞所能承受的生理刺激范圍，有部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡甚至死亡的現(xiàn)象。而在12%強(qiáng)度牽張應(yīng)力刺激后，成骨細(xì)胞分化的各項(xiàng)指標(biāo)則隨著時(shí)間的增加下降。Koike等對(duì)ST2細(xì)胞進(jìn)行24h和48h的連續(xù)干預(yù)后也發(fā)現(xiàn)，5%、10%和15%強(qiáng)度牽張應(yīng)力均使細(xì)胞的Runx2表達(dá)減少[13]，與本次研究結(jié)果一致。

有研究指出，多個(gè)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路參與了成骨細(xì)胞分化的過程，其中經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)β-catenin的活性，在成骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化過程中發(fā)揮著極為重要的作用[1]。如穩(wěn)定表達(dá)Wnt1、Wnt3a可促進(jìn)C3H10T1/2細(xì)胞系的增殖, 并誘導(dǎo)上調(diào)成骨細(xì)胞ALP的活性[17]。Phosphor-33/37-β-catenin則是β-catenin的失活狀態(tài)，故常用β-catenin/Phosphor-33/37-β-catenin的比值來反映Wnt信號(hào)路通的激活狀態(tài)。DKK-1可以通過和Lrp5/6結(jié)合競爭性抑制Wnt蛋白，下調(diào)Wnt信號(hào)通路，從而抑制成骨細(xì)胞的增殖和分化[18]。

本研究結(jié)果顯示，3%和6%強(qiáng)度的牽拉可以促進(jìn)成骨細(xì)胞Wnt1和β-catenin mRNA的表達(dá)，并且減少DKK-1 mRNA的表達(dá)。而12%強(qiáng)度的牽拉刺激后這三項(xiàng)指標(biāo)則均無顯著性變化。提示3%和6%強(qiáng)度牽張刺激可以上調(diào)MC3T3細(xì)胞Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而12%強(qiáng)度則無該效應(yīng)，甚至DKK-1 mRNA表達(dá)水平略有上升。Wnt1蛋白表達(dá)以及β-catenin/P-β-catenin比值的結(jié)果與PCR結(jié)果相符，顯示牽張應(yīng)力刺激上調(diào)了Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，且上調(diào)的強(qiáng)度和時(shí)間效應(yīng)與成骨細(xì)胞分化的各項(xiàng)指標(biāo)相一致，提示機(jī)械應(yīng)力(牽張力)可能通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。

綜上所述，中小強(qiáng)度的牽張應(yīng)力刺激可以上調(diào)MC3T3細(xì)胞的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)細(xì)胞成骨分化，以6%強(qiáng)度，4 h干預(yù)時(shí)效果最為顯著；大強(qiáng)度(12%)或者長時(shí)間(8h)則不利于細(xì)胞成骨分化，甚至還有抑制作用。