樓　琦，盧領(lǐng)群，周冰珞，郭紅剛，李　巍，石巧娟，杜江濤，薩曉嬰

(1.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與安全性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州　310010；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，杭州　310053)

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長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植模型的建立

樓琦1，盧領(lǐng)群1，周冰珞2，郭紅剛1，李巍1，石巧娟1，杜江濤1，薩曉嬰1

(1.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與安全性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310010；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，杭州310053)

目的建立長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植模型的方法與技術(shù)。方法用改良的雙套管法行100 對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植手術(shù)，門靜脈、肝下下腔靜脈行套管吻合，而肝上上腔靜脈采用縫合法，膽管內(nèi)支架法完成膽道重建。結(jié)果在手術(shù)成熟后，供體手術(shù)時(shí)間為34.56±5.12 min，修肝及安置套管時(shí)間為15.43±2.75 min，受體手術(shù)時(shí)間為58.37±8.54 min，其中無肝期為23.66±4.47 min。手術(shù)成功率為86.67 %(術(shù)后存活6 h以上)。結(jié)論改良的雙套管法成功建立了長(zhǎng)爪沙鼠肝移植模型，通過手術(shù)技巧訓(xùn)練可提高手術(shù)成功率，延長(zhǎng)爪沙鼠存活時(shí)間。

長(zhǎng)爪沙鼠；肝移植；模型，動(dòng)物

穩(wěn)定，可靠的肝移植動(dòng)物模型是臨床肝移植和免疫耐受研究的基礎(chǔ)。只有成熟穩(wěn)定的動(dòng)物模型作為技術(shù)平臺(tái)，器官移植和免疫耐受研究才能有質(zhì)的飛躍[1]。雖然大鼠肝移植模型是目前較為常用的動(dòng)物模型，但封閉群大鼠用于該模型的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性有待進(jìn)一步提高，雖然應(yīng)用近交系大鼠造模的穩(wěn)定性有所提高，但由于資源相對(duì)匱乏，不易獲取，而且較為昂貴[2-4]。因此，進(jìn)一步尋求穩(wěn)定、易得的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝移植模型具有重要價(jià)值。

長(zhǎng)爪沙鼠又稱蒙古沙鼠(Meriones Unguieulataus, Mongolian gerbil)，分類學(xué)上屬于嚙齒目、倉(cāng)鼠科、沙鼠亞科、沙鼠屬。近年來，作為重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源，長(zhǎng)爪沙鼠在國(guó)內(nèi)的使用越來越多，其應(yīng)用領(lǐng)域也不斷擴(kuò)大，我國(guó)已將長(zhǎng)爪沙鼠的標(biāo)準(zhǔn)化及其動(dòng)物模型開發(fā)納入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物領(lǐng)域重點(diǎn)支持范疇[5-6]。目前，國(guó)內(nèi)外尚無有關(guān)長(zhǎng)爪沙鼠應(yīng)用于器官移植的報(bào)道，本文首次以長(zhǎng)爪沙鼠作為供、受體，采用經(jīng)典的Kamada “雙套管法”[7]建立長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植模型，探討長(zhǎng)爪沙鼠在器官移植中的應(yīng)用前景，為長(zhǎng)爪沙鼠的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

長(zhǎng)爪沙鼠，雄性，體重40～50 g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK (浙) 2014-0001】，實(shí)驗(yàn)過程在屏障系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室中完成(空氣潔凈度7級(jí)，換氣次數(shù)15～20次/h，溫度20～26℃，日溫差≤3℃，相對(duì)濕度40～70%)。動(dòng)物使用許可證號(hào)【SYXK(浙)2014-0008】。長(zhǎng)爪沙鼠飼喂60Co輻射滅菌的營(yíng)養(yǎng)配合飼料，飲用超濾無菌水，籠器具、墊料等均經(jīng)121℃高壓滅菌。

1.2實(shí)驗(yàn)器材

乙醚(杭州市化學(xué)試劑廠)、氯胺酮針(100 mg/2 mL,杭州市第一制藥廠)，肝素注射液(5000 U/2 mL, 杭州市第一制藥廠)，顯微手術(shù)器械(上海醫(yī)藥器械廠)，縫合線(杭州華威醫(yī)療器械有限公司)均購(gòu)自華東醫(yī)藥股份有限公司。超凈工作臺(tái)(蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司)。

1.3原位肝移植方法與步驟

1.3.1術(shù)前準(zhǔn)備

供體和受體動(dòng)物術(shù)前均禁食24 h，自由飲水。供體鼠體重接近或略小于受體鼠。供體鼠采用120 mg/kg氯胺酮腹腔注射麻醉，受體采用小劑量氯胺酮(50 mg/kg)腹腔注射加乙醚吸入聯(lián)合用藥麻醉[8]。手術(shù)在屏障系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行無菌操作。

1.3.2血管套管和膽管支架的制備

膽管支架長(zhǎng)4.0 mm，外徑1.0 mm，由硬膜外導(dǎo)管制成，兩端修成斜面。

門靜脈、肝下下腔靜脈套管由聚乙烯塑料管制成，包含2.0 mm的套管柄和套管體。套管體上刻有橫紋，以方便結(jié)扎固定。門靜脈套管內(nèi)徑為1.5 mm，外徑為 2.0 mm。肝下下腔靜脈套管內(nèi)徑為1.8 mm，外徑為2.0 mm。

1.3.3供肝切取[8-9]

肝臟暴露長(zhǎng)爪沙鼠備皮麻醉后仰臥位固定，消毒，腹部行大十字切口。止血鉗夾住劍突向頭側(cè)牽引固定，充分暴露肝臟，以生理鹽水紗布覆蓋供肝。切斷鐮狀韌帶，以8-0縫合線結(jié)扎緊貼著肝上下腔靜脈的左膈下靜脈。

處理膽管與肝門 將肝臟翻向頭側(cè)，用棉簽游離胃小彎背腹側(cè)的乳頭葉和尾狀葉，暴露膽總管，在左右肝管匯合處下1.5 mm 處剪一“V”形切口，插入膽管支架，5-0縫合線結(jié)扎固定，遠(yuǎn)端離斷膽總管。

肝周血管的處理將腸管推向左側(cè)，切斷后腹膜與右下葉間的聯(lián)系，從右腎靜脈以上水平游離肝下下腔靜脈，右腎動(dòng)脈，以8-0縫合線結(jié)扎右腎靜脈及右腎上腺靜脈。

全血肝素化及肝灌流如圖1所示，暴露腹主動(dòng)脈及其分支，從髂靜脈處穿刺，注射含100U 肝素的生理鹽水 2 mL，使全血肝素化。以頭皮針穿刺腎下端的腹主動(dòng)脈，并快速剪破左側(cè)膈肌進(jìn)胸，阻斷胸主動(dòng)脈，同時(shí)剪開胸段下腔靜脈，讓灌流液流出。供體鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈用0～4℃ 20 mL生理鹽水(含25 U/mL 肝素) 灌注，速度為2.5 mL/min，肝臟呈土黃色時(shí)即表示灌注良好。鈍性分離肝動(dòng)脈，門靜脈及其分支，用8-0縫合線結(jié)扎幽門靜脈，遠(yuǎn)端離斷，在幽門靜脈結(jié)扎線以下1.0 mm處切斷門靜脈，切斷左腎靜脈水平的肝下下腔靜脈、右腎上腺靜脈及右腎靜脈。緊貼膈肌離斷肝上下腔靜脈，取出供肝，并置于0～4℃的生理鹽水中。

圖1　供體肝臟灌注Fig.1　The donor liver perfusion

1.3.4修肝及套管的安置

修肝及套管的安置均在0～4℃的生理鹽水冰浴中進(jìn)行(圖2)。去除門靜脈及肝下下腔靜脈周圍的脂肪組織，將自制套管管柄朝下，用顯微直鑷將肝下下腔靜脈從套管中拉出(圖3)，并將血管壁外翻套于套管上，用5-0的縫合線結(jié)扎固定。同法安裝門靜脈套管。在肝上下腔靜脈兩角用8-0帶針縫合線各吊一針，作為兩點(diǎn)式縫合的支持線，完畢后置于4℃冰箱保存。

圖2　供體肝臟修整Fig.2　The donor liver adjustment

圖3　供體肝臟套管插入與固定Fig.3　The placement of cuffs and bile duct stent

1.3.5受體肝切除[8-9]

與供肝同法暴露并游離肝臟，區(qū)別在于開腹切口略小，游離肝門內(nèi)結(jié)構(gòu)時(shí)應(yīng)盡量靠近肝臟，受體內(nèi)留有足夠長(zhǎng)度的膽道與血管，分離肝下下腔靜脈時(shí)則在右腎靜脈上緣水平。具體如下：如圖4所示，腹部正中切口，用自制拉鉤暴露肝臟，向左側(cè)外移腸道并用生理鹽水紗布覆蓋。離斷鐮狀韌帶，縫扎左膈下靜脈，游離左三角韌帶，結(jié)扎離斷食管與左肝之間的交通支。同供肝方法暴露膽總管并結(jié)扎離斷，以8-0縫合線結(jié)扎肝動(dòng)脈。游離右腎靜脈平面之上的肝下下腔靜脈，遠(yuǎn)離下腔靜脈結(jié)扎右腎上腺靜脈叢。離斷右三角韌帶，游離肝上下腔靜脈，并在其后方放置一細(xì)橡皮條以備牽引。用動(dòng)脈夾先后阻斷右腎靜脈水平以上的肝下下腔靜脈以及幽門靜脈以上的門靜脈。于門靜脈分叉處注入1 mL生理鹽水將肝內(nèi)血液驅(qū)入長(zhǎng)爪沙鼠體內(nèi)。牽引肝上預(yù)留的橡皮條，用動(dòng)脈夾阻斷肝上下腔靜脈，切斷近肝的肝上下腔靜脈、門靜脈和肝下下腔靜脈，移出原肝(圖5)，密切注意后腹膜有無出血點(diǎn)。

圖4　受體肝臟切除Fig.4　The hepatectomy of receptor

圖5　受體進(jìn)入無肝期Fig.5　Receptor in no liver time

1.3.6供肝的植入

從冰水浴中取出供肝，置入上腹部，調(diào)整供肝和受體，使肝上下腔靜脈處于最佳吻合位置。利用供肝肝上下腔靜脈的2根預(yù)埋縫合線，從左到右連續(xù)縫合血管后壁再到前壁，結(jié)束吻合前用生理鹽水沖洗管腔以排出氣泡。肝上下腔靜脈吻合完成后，將肝向頭側(cè)翻起，將門靜脈動(dòng)脈夾下移至脾靜脈水平處，用生理鹽水沖凈血管腔內(nèi)的血塊和氣泡，夾住供肝門靜脈套管柄，將門靜脈套管套入受體門靜脈內(nèi)，以5-0縫合線結(jié)扎固定。同法連接肝下下腔靜脈。開放受體門靜脈及肝上上、下腔靜脈，結(jié)束無肝期(圖6)。輕拉受體膽總管，在近結(jié)扎處前剪一V形切口，將供肝膽總管支架插入受體膽總管內(nèi)，5-0縫合線結(jié)扎固定。將腸道放回原位，逐層關(guān)腹。術(shù)后保溫，單籠飼養(yǎng)，待恢復(fù)正常飲食方可合群。

圖6　受體植入供肝Fig.6　The implantation of donor liver

2　結(jié)果

預(yù)實(shí)驗(yàn)期共行長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植40例，術(shù)后存活10例，存活時(shí)間最長(zhǎng)13 h，最短45 min，無1例超過24 h。隨著操作技術(shù)的成熟，在此基礎(chǔ)上正式實(shí)驗(yàn)，共行長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植60例。手術(shù)成功52例。供體手術(shù)時(shí)間為34.56±5.12 min，修肝及安置套管時(shí)間為15.43±2.75 min，受體手術(shù)時(shí)間為58.37±8.54 min，其中無肝期為23.66±4.47 min。術(shù)后存活時(shí)間6 h～12 h為4例，12 h～24 h 為5例，24 h～2 d 為8例，2 d～ 3 d 為20例，4 d以上為15例，最長(zhǎng)存活時(shí)間為3個(gè)月。

手術(shù)中死亡原因主要為術(shù)中出血，血管吻合失敗，無肝期過長(zhǎng)等操作技術(shù)原因。術(shù)后死亡原因主要是血栓形成，術(shù)后出血，移植肝功能不良或失功，膽漏或膽道梗阻，術(shù)后感染。

3　討論

3.1長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植模型的意義

長(zhǎng)爪沙鼠由于其獨(dú)特的生理、解剖學(xué)和行為學(xué)特征，成為一種正在進(jìn)行開發(fā)并具有廣闊應(yīng)用前景的多功能實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[5]。本課題組前期研究表明長(zhǎng)爪沙鼠脂質(zhì)代謝與人類相似，連續(xù)16周高脂飼料喂養(yǎng)，長(zhǎng)爪沙鼠可發(fā)生脂肪肝系列病變最終導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生，提示長(zhǎng)爪沙鼠在肝硬化研究具有潛在價(jià)值[10-13]，該結(jié)果亦得到國(guó)內(nèi)外多篇文獻(xiàn)的證實(shí)[14-16]。本課題組近期通過外科手術(shù)聯(lián)合高脂飲食的方法，初步建立了符合終末期肝硬化特征(肝硬化，門靜脈高壓，腹水等)的長(zhǎng)爪沙鼠肝硬化模型，而肝移植是臨床上治療終末期肝硬化的根本解決辦法，因此，長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植模型的建立將為終末期肝硬化疾病的肝移植治療與觀察提供動(dòng)物模型及技術(shù)支持。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)爪沙鼠的天然免疫細(xì)胞功能和獲得性免疫系統(tǒng)活化程度均顯著低于大、小鼠[17]，而本文所建立的長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植模型將有利于觀察長(zhǎng)爪沙鼠肝移植后的免疫反應(yīng)，為長(zhǎng)爪沙鼠在器官移植中免疫學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

3.2長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植術(shù)式的選擇及改進(jìn)

小動(dòng)物肝移植模型目前最常用的手術(shù)方式有單套管法(即門靜脈行套管吻合)，雙套管法(門靜脈、肝下下腔靜脈行套管吻合和肝上上腔靜脈采用縫合法)，三套管法(門靜脈、肝下下腔靜脈、肝上上腔靜脈均用套管吻合法)[2,18-19]。單套管法主要缺點(diǎn)是無肝期及受體總體手術(shù)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，目前公認(rèn)這兩個(gè)時(shí)間的長(zhǎng)短是術(shù)后存活情況的關(guān)鍵，縮短手術(shù)期及無肝期可減輕受體血流動(dòng)力學(xué)、生化等方面的病理生理改變，減輕供肝的缺血再灌注損傷。因此，目前已經(jīng)較少采用該術(shù)式。而三套管法雖然能有效減少無肝期(較雙套管法平均縮短5～6 min)，但在該法中，肝上上腔靜脈較容易發(fā)生套管扭曲、脫落及血管通而不暢的并發(fā)癥，上述結(jié)論在我課題組針對(duì)日常工作中近200例大鼠原位肝移植模型中亦得到證實(shí)[8]。本研究在參考Kamada等“雙套管”吻合血管的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良，施行長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植手術(shù)。改進(jìn)如下：

(1)為減少長(zhǎng)爪沙鼠在手術(shù)中的死亡率，麻醉深度(尤其是受體)的掌握是關(guān)鍵。常用的乙醚開放麻醉具有簡(jiǎn)單易操作的優(yōu)點(diǎn)，但具有誘導(dǎo)期長(zhǎng)，動(dòng)物反抗激烈，不易固定的缺點(diǎn)[20]。本文中受體采用氯胺酮(50 mg/kg，腹腔注射)與乙醚(吸入)聯(lián)合用藥的方法，可有效避免上述缺點(diǎn)。術(shù)中偶爾會(huì)出現(xiàn)麻醉過深可導(dǎo)致呼吸抑制，或阻斷肝上下腔靜脈時(shí)，鉗夾膈肌過多或下拉膈肌過猛，可造成呼吸驟停，此時(shí)采用10 mL注射筒聯(lián)合胸腔按壓進(jìn)行類似人工呼吸的緊急搶救，效果理想。

(2)套管/支架的選擇應(yīng)視動(dòng)物大小、血管/膽管粗細(xì)而異?？傮w原則是套管/支架在有一定硬度的條件下越薄越好，套管的內(nèi)徑與血管外徑接近，過細(xì)或過粗都會(huì)發(fā)生回流不暢，靜脈腔張開不全，甚至發(fā)生套管扭轉(zhuǎn)、脫落。為方便結(jié)扎固定，需要加刻橫槽。我們選用硬膜外導(dǎo)管和聚乙烯管分別作為套管和支架的材料，在加熱后拉伸出不同的直徑。

(3)在血管的吻合/縫合過程中，必須要用生理鹽水沖洗管腔，可以防止血管壁粘連引起的血管狹窄，并用以排出氣泡，避免由于空氣栓塞導(dǎo)致的肝葉壞死，肝膿腫。在吻合膽管時(shí)亦應(yīng)沖洗管腔，可減少術(shù)后膽道梗阻的發(fā)生。在縫合/吻合過程中，生理鹽水的沖洗，還可使術(shù)野清晰，提高縫合/吻合的速度與質(zhì)量。

(4)在肝移植術(shù)中，由于感染引起的腎功能、呼吸功能衰竭亦是術(shù)后死亡的主要原因。因此我們?cè)谛g(shù)中十分注重?zé)o菌操作。首先，手術(shù)器械、棉簽、紗布、手術(shù)衣等均經(jīng)過高壓滅菌。不可高壓的物品如套管、膽管支架等均用戊二醛浸泡消毒；冰塊亦用無菌手術(shù)巾包裹。其次手術(shù)在屏障系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室的超凈工作臺(tái)中完成。超凈工作臺(tái)按細(xì)胞無菌培養(yǎng)的有關(guān)規(guī)范進(jìn)行環(huán)境控制。整個(gè)手術(shù)實(shí)驗(yàn)室亦定期用萬潔進(jìn)行噴霧消毒并擦拭天花板與墻面，術(shù)前用紫外燈照射。以上措施可有效減少感染的發(fā)生。

(5)長(zhǎng)爪沙鼠的肝臟極為嬌嫩，在供肝的獲取過程中的任何接觸均可造成局部微循環(huán)障礙，激活Kuffer 細(xì)胞，釋放大量的ROS及炎癥因子，最終加重肝臟的缺血再灌注損傷[21-22]。因此筆者在手術(shù)時(shí)動(dòng)作輕柔，對(duì)供肝的保護(hù)始終放在重要位置。

總之，本文初步建立了長(zhǎng)爪沙鼠原位肝移植模型。長(zhǎng)爪沙鼠相對(duì)于大鼠要小的多，因而操作更為困難，該模型要求術(shù)者具有良好的顯微外科操作技術(shù)，難度較大，初試者不易成功。本模型雖然術(shù)后長(zhǎng)期存活問題還需進(jìn)一步研究，操作方法有待進(jìn)一步改進(jìn)，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以長(zhǎng)爪沙鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，建立原位肝移植模型是具有可行性的。

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Modified orthotopic liver transplantation in gerbils

LOU Qi1, LU Ling-qun1, ZHOU Bing-luo2, GUO Hong-gang1, LI Wei1, SHI Qiao-juan1, DU Jiang-tao1, SA Xiao-ying1

(1.Experimental Animal Center, Zhejiang Academy of Medical Sciences, Zhejiang experimental animal and safety research key laboratory, Hangzhou 310013, China;2.School of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

ObjectiveTo establish the orthotopic liver transplantation model in gebils. Methods Orthotopic liver transplantation was performed in 200 gerbils with modified two-cuff techniques. The suprahepatic vena cave was anastomosed end to end using nylon suture threat, the portal vein and the infrahepatic vena were inosculated by cuff method, respectively. Biliary tract reconstruction was completed in bile duct stent law. ResultAfter paractise, donor surgery time was 34.56±5.12 min, liver repaired time was 15.43±2.75 min, surgery receptor time was 58.37±8.54 min, no liver time was the success rate (survived more than 6 hours after operation)was 23.66±4.47 min. Conclusion Orthotopic liver transplantation with modified two-cuff techniques in gerbils is a certain feasible. Improving operative techniques is of great importance in increasing successful rate and prolonging the survival time of gerbils after surgery.

Gerbils;Liver transplantation ; Models, animal

國(guó)家自然科學(xué)基金(31301933)；浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013C37012, 2013C37013, 2014C27011)。

樓琦(1982-)，男，本科，實(shí)驗(yàn)師，專業(yè)：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，E-mail:-liuqi@126.com。

薩曉嬰，E-mail: saxiaoyin@163.com。

研究報(bào)告

R-332

A

1671-7856(2016) 05-0053-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.005.008

2016-02-02