孫嘉康，周建業(yè)，唐　躍，羅富良，汪　勝，周慶亮，霍美俊

(1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 阜外醫(yī)院 國(guó)家心血管病中心 心血管疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京　100037；2.北京邁迪頂峰醫(yī)療科技有限公司，北京　101312)

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丹寧酸交聯(lián)后續(xù)處理對(duì)牛頸靜脈血管的影響

孫嘉康1，周建業(yè)1，唐躍1，羅富良1，汪勝1，周慶亮2，霍美俊2

(1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 阜外醫(yī)院 國(guó)家心血管病中心 心血管疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100037；2.北京邁迪頂峰醫(yī)療科技有限公司，北京101312)

目的觀察丹寧酸固定后續(xù)處理對(duì)改善丹寧酸交聯(lián)牛頸靜脈貯存液穩(wěn)定性，和對(duì)血管熱穩(wěn)定性、抗鈣化能力、生物力學(xué)性能及纖維結(jié)構(gòu)的影響。方法新鮮牛頸靜脈分別經(jīng)戊二醛固定(戊二醛組)、丹寧酸交聯(lián)(丹寧酸組)及丹寧酸交聯(lián)后續(xù)處理(實(shí)驗(yàn)組)，采用大鼠皮下植入模型測(cè)定鈣含量、熱皺縮溫度、斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率、以及組織病理學(xué)檢查等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果研究組所有指標(biāo)均優(yōu)于戊二醛組(P<0.05)；與丹寧酸組比較，實(shí)驗(yàn)組的貯存液顏色不再變化，熱皺縮溫度有所降低，21 d鈣含量略升、60 d鈣含量略低(P<0.01)，兩組材料力學(xué)強(qiáng)度結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，且兩組的膠原纖維和彈力纖維均保持較好的完整性。結(jié)論丹寧酸交聯(lián)后處理可提高貯存液的穩(wěn)定性，使牛頸靜脈血管的柔軟性有所恢復(fù)，同時(shí)保持了血管抗鈣化能力、組織強(qiáng)度和纖維結(jié)構(gòu)的完整性。

牛頸靜脈；丹寧酸；鈣化；生物力學(xué)

牛頸靜脈帶瓣血管因其具有天然瓣膜結(jié)構(gòu)、規(guī)格齊全、來(lái)源易得等優(yōu)點(diǎn)，是良好的心血管外科修補(bǔ)材料[1]，但由于血管壁易發(fā)生嚴(yán)重鈣化而制約了牛頸靜脈血管的廣泛應(yīng)用。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，在傳統(tǒng)戊二醛固定的基礎(chǔ)上增加丹寧酸序貫交聯(lián)可顯著提高牛頸靜脈血管的抗鈣化能力和其他理化性能[2]。但在隨后的研究中也發(fā)現(xiàn)，丹寧酸既能交聯(lián)彈力纖維，也能交聯(lián)膠原纖維，在增加組織強(qiáng)度的同時(shí)也帶來(lái)了血管變硬、順應(yīng)性變差、手術(shù)操作性能下降的問(wèn)題。此外，丹寧酸溶液是多元醇和多元酚的混合物，組成成分和化學(xué)反應(yīng)復(fù)雜，容易發(fā)生自聚合反應(yīng)，放置在丹寧酸溶液里的牛頸靜脈會(huì)持續(xù)變硬，溶液顏色也持續(xù)變深。因此，如何解決血管的血管順應(yīng)性下降，和改善貯存液穩(wěn)定性的問(wèn)題，是本文的研究目標(biāo)。本研究在丹寧酸序貫交聯(lián)的基礎(chǔ)上再增加漂洗及更換貯存液的后繼處理，并評(píng)價(jià)了該處理對(duì)牛頸靜脈血管抗鈣化性能、生物力學(xué)性能和纖維結(jié)構(gòu)的影響。

1　材料和方法

1.1樣品采集及分組處理

取新鮮牛頸靜脈，去除血管表面脂肪，分為3組。戊二醛固定為對(duì)照組(戊二醛組): 用0.6%戊二醛于4℃固定2 d，再于0.3%戊二醛溶液中處理7 d以上，長(zhǎng)期保存?zhèn)溆茫坏幩峤宦?lián)組(丹寧酸組)，在戊二醛固定組基礎(chǔ)上，用0.3%丹寧酸于4℃避光處理4 d以上，長(zhǎng)期保存?zhèn)溆?；丹寧酸后處理組(實(shí)驗(yàn)組):丹寧酸交聯(lián)基礎(chǔ)上，用0.3%戊二醛溶液4℃振蕩漂洗10次，每次8 h，最后于0.3%戊二醛中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2貯存液穩(wěn)定性觀察

分別取丹寧酸組交聯(lián)完成后最小包裝一瓶(含一根牛頸靜脈血管和50 mL溶液)、實(shí)驗(yàn)組處理完成后最小包裝一瓶，4℃避光保存30 d，取出靜脈血管，比較顏色改變情況。

1.3熱皺縮溫度測(cè)定

將5×40 mm長(zhǎng)方形血管片掛于皮革溫度收縮測(cè)定儀測(cè)試架(MSW-YD4，陜西科技大學(xué))的上、下掛鉤之間，以純化水作為加熱介質(zhì)，測(cè)量待測(cè)樣品的熱皺縮溫度。

1.4周向斷裂拉伸力

在牛頸靜脈血管上避開(kāi)瓣膜竇部分，取長(zhǎng)度為30 mm±0.5 mm的血管為樣品，保持血管完整形態(tài)橫向固定于電子萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)(WDW-1，上海松頓機(jī)械設(shè)備有限公司)，設(shè)定拉伸速度100 mm/min，記錄血管斷裂時(shí)拉力及斷裂拉伸率。

1.5軸向拉伸斷裂力

取長(zhǎng)度為50 mm±0.5 mm的血管為樣品，保持血管完整形態(tài)縱向固定于電子萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)(WDW-1，上海松頓機(jī)械設(shè)備有限公司)，夾具間距50 mm，拉伸速度100 mm/min，記錄血管斷裂時(shí)拉力及斷裂拉伸率。

1.6大鼠皮下植入模型的鈣含量測(cè)定

1.6.1大鼠皮下埋植模型

30只SPF級(jí)SD雄性大鼠，21 d(70～80 g)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供【SCXK(京)2015-0001】。無(wú)菌手術(shù)在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行【SYXK(京)2013-0025】。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與倫理審查委員會(huì)”討論同意使用。

1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，SD大鼠俯臥位固定，背部正中切口，在皮下植入分別經(jīng)過(guò)戊二醛組、丹寧酸組和實(shí)驗(yàn)組的牛頸靜脈血管片各1片，隨后縫合皮膚切口，并消毒。每個(gè)植入片為1 cm×1 cm，植入前用無(wú)菌生理鹽水清洗3次，每次2 min，每次生理鹽水用量為500 mL。

術(shù)后大鼠隨機(jī)分為2組，分別于術(shù)后21 d和60 d采用吸入CO2的方法處死大鼠，取出植入血管片，去除表面的宿主組織，生理鹽水沖洗備用。

1.6.2鈣含量測(cè)定

將樣品經(jīng)恒溫烘箱80℃干燥48 h至衡重，稱(chēng)重并記錄，隨后用優(yōu)級(jí)純HNO31 mL，低溫加熱至樣品溶解，并繼續(xù)加熱至溶液近干，用去離子水定容至20 mL 容量瓶中待測(cè)。檢測(cè)使用儀器為電感耦合等離子體光譜儀(icap 6300，Thermo)。用鈣標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1000 μg，購(gòu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。隨后將樣品注入檢測(cè)儀器，計(jì)算鈣含量。計(jì)算公式 元素含量(μg/g)=(A-A0)*V/m，其中A為樣品溶液中待測(cè)元素濃度值，單位μg/mL；A0為樣品空白溶液中待測(cè)元素濃度值，單位μg/mL；V為樣品定容體積，單位mL；m為樣品質(zhì)量，單位g。

1.7組織病理學(xué)觀察

皮下植入后血管片標(biāo)本石蠟包埋、切片、酒精梯度脫水后分別做Masson染色和ET+VG染色，蔡司光學(xué)顯微鏡下觀察照相。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

注：(A)為丹寧酸處理組；(B)為實(shí)驗(yàn)組。圖1　貯存液顏色Note：(A) TA group;(B) Study group.Fig.1　Color of storage solution

2　結(jié)果

2.1貯存液變色情況

由圖1可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組顏色保持不變，表明貯存液已趨于穩(wěn)定。

2.2熱皺縮溫度

表1所示，實(shí)驗(yàn)組熱皺縮溫度低于丹寧酸組，戊二醛組熱皺縮溫度最低，3組間差異具有顯著性(P<0.01)。說(shuō)明后續(xù)處理會(huì)影響牛頸靜脈血管的熱穩(wěn)定性，但仍?xún)?yōu)于戊二醛組。

表1　熱皺縮溫度

2.3周向/軸向拉伸斷裂力

根據(jù)表2所示結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組與戊二醛組比較，實(shí)驗(yàn)組周向/軸向拉伸斷裂力均優(yōu)于戊二醛組(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組與丹寧酸組比較，周向/軸向拉伸斷裂力無(wú)差異(P>0.05)。

2.4大鼠皮下埋植血管片鈣含量

表3所示，實(shí)驗(yàn)組、丹寧酸組鈣含量各時(shí)間點(diǎn)均優(yōu)于戊二醛組(P<0.01)；與丹寧酸組比較，實(shí)驗(yàn)組21d鈣含量略升、60d鈣含量略低(P<0.01)。

2.5組織病理學(xué)觀察

由圖2可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組與丹寧酸組比較，彈力纖維結(jié)構(gòu)基本保持完整，未見(jiàn)明顯變化。圖中箭頭指處藍(lán)紫色為彈力纖維，戊二醛組的彈力纖維斷裂、排列雜亂，60 d組尤其明顯(B)；丹寧酸組和實(shí)驗(yàn)組兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的彈力纖維的基本保存完好，明顯好于戊二醛組。提示后續(xù)的處理手段并未削弱丹寧酸對(duì)牛頸靜脈管壁膠原纖維與彈力纖維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定作用。

圖3中箭頭指處紅色為膠原纖維，3組在植入21 d時(shí)，膠原纖維基本保持原有結(jié)構(gòu)；植入60 d時(shí)，戊二醛組膠原纖維斷裂(B)，而其他兩組膠原纖維仍保持較好的完整性。

表2　周向/軸向拉伸斷裂力

表3　大鼠皮下埋植血管片鈣含量

3　討論

人工帶瓣血管是肺動(dòng)脈閉鎖、永存動(dòng)脈干、大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位等外科矯治手術(shù)中重建右室流出道不可缺少的修補(bǔ)材料[3]。目前臨床中廣泛使用戊二醛固定的異種生物材料，雖然生物力學(xué)性能達(dá)到要求[4]，但遠(yuǎn)期鈣化問(wèn)題始終無(wú)法解決，這是以Contegra為代表的商業(yè)化牛頸靜脈帶瓣管道不能回避的待解問(wèn)題[5]。因此，近年來(lái)學(xué)者們聚焦于新型交聯(lián)方法的探索，例如使用原花青素等改性方法，得到了比較滿(mǎn)意的結(jié)果[6-8]。

本課題組前期的研究證明，在戊二醛固定的牛頸靜脈帶瓣血管的基礎(chǔ)上再經(jīng)過(guò)丹寧酸交聯(lián)處理，牛頸靜脈的生物力學(xué)強(qiáng)度及抗鈣化能力得到顯著改善[2]。這是由于戊二醛僅能交聯(lián)固定膠原纖維，而丹寧酸不僅能交聯(lián)膠原纖維，還能交聯(lián)彈力纖維[9-10]。在血管類(lèi)富含彈力纖維的生物材料中，彈力纖維斷裂、衰敗引起的炎性反應(yīng)和成骨過(guò)程，誘發(fā)了鈣結(jié)晶的形成[11-12]，是容易發(fā)生嚴(yán)重鈣化的主要原因，丹寧酸對(duì)彈力纖維的交聯(lián)作用，減少了彈力纖維斷裂的發(fā)生，從而減輕了牛頸靜脈的鈣化程度。

雖然丹寧酸序貫交聯(lián)使牛頸靜脈血管抗鈣化能力和力學(xué)強(qiáng)度得到顯著提高，但在進(jìn)行大動(dòng)物植入實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)丹寧酸交聯(lián)后的血管較硬、順應(yīng)性變差，手術(shù)操作性能下降；另外發(fā)現(xiàn)，丹寧酸交聯(lián)后，隨著保存時(shí)間延長(zhǎng)血管材料持續(xù)變硬，同時(shí)貯存液顏色持續(xù)變深。雖然具體原因不明，但我們推測(cè)可能有兩個(gè)原因：一是交聯(lián)處理完成時(shí)組織中殘留有未反應(yīng)的丹寧酸，二是丹寧酸成分復(fù)雜，在酸性環(huán)境下會(huì)持續(xù)發(fā)生自體聚合反應(yīng)[13]，而且丹寧酸主要通過(guò)氫鍵與彈力纖維等結(jié)合[14-15]，鍵能較低，不夠穩(wěn)定。因此，我們計(jì)劃采用多次漂洗的方法去除多余的丹寧酸，再將血管貯存到偏堿性的0.3%戊二醛溶液中，希望能遏制多余的聚合反應(yīng)，保持貯存液的穩(wěn)定性。

經(jīng)過(guò)上述的后處理措施，可以直觀地觀察到貯存液顏色不再變深，表明貯存液趨于穩(wěn)定。同時(shí)發(fā)現(xiàn)后處理組的血管變軟，血管順應(yīng)性和大動(dòng)物植入手術(shù)的操作性能提升明顯，雖然沒(méi)有合適的方法進(jìn)行量化的測(cè)定，但血管材料變軟確實(shí)是客觀存在。這一現(xiàn)象也可以從熱皺縮溫度的降低得到證實(shí)，熱皺縮溫度反映組織材料中的鍵合程度，后處理步驟使熱皺縮溫度降低了2℃，表明血管組織中的鍵合程度有所降低，材料變軟有合理的解釋。

后續(xù)處理在改善了血管材料的柔順性的同時(shí)，保持了組織強(qiáng)度不減弱，無(wú)論是軸向還是周向的斷裂拉力和斷裂伸長(zhǎng)率都沒(méi)有顯著變化。而對(duì)于丹寧酸處理帶來(lái)的優(yōu)異的抗鈣化性能也得到了很好的保持，雖然丹寧酸組和實(shí)驗(yàn)組鈣含量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上表現(xiàn)為有差異，但相對(duì)于戊二醛50 mg/g和150 mg/g的量級(jí)而言，相差1 mg/g是沒(méi)有實(shí)際意義的，因此我們認(rèn)為后處理步驟維持了丹寧酸的抗鈣化性能。病理學(xué)觀察也表明后處理并未破壞血管的彈力纖維和膠原纖維結(jié)構(gòu)的完整性。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)丹寧酸處理的牛頸靜脈帶瓣血管進(jìn)行多次漂洗和更換貯存液的后處理，改善了貯存液穩(wěn)定穩(wěn)定性，提高了血管順應(yīng)性和手術(shù)操作性能，同時(shí)保持了血管材料的抗鈣化性能、力學(xué)強(qiáng)度和纖維結(jié)構(gòu)的完整性。而丹寧酸交聯(lián)反應(yīng)和自體聚合的具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

注：(A)和(B)為戊二醛組，分別埋植21 d和60 d；(C)和(D)為丹寧酸組，分別埋植21 d和60 d；(E)和(F)為實(shí)驗(yàn)組組，分別埋植21 d和60 d。圖2　牛頸靜脈植入大鼠皮下后血管片的彈力纖維情況(ET+VG染色，×20) Note：(A) 21-days’ Glut group (B) 60-days’ Glut group; (C) 21-days’ TA group (D) 60-days’TA group; (E) 21-days’ Study group (F) 60-days’Study group.Fig.2　Vascular elastic fiber after implanting BJVs subcutaneously into the rat (ET + VG,× 20)

注：(A)和(B)為戊二醛組，分別埋植21 d和60 d；(C)和(D)為丹寧酸組，分別埋植21 d和60 d；(E)和(F)為實(shí)驗(yàn)組，分別埋植21 d和60 d。圖3　牛頸靜脈植入大鼠皮下后血管片的膠原纖維情況(Masson染色，×20)Note：(A) 21-days’ Glut group (B) 60-days’ Glut group; (C) 21-days’ TA group (D) 60-days’TA group;(E) 21-days’ Study group (F) 60-days’Study group.Fig.3　Vascular collagenous fiber after implanting BJVs subcutaneously into the rat (Masson,× 20)

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Effect of post-treatment on tannic acid fixed bovine jugular vein

SUN Jia-kang1, ZHOU Jian-ye1, TANG Yue1, LUO Fu-liang1, WANG Sheng1,ZHOU Qing-liang2, HUO Mei-jun2

(1.State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 10037, China;2. Beijing Med Zenith Medical Scientific Co..Ltd, Beijing 101312, China)

ObjectiveTo investigate effects of post-treatment on stability of storage solution/ thermostability， anti-calcification, the biomechanics and fibred structures of tannic acid fixed bovine jugular vein(BJV). Methods Fresh bovine jugular vein were treated with glutaraldehyde (Glut group), tannic acid (TA group), and post-treatment on TA-fixed (Study group). Calcium level was measured by implanting BJVs subcutaneously into the rats. The shrinkage temperature, tensile strength，elongation at break and histological changes were evaluated as well. Results Compared with Glut group，all results were better in Study group (P<0.05). Compared with TA group, in the Study group, color of storage solution did not change, shrinkage temperature and 60-days’ calcium level decreased, 21-days’ calcium level increased (P<0.01); biomechanical properties were not statistics difference between TA group and Study group(P> 0.05), and collagen fibers and elastic fibers were maintained well in TA group and Study group. Conclusion Post-treatment on TA-fixed Bovine Jugular Vein can improve stability of storage solution and BJVs elasticity, and do not change anti-calcification, biomechanical properties and fibred structures of TA-fixed BJVs.

Bovine jugular vein；Tannic acid；Calcification；Biomechanics

孫嘉康(1983-)，男，碩士生，助理研究員，主要從事生物材料研究。

周建業(yè)(1966-)，男，碩士，研究員,碩士生導(dǎo)師，主要從事生物材料和人工器官研究，E-mail：zhoujy@263.net。

研究報(bào)告

R318.0R-332

A

1671-7856(2016) 06-0087-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.005.014

2016-04-26