孔祥鵬　劉志華　劉雪峰　刁桂萍

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

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棘孢木霉ACCC30536葡聚糖酶基因的克隆及表達1)

孔祥鵬劉志華劉雪峰刁桂萍

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

摘要以棘孢木霉(Trichoderma asperellum)ACCC30536菌株為試材，采用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)克隆獲得葡聚糖酶GH71基因的全長cDNA序列。結(jié)果表明：此基因的cDNA 編碼區(qū)序列全長1 296 bp，編碼區(qū)可編碼431個氨基酸。經(jīng)BlastP相似性分析，其屬于GH99～GH71超家族，與深綠木霉(T. atroviride)氨基酸序列XP_013941146的同源性最高，達到94%。7種不同誘導(dǎo)條件下，GH71基因的表達量變化明顯。在2種病原菌細胞壁的誘導(dǎo)下，GH71基因的表達均呈先上升后下降又上升的趨勢，在培養(yǎng)的12 h時達到最大值，分別為未誘導(dǎo)時的24.3倍和23.9倍。而在這2種病原菌發(fā)酵液的誘導(dǎo)下，GH71基因的表達均呈先下降后上升的趨勢。在山新楊莖與葉的誘導(dǎo)下，GH71基因的表達量在24 h最大，分別為未誘導(dǎo)的25.4倍和25.2倍；在山新楊根的誘導(dǎo)下，GH71基因的表達量在48 h達到最大，是未誘導(dǎo)的28.1倍。

關(guān)鍵詞棘孢木霉；葡聚糖酶；誘導(dǎo)表達

木霉菌(Trichodermaspp.)因其能抑制多種病原真菌、促進植物生長、誘導(dǎo)其免疫能力，且兼具降解土壤中鹽類化合物、農(nóng)藥殘留物及重金屬離子等功能，而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)中[1-2]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌中含有種類豐富的葡聚糖酶，包括α-1,3葡聚糖酶、β-1,3葡聚糖酶和β-1,6葡聚糖酶[3]。這些葡聚糖酶是木霉產(chǎn)生的非常重要的抑菌蛋白之一，它們通過與其它酶類或是抗生素的協(xié)同作用起到抑菌的功效。有研究表明，綠色木霉(Trichoderma virens)中的β-1,3葡聚糖酶TvBgn2和β-1,6葡聚糖酶TvBgn3，能提高木霉對多種病原真菌的拮抗能力[4-5]。哈茨木霉(T. harzianum)CECT2413中的β-1,6葡聚糖酶，能降解病原真菌細胞壁，在其重寄生于病原真菌的過程中起重要作用[6]。棘孢木霉(T. asperellum)和哈茨木霉中的β-1,3葡聚糖酶，也被證明在木霉寄生病原真菌的過程中起作用[7]。而關(guān)于α-1,3葡聚糖酶在木霉菌行使生防功能過程中所起的作用，尚不明確。本研究采用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)，獲得了棘孢木霉ACCC30536中葡聚糖酶GH71基因的cDNA全長；并研究了7種不同誘導(dǎo)條件下葡聚糖酶基因GH71的表達情況，可為今后進一步研究棘孢木霉中葡聚糖酶的生防功能、利用木霉菌開發(fā)更有效的生防制劑提供參考。

1材料與方法

棘孢木霉ACCC30536菌株購于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；引物由上海生工生物有限公司合成。

對已構(gòu)建的棘孢木霉ACCC30536菌株轉(zhuǎn)錄組基因序列進行生物信息學(xué)分析，獲得棘孢木霉葡聚糖酶GH71基因的全長cDNA序列。

用ORFfounder確定棘孢木霉葡聚糖酶GH71基因的開放讀碼框；通過BlastP預(yù)測保守區(qū)，尋找相似性序列；通過ClustalW軟件進行多序列比對；使用MEGA5.0軟件構(gòu)建進化樹；用SignalP4.1預(yù)測蛋白質(zhì)信號肽；使用ExPASy-ProtParam軟件分析蛋白質(zhì)的等電點和相對分子質(zhì)量等信息；用ProtScale預(yù)測蛋白疏水性。

培養(yǎng)基：楊樹病原菌發(fā)酵液誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(去除葡萄糖)+10%楊樹爛皮病病原菌發(fā)酵液(或楊樹葉枯病病原菌發(fā)酵液)；楊樹病原菌細胞壁誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(去除葡萄糖)+1%楊樹爛皮病病原菌細胞壁(或楊樹葉枯病病原菌細胞壁)；山新楊根粉誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(去除葡萄糖)+1%山新楊根粉；山新楊莖粉誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(去除葡萄糖)+1%山新楊莖粉；山新楊葉粉誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(去除葡萄糖)+1%山新楊葉粉。

將棘孢木霉ACCC30536接種于1/2PDA斜面培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)5d后收集孢子，并用血球計數(shù)板計數(shù)。將106個/mL棘孢木霉孢子接種于180mL1/4PD培養(yǎng)基中，28 ℃、200r/min培養(yǎng)24h后，將菌絲體轉(zhuǎn)接入上述7種培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別于0、12、24、48、72h收集菌絲體(重復(fù)3次)。

對收集的不同誘導(dǎo)條件下的菌絲體進行總RNA提取和消化DNA。以消化后的RNA為模板，用大連寶生物公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以稀釋10倍后的不同cDNA為模板，用4組引物(見表1)進行RT-qPCR，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30s，95 ℃ 5s，59 ℃ 15s，72 ℃ 10s，81 ℃讀板1s，45個循環(huán)。采用2-ΔΔCt計算法[8]對數(shù)據(jù)進行分析處理。

表1　RT-qPCR引物

2結(jié)果與分析

2.1棘孢木霉葡聚糖酶基因全長cDNA獲得及序列分析

從棘孢木霉ACCC30536菌株克隆得到葡聚糖酶基因的cDNA序列，全長1 296bp，編碼區(qū)可編碼431氨基酸。ProtParam預(yù)測表明，該蛋白的相對分子質(zhì)量為47 190，理論等電點為5.18。通過BlastP對葡聚糖酶基因編碼的氨基酸序列進行保守區(qū)預(yù)測(見圖1)，該蛋白屬于GH99～GH71超家族。采用SignalP軟件對GH71蛋白進行信號肽分析(見圖2)，該蛋白在23位與24位氨基酸之間含信號肽，信號肽剪切位點是TFA-DE，說明該蛋白是分泌到細胞外起作用。通過ProtScale軟件對葡聚糖酶進行疏水性分析(見圖3)，氨基酸殘基的疏水性(正值表明疏水，負值表明親水)平均值為-0.114，表明該蛋白具有親水性。

圖1　葡聚糖酶的保守區(qū)域預(yù)測

所標示位置為信號肽剪切位點。

通過NCBI的BlastP對GH71基因進行同源性搜索，在GenBank的數(shù)據(jù)庫中與棘孢木霉葡聚糖酶基因GH71的氨基酸序列匹配的序列共有104個，同源性為41%～94%，與深綠木霉(T. atroviride)氨基酸序列XP_013941146的同源性最高，達到94%。選取與GH71基因的氨基酸序列相似性較高的6個木霉屬葡聚糖酶氨基酸序列，用ClustalW進行多序列比對(見圖4)，該蛋白酶包含2個功能域：羧基端多糖結(jié)合域、氨基端催化域。

圖3　葡聚糖酶GH71的疏水性分析

KUE94741為蓋姆斯木霉(Trichoderma gamsii)；XP_013941146為深綠木霉(Trichoderma atrovirideIMI206040)；ETS03510為里氏木霉(Trichoderma reeseiRUTC-30)；XP_006964349為里氏木霉(Trichoderma reeseiQM6a)；XP_013956802為綠色木霉(Trichoderma virensGv29-8)；KKO98433為哈茨木霉(Trichoderma harzianum)。

圖4不同葡聚糖酶氨基酸序列多序列比對

將棘孢木霉ACCC30536葡聚糖酶基因GH71的氨基酸序列，與其它6種來源于木霉屬的氨基酸序列用MEGA5.0進行進化樹分析(見圖5)，棘孢木霉ACCC30536葡聚糖酶GH71氨基酸序列與來源于深綠木霉的葡聚糖酶(XP_013941146)氨基酸序列的親緣關(guān)系近(BranchⅠ)。

2.2棘孢木霉GH71基因的誘導(dǎo)表達

由表2可見：在楊樹爛皮病與楊樹葉枯病2種病原菌細胞壁的誘導(dǎo)下，棘孢木霉葡聚糖酶基因GH71的表達呈先上升后下降又上升的趨勢，均是在培養(yǎng)的12h時達到最大值，分別為未誘導(dǎo)時的24.3倍、23.9倍。在楊樹爛皮病病原菌發(fā)酵液的誘導(dǎo)下，該基因在培養(yǎng)的72h內(nèi)均呈先下降后上升的表達趨勢，在培養(yǎng)的72h，GH71的表達量最大，為未誘導(dǎo)時的24.9倍。在楊樹葉枯病病原菌發(fā)酵液的誘導(dǎo)下，GH71的表達也呈先下降后上升的趨勢，在培養(yǎng)的24h時GH71的表達量最低；而在誘導(dǎo)72h時表達量最高，為未誘導(dǎo)時的22.8。在山新楊根、莖、葉的誘導(dǎo)下，GH71的表達為先上升后下降的趨勢，其中：在山新楊莖與葉的誘導(dǎo)下，GH71的表達量在24h最大，分別為未誘導(dǎo)的25.4倍、25.2倍；而在山新楊根的誘導(dǎo)下，GH71的表達量在48h達到最大，是未誘導(dǎo)的28.1倍。

3結(jié)論與討論

本研究克隆了棘孢木霉ACCC30536菌株中葡聚糖酶GH71基因的全長cDNA序列，全長為1 296bp，可編碼431個氨基酸，合成的蛋白相對分子質(zhì)量為47 190，理論等電點為5.18。通過預(yù)測得知，該蛋白屬于GH99～GH71超家族。有研究顯示，拮抗菌可通過分泌葡聚糖酶分解病原菌細胞壁來抑制其生長[9]。本試驗在棘孢木霉與病原真菌互作過程中發(fā)現(xiàn)，在楊樹爛皮病和楊樹葉枯病2種病原菌細胞壁的誘導(dǎo)前期，棘孢木霉中的葡聚糖酶基因GH71上調(diào)表達，說明該基因在木霉與病原真菌互作過程中起到分解病原菌細胞壁的作用。在病原菌發(fā)酵液誘導(dǎo)前期，棘孢木霉葡聚糖酶基因GH71的表達量減少，但隨著誘導(dǎo)時間的加長，GH71表達量開始上升；這表明，棘孢木霉GH71基因不僅能在木霉分解病原真菌細胞壁的過程中起作用，還能幫助木霉抵御病原真菌發(fā)酵液的毒害。此外，在棘孢木霉與楊樹根、莖、葉互作的試驗中，顯示GH71基因均呈上調(diào)表達的趨勢。以上結(jié)果說明，棘孢木霉ACCC30536菌株不僅能與楊樹病原菌互作，也能與楊樹進行互作，并且在互作過程中GH71基因可上調(diào)表達。本研究結(jié)果，可為今后進一步利用葡聚糖酶進行楊樹及木本植物病害防治提供參考。

節(jié)點旁數(shù)字代表1000個重復(fù)中引導(dǎo)支持百分比；比例尺0.2代表20%的氨基酸是不同的；Branch I、Branch II、Branch Ⅲ代表不同的分支。

誘導(dǎo)培養(yǎng)棘孢木霉葡聚糖酶基因GH71的相對表達水平處理12h處理24h處理48h處理72h楊樹爛皮病病原菌發(fā)酵液-1.786±0.012-1.536±0.0330.491±0.1034.719±0.071楊樹葉枯病病原菌發(fā)酵液-0.109±0.241-1.633±0.1531.704±0.0252.794±0.047楊樹爛皮病病原菌細胞壁4.359±0.1582.324±0.0721.726±0.0182.587±0.049楊樹葉枯病病原菌細胞壁3.867±0.0490.631±0.1501.638±0.2464.262±0.052山新楊葉粉4.156±0.2425.240±0.0842.972±0.0503.283±0.036山新楊莖粉3.410±0.0135.487±0.0903.037±0.1262.342±0.047山新楊粉根5.120±0.1717.167±0.0408.108±0.1134.793±0.029

注：表中數(shù)據(jù)為“平均值±標準差”。

參考文獻

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第一作者簡介：孔祥鵬，男，1990年11月生，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。E-mail：656790783@qq.com。 通信作者：刁桂萍，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，副教授。E-mail：dgp2003@126.com。

收稿日期：2016年5月12日。

分類號Q933

CloningandDifferentialExpressionofAGlucanaseGenefromTrichoderma asperellumACCC30536//

KongXiangpeng,LiuZhihua,LiuXuefeng,DiaoGuiping

(NortheastForestryUniversity,Harbin150040,P.R.China)//JournalofNortheastForestryUniversity，2016,44(8)：108-111.

WeclonedandisolatedthecDNAofglucanase(GH71)genefromTrichoderma asperellumACCC30536.ThecDNAsequenceofGH71was1 296bpinlength,encoding431aminoacids.BlastPsearchindicatedthatGH71belongedtoGH99-GH71-likesuperfamilyanditshowedthehighestsimilarity94%withaproteinofT. atroviride (XP_013941146).Moreover, GH71wasproventobedifferentiallytranscribedundersevendifferenttreatments. GH71transcriptswereup-regulatedintheconditionsofinducingboth1% Alternaria alternatacellwalland1%Cytsporachrysospermacellwallwithpeaktranscriptionlevelsof24.3and23.9timesat12h,respectively.Whileundertheconditionsof10% A. alternatafermentationliquidandC. chrysospermafermentationliquid,thetranscriptsofGH71weredown-regulatedatfirstandthenup-regulated. GH71transcriptionwasup-regulatedby1%leafandstempowderofPopulus dividiana×P. bolleanawithpeaktranscriptionlevelsof25.4and25.2timesat24h,respectively.ThetranscriptofGH71wasalsoup-regulatedby1%rootofPopulus dividiana×P. bolleana,withpeaktranscriptionlevelsof28.1timesat48h.

KeywordsTrichoderma asperellum； Gluncanase； Differential expression

1)中央高?；A(chǔ)科研業(yè)務(wù)費專項資金項目(2572014BA08)；中國博士后科學(xué)基金面上項目(20110491014)；哈爾濱市青年科技創(chuàng)新人才項目(2013RFQXJ02)。

責(zé)任編輯：張玉。