刁桂萍　李松陽(yáng)　王志英

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

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深綠木霉1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶基因的克隆及表達(dá)1)

刁桂萍李松陽(yáng)王志英

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

摘要以深綠木霉(Trichoderma atroviride)ACCC30153為試材，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)克隆獲得1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶ACCD基因的cDNA全長(zhǎng)。結(jié)果表明：此基因的cDNA編碼區(qū)序列全長(zhǎng)1 083 bp，編碼區(qū)可編碼360個(gè)氨基酸。經(jīng)BlastP相似性分析，其屬于Try-synth-beta-Ⅱ家族，與里氏木霉(T. reesei)氨基酸序列XP-006967764的同源性最高，達(dá)到91%。在5種不同誘導(dǎo)條件下，ACCD基因的表達(dá)量均有明顯變化。在C、N饑餓培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)8 h與16 h時(shí)，ACCD基因表達(dá)量達(dá)到最大值，為未誘導(dǎo)時(shí)的22.7倍與22.4倍；在山新楊葉粉與莖粉的誘導(dǎo)下，ACCD的表達(dá)量分別在培養(yǎng)的24 h與2 h達(dá)到最大，為未誘導(dǎo)的22.6倍與27.3倍。

關(guān)鍵詞深綠木霉；脫氨酶；誘導(dǎo)表達(dá)

1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶(ACC脫氨酶)廣泛存在于多種微生物中，它能催化乙烯前體分解來(lái)降低植物體內(nèi)乙烯的合成，從而減少過(guò)量乙烯對(duì)植物自身生長(zhǎng)造成的不良影響[1]。大量研究發(fā)現(xiàn)，土壤中微生物產(chǎn)生的ACC脫氨酶能促進(jìn)植物根部的生長(zhǎng)發(fā)育[2-4]；而近年來(lái)研究也發(fā)現(xiàn)，ACC脫氨酶能減輕非生物因素(如干旱、重金屬、鹽堿等)對(duì)植物的危害[5-7]。此外，部分研究證明，含有ACC脫氨酶的細(xì)菌能減輕植物病害[8-9]，但ACC脫氨酶與病原菌的作用機(jī)制還不清楚。

木霉菌(Trichodermaspp.)是一種極具應(yīng)用價(jià)值的生防菌，不僅能抑制多種病原真菌，還能促進(jìn)植物生長(zhǎng)、誘導(dǎo)其免疫能力，更是具有降解土壤中鹽類化合物、農(nóng)藥殘留物及重金屬離子等的功能[10]。然而，對(duì)于木霉菌中ACC脫氨酶生防功能的研究尚不多見(jiàn)。僅有的研究表明，深綠木霉(T. atroviride)通過(guò)產(chǎn)生ACC脫氨酶降解植物根部的乙烯前體，減少植物根部乙烯的合成來(lái)促進(jìn)番茄幼苗的生長(zhǎng)[11]；棘孢木霉(T. asperellum)T203中的ACC脫氨酶也被證明在促進(jìn)植物根部生長(zhǎng)中起重要作用[12]。本研究通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)獲得了深綠木霉ACCC30153中ACC脫氨酶基因的cDNA全長(zhǎng)，并研究了不同誘導(dǎo)條件下ACC脫氨酶的表達(dá)，為今后進(jìn)一步研究深綠木霉ACC脫氨酶的生防功能提供參考。

1材料與方法

深綠木霉ACCC30153菌株，購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的ACCD基因部分cDNA序列設(shè)計(jì)引物，以深綠木霉ACCC30153菌株菌絲體總mRNA和基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆獲得ACCD基因的全長(zhǎng)cDNA和DNA序列。

使用ORF查找器尋找ACCD基因的開(kāi)放讀碼框；用ExPASy-ProtParam軟件分析蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量等信息；通過(guò)BlastP預(yù)測(cè)蛋白保守區(qū)，尋找相似性序列；依據(jù)ClustalW軟件進(jìn)行多序列比對(duì)。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MM基礎(chǔ)培養(yǎng)基為15g/LNaH2PO4、453mg/LCaCl2、600mg/LMgSO4·7H2O、9.0mg/LFeSO4·7H2O、3.7mg/LCoCl2·7H2O、1.8mg/LMnSO4·H2O、2.5mg/LZnSO4·7H2O，并且含有5g/L(NH4)2SO4和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的葡萄糖；C饑餓誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(不含葡萄糖)；N饑餓誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(不含硫酸銨)；山新楊葉粉培養(yǎng)基為MM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(不含葡萄糖)+1%山新楊葉粉；山新楊莖粉培養(yǎng)基為MM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(不含葡萄糖)+1%山新楊莖粉。

菌絲體的培養(yǎng)與收集：將106個(gè)/mL木霉孢子接種于180mL1/4PD培養(yǎng)基中，于28 ℃、200r/min培養(yǎng)36h。然后，將菌絲體收集轉(zhuǎn)接到上述5種誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，分別于0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、24.0h收集菌絲體，保存到冰箱中(-80 ℃)備用(重復(fù)3次)。

采用Trizol方法提取木霉菌絲體RNA，用DNA酶消化RNA中的DNA。參照TaKaRaPrimeScriptTMRT試劑盒(大連寶生物公司Code：DRR037S)，以消化后的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將稀釋10倍后的cDNA用作RT-qPCR模板。

RT-qPCR反應(yīng)試劑盒為SYBRGreenRealtimePCRMastermix(ToyoboCo.,Ltd,Osaka,Japan)。反應(yīng)體系為2×SYBRGreenRealtimePCRMastermix10μL、引物(10μmol/L)各0.5μL、去離子水6μL、cDNA模板3μL。RT-qPCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30s；95 ℃ 5s、59 ℃ 15s、72 ℃ 10s；81 ℃讀板1s，45個(gè)循環(huán)(引物序列見(jiàn)表1)。

表1　RT-qPCR引物

2結(jié)果與分析

2.1深綠木霉ACCD基因的克隆與生物信息學(xué)分析

深綠木霉ACCD基因的cDNA全長(zhǎng)為1 083bp，共編碼360個(gè)氨基酸。ProtParam預(yù)測(cè)表明，該蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為38140，理論等電點(diǎn)為6.13。通過(guò)BlastP進(jìn)行保守區(qū)預(yù)測(cè)(見(jiàn)圖1)，該蛋白基因?qū)儆赥ry-synth-beta-Ⅱ家族，具有Try-synth-beta-Ⅱ家族的保守區(qū)結(jié)構(gòu)域。

圖1　ACCD保守區(qū)預(yù)測(cè)

通過(guò)NCBI的BlastP對(duì)ACCD基因進(jìn)行同源性搜索，在GenBank的數(shù)據(jù)庫(kù)中與深綠木霉ACCD基因氨基酸序列匹配的序列共有100個(gè)，相似性為65%～91%。隨機(jī)選取14個(gè)ACCD基因進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果表明：深綠木霉ACCD基因氨基酸序列與里氏木霉(XP-006967764)氨基酸序列的同源性最高為91%。含有2個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域，其中氨基酸序列的第295位和322位分別為Glu(E)和Leu(L)，證明該蛋白質(zhì)具ACC脫氨酶活性(見(jiàn)圖2)。

2.2深綠木霉ACCD基因在不同誘導(dǎo)條件下的表達(dá)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)了5種不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)的深綠木霉ACCD基因在轉(zhuǎn)錄水平上的變化。RT-qPCR分析結(jié)果顯示(見(jiàn)表2)：在MM培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，深綠木霉ACCD基因在24h內(nèi)呈連續(xù)上調(diào)表達(dá)，在16h時(shí)達(dá)到最大值，為未誘導(dǎo)時(shí)的23.5倍。在C、N饑餓培養(yǎng)條件下，該基因在培養(yǎng)的24h內(nèi)均呈先上調(diào)后下降又大幅上調(diào)的表達(dá)趨勢(shì)。在C饑餓培養(yǎng)中培養(yǎng)8h時(shí)，ACCD基因表達(dá)量達(dá)到最大值，為未誘導(dǎo)時(shí)的22.7倍；在N饑餓培養(yǎng)條件下，ACCD基因表達(dá)量在培養(yǎng)16h時(shí)達(dá)到最大值，為未誘導(dǎo)時(shí)的22.4倍。在山新楊葉粉培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，ACCD基因在24h內(nèi)呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，誘導(dǎo)僅1h表達(dá)量開(kāi)始急劇上升，在24h時(shí)達(dá)到最大值，為未誘導(dǎo)時(shí)的22.8倍。經(jīng)山新楊莖粉誘導(dǎo)后的ACCD基因表達(dá)量急劇上升，在第2h達(dá)到最大值，為未誘導(dǎo)時(shí)的27.3倍；此后，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，該基因表達(dá)量急劇下降。

XP_006967764為里氏木霉(Trichoderma reesei)；XP_013951488為綠色木霉(Trichoderma virens)；KKO97124為哈茨木霉(Trichoderma harzianum)；ACX94231為棘孢木霉(Trichoderma asperellum)；XP_013945914為深綠木霉(Trichoderma atroviride)；KUE98859為蓋姆斯木霉(Trichoderma gamsii)；XP_007816500為綠疆菌(Metarhizium robertsii)；KID86421為綠疆菌(Metarhizium guizhouense)；XP_008597946為白僵菌(Beauveria bassiana)；KPM40848為杓蘭菌根菌(Neonectria ditissima)；CCT63766為鐮刀菌(Fusarium fujikuroi)；KPA39012為鐮刀菌(Fusarium langsethiae)；KLP01246為鐮刀菌(Fusarium fujikuroi)；KIL92883為鐮刀菌(Fusarium avenaceum)。

圖2　ACCD氨基酸序列多序列比對(duì)

注：表中數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

3結(jié)論與討論

1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶(ACCD)是一種能抑制植物體內(nèi)乙烯合成的胞內(nèi)聚合酶，能切斷植物激素乙烯合成前體，從而降低了環(huán)境與病原菌誘導(dǎo)對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制[3]。本研究克隆了深綠木霉ACCC30153中ACCD基因的全長(zhǎng)cDNA序列，該基因的cDNA全長(zhǎng)為1083bp，編碼區(qū)可編碼360個(gè)氨基酸。通過(guò)預(yù)測(cè)得知該蛋白屬于Try-synth-beta-Ⅱ家族，且蛋白不含信號(hào)肽，是一種胞內(nèi)酶。有研究表明，土壤中的天然細(xì)菌產(chǎn)生的ACC脫氨酶可將植物細(xì)胞中的乙烯前體分解，并利用其分解物做C源和N源，供自身利用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，在C、N饑餓條件下，深綠木霉中的ACCD基因表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)，說(shuō)明該基因在木霉應(yīng)對(duì)缺乏營(yíng)養(yǎng)的條件過(guò)程中起到一定作用。而通過(guò)模擬深綠木霉與植物互作的研究發(fā)現(xiàn)，在與植物莖的互作過(guò)程中，ACCD基因會(huì)在互作的前期上調(diào)表達(dá)，表明當(dāng)木霉受到山新楊莖中的ACC誘導(dǎo)后，導(dǎo)致其ACC脫氨酶轉(zhuǎn)錄水平提高，而隨著培養(yǎng)時(shí)間的增強(qiáng)，植物莖所含ACC被分解，ACCD基因的表達(dá)也會(huì)隨之下降[14]。ACCD最早是從土壤細(xì)菌中分離出來(lái)的。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，ACCD不僅存在于細(xì)菌中，在真菌中也檢測(cè)到了它的活性。但是，具體作用還沒(méi)有進(jìn)行深入研究，本研究結(jié)果可為今后進(jìn)一步研究深綠木霉ACCD基因的功能提供參考。

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第一作者簡(jiǎn)介：刁桂萍，女，1981年11月生，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，副教授。E-mail：dgp2003@126.com。 通信作者：王志英，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail：zyw0451@sohu.com。

收稿日期：2016年4月13日。

分類號(hào)Q933

CloningandDifferentialExpressionofAnACCDeaminaseGenefromTrichoderma atrovirideACCC30153//

DiaoGuiping,LiSongyang,WangZhiying

(NortheastForestryUniversity,Harbin150040,P.R.China)//JournalofNortheastForestryUniversity，2016,44(8)：104-107.

ThecDNAofACCdeaminase(ACCD)genewasisolatedfromTrichoderma atrovirideACCC30153byusingPCR.ThecDNAsequenceofACCDwas1 083bpinlength,encoding360aminoacids.BlastPsearchindicatedthatACCDbelongedtoTry-synth-beta-Ⅱfamilyanditshownthehighestsimilarity91%withaproteinofT. reesei (XP-006967764). ACCDwasproventobedifferentiallytranscribedunderfivedifferenttreatments. ACCDtranscriptswereup-regulatedundernutritionalstressconditionswithpeaktranscriptionlevelsof22.7and22.4times,at8hand16h,respectively. ACCDtranscriptionwasalsoup-regulatedby1%leafandstempowderofPopulus davidiana×P. albavar. pyramidalis,withpeaktranscriptionlevelsof22.6and27.3times,at24hand2h,respectively.

KeywordsTrichoderma atroviride； ACC deaminase； Differential expression

1)中央高?；A(chǔ)科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2572014BA08)；中國(guó)博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目(20110491014)；黑龍江省博士后資助經(jīng)費(fèi)。

責(zé)任編輯：張玉。