蔡雯婷，任成達，劉晴雨，危清泉，杜亞茹，王倩怡，劉俊伶，何夢梅，于　靖

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·實驗論著·

緩激肽刺激體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜色素上皮細胞炎癥反應的作用機制

蔡雯婷，任成達，劉晴雨，危清泉，杜亞茹，王倩怡，劉俊伶，何夢梅，于靖

Department of Ophthalmology, the Tenth People’s Hospital of Tongji University, Shanghai 200072, China

Correspondence to:Jing Yu. Department of Ophthalmology, the Tenth People’s Hospital of Tongji University, Shanghai 200072, China. dryujing@aliyun.com

Received：2016-03-01Accepted：2016-07-05

?AIM: To investigate mechanism of bradykinin (BK) on inflammations of retinal pigment epithelium (RPE) cells.

?METHODS: ARPE-19 cells were culturedinvitro, stimulated by 100nM BK for 24h. Cell morphology changes were observed by microscope, and BK receptor localization was detected through cell immunofluorescence. Changes of Ca2+in BK and BR antagonist stimuli were detected by laser scanning confocal microscopy. The expressions of COX-1, COX-2, eNOS and iNOS protein in control group and BK group were detected by Western Blot.

?RESULTS: After the stimulation of BK, there was no significant changes of ARPE-19 cells in morphology. Kinin B1 receptors (B1R) and B2 receptors (B2R) could be detected in ARPE-19 cells. Compared with control group, Ca2+concentrations significantly increased in BK group; in B1R antagonist group and B2R antagonist group Ca2+concentrations increased less than BK group; B1R and B2R antagonist group showed no obvious changes in Ca2+concentrations. Compared with control group, COX-2 and iNOS protein concentrations were significantly increased in BK group (P<0.001).

?CONCLUSION: BK induces the increasing expression of COX-2 and iNOS in the cultured ARPE cells through binding with either B1R or B2R.

Citation:Cai WT, Ren CD, Liu QY,etal. Mechanism of bradykinin on inflammations of retinal pigment epithelium cells.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(8):1430-1434

摘要

目的：探討緩激肽刺激體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)細胞炎癥反應的作用機制。

方法：體外培養(yǎng)ARPE-19細胞，100nmol/L緩激肽(bradykinin，BK)刺激24h后，光鏡下觀察細胞形態(tài)變化，細胞免疫熒光檢測BK受體定位；共聚焦顯微鏡檢測BK及其拮抗劑作用下Ca2+變化；Western blot檢測對照組與100nmol/L BK處理24h后(BK組)COX-1、COX-2、eNOS、iNOS蛋白的表達量。

結果：BK刺激后，ARPE-19細胞形態(tài)無明顯變化；ARPE-19細胞可檢測到激肽B1、B2受體；與對照組相比，BK組Ca2+濃度顯著升高；B1R拮抗組及B2R拮抗組的Ca2+濃度較BK組升高幅度降低，B1R及B2R拮抗組Ca2+濃度較對照組無明顯變化；BK作用ARPE-19細胞后，COX-2及iNOS蛋白含量顯著增加(P<0.001)。

結論：BK通過與B1R及B2R結合促進體外培養(yǎng)的ARPE細胞COX-2及iNOS表達增加。

關鍵詞：緩激肽；增生性視網(wǎng)膜病變；環(huán)氧化酶；一氧化氮合酶

引用：蔡雯婷，任成達，劉晴雨，等.緩激肽刺激體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜色素上皮細胞炎癥反應的作用機制.國際眼科雜志2016;16(8):1430-1434

0引言

諸多眼底病在原發(fā)或者繼發(fā)病程中出現(xiàn)增殖性改變，統(tǒng)稱為增生性視網(wǎng)膜疾病。常見的增生性視網(wǎng)膜疾病包括增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)、增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)等。目前有觀點認為PVR是眼內(nèi)一種異常的創(chuàng)傷愈合過程[1]，炎癥反應對增生性視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生具有重要作用[2]。

緩激肽(bradykinin，BK)是生理條件下激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(kallikrein-kinin system，KKS)的主要激肽類物質(zhì)，是KKS最終發(fā)揮效應的血管活性物質(zhì)。本課題組一直致力于增生性玻璃體視網(wǎng)膜相關疾病的研究，我們前期通過蛋白質(zhì)組學分析PVR和PDR的玻璃體，結果顯示補體凝血級聯(lián)(complement and coagulation cascades)是其中最重要的KEGG通路[3-5]，此提示該通路可能是增生性視網(wǎng)膜病變的共同通路。補體凝血級聯(lián)由KKS、凝血系統(tǒng)和補體系統(tǒng)三部分組成。其中KKS為連接補體通路及凝血酶通路的中間過程，起關鍵性的調(diào)節(jié)作用。盡管BK在一些疾病中起著重要作用，但BK對RPE細胞的研究尚不明確。本研究擬通過BK對RPE細胞的炎癥作用，探討B(tài)K對增生性視網(wǎng)膜疾病的影響。

1材料和方法

1.1材料原代ARPE-19細胞(同濟大學眼科研究所徐國彤教授饋贈)。緩激肽、HOE-140、Leu-8(Sigma公司)；B1R抗體、iNOS抗體、Western Blot相關二抗(Abcam公司)；B2R抗體(BD公司)；COX-1抗體、COX-2抗體、eNOS抗體(Cell Signaling Technology公司)。

1.2方法

1.2.1 BK對體外培養(yǎng)ARPE-19細胞形態(tài)學變化取凍存的原代ARPE-19細胞，37℃水浴，快速搖晃，直至凍存液完全融化，移入15mL離心管，離心(1000r/min，5min)，吸除凍存液，緩慢加入5mL培養(yǎng)液，用培養(yǎng)液(含有4%胎牛血清、2mmol/L左旋谷酰胺、0.1mmol/L非必需氨基酸的DMEM/F121∶1培養(yǎng)液)混懸沉淀細胞，調(diào)整細胞濃度，置于5% CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周1∶6傳代，換液2次。傳代4～6次，取培養(yǎng)的ARPE-19細胞，光鏡下(×100)觀察細胞形態(tài)，100nmol/L BK刺激24h后，觀察細胞形態(tài)學變化。

1.2.2細胞免疫熒光BK受體定位取培養(yǎng)的ARPE-19細胞，4%多聚甲醛4℃固定，PBS漂洗，含10%胎牛血清及0.2% Triton的0.01mol/L PBS 37℃孵育。分別加入一抗(B1R抗體、B1R抗體，1∶200)，37℃孵育1h，4℃冰箱中過夜，孵育二抗(1∶200)，染核(DAPI，1∶200)，封片后共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.3檢測BK及其拮抗劑對細胞內(nèi)Ca2+濃度的影響取培養(yǎng)的ARPE-19細胞，計數(shù)1×104個。將Fluo-3/AM配制為1mmol/L原液，-20℃避光保存。F-127用DMSO配制成20%溶液(W/V)。用無血清無酚紅培養(yǎng)液將Fluo-3/AM稀釋成終濃度10μmol/L，并加入0.1%Pluronic F-127備用。移去培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，加入10μmol/L染料液1mL，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱避光孵育30min。將染色后的ARPE-19細胞用PBS液沖洗3次，加入1mL DMEM液后用共聚焦顯微鏡觀察，LaserSharp 2000軟件掃描記錄無處理組細胞內(nèi)Ca2+濃度，待基線穩(wěn)定后，其余各組分別給予如下刺激為：BK 100nmol/L刺激(BK組)、BK刺激前預敷100nmol/L B1R拮抗劑Leu-8(B1R拮抗組)、BK刺激前預敷100nmol/L B2R拮抗劑HOE-140(B2R拮抗組)、BK刺激前預敷100nmol/L Leu-8及HOE-140(B1R及B2R拮抗組)，記錄刺激后圖像變化。

1.2.4 Western blot檢測COX-1、COX-2、eNOS及iNOS下游炎癥相關蛋白的表達取培養(yǎng)的ARPE-19細胞，無BK處理(對照組)與100nmol/L BK處理(BK組)24h后，加入蛋白裂解液，30min后離心(12000r/min，15min)，酶標儀定量后電泳分離，再轉入硝酸纖維膜，室溫封閉1h。分別加入一抗(COX-1、COX-2、eNOS、iNOS及β-tublin，1∶1000)濕盒內(nèi)4℃過夜，加入二抗，37℃下孵育40min，漂洗3次，每次10min，試劑盒顯色，以β-tublin為內(nèi)參照，檢測COX-1、COX-2、eNOS及iNOS蛋白相對表達量。

圖1100nmol/L BK刺激24h后ARPE-19細胞培養(yǎng)形態(tài)學變化(×100)A：無BK刺激組；B：100nmol/L BK刺激組。

2結果

2.1 BK對ARPE細胞形態(tài)的影響光鏡下(×100)觀察ARPE-19細胞形態(tài)，貼壁生長，細胞無色透明，細胞形態(tài)呈扁平多角形。BK 100nmol/L刺激24h后，細胞形態(tài)未見明顯變化(圖1)。

2.2 BK受體在ARPE細胞的分布通過細胞免疫熒光的檢測顯示，BK受體B1R及B2R在ARPE-19細胞上均有分布，且在細胞膜、細胞質(zhì)及細胞核中均可檢測到(圖2)。

2.3 BK及其拮抗劑對細胞內(nèi)Ca2+濃度的影響無BK刺激時，細胞內(nèi)Ca2+維持在一個相對穩(wěn)定的基線水平(圖3A)。給予100nmol/L的BK刺激后，細胞內(nèi)Ca2+水平顯著提高，且在隨后的一段時間內(nèi)維持一個較高水平，然后再逐漸回落至基線水平(圖3B)。在BK刺激前分別給予B1R拮抗劑Leu-8及B2R拮抗劑HOE-140孵育，均可見峰值下降，且添加HOE-140后抑制程度更加顯著(圖3C、D)。同時給予Leu-8及HOE-140孵育，100nmol/L BK刺激不引起細胞內(nèi)Ca2+水平的升高(圖3E)。

2.4 BK對下游炎癥相關蛋白含量的影響

2.4.1 BK對COX-1及COX-2的影響ARPE-19細胞在無BK處理時，幾乎不表達COX-1，100nmol/L BK刺激24h后檢測，COX-1含量無明顯改變(圖4A)；正常條件培養(yǎng)的ARPE-19細胞也很少表達COX-2，給予100nmol/L BK刺激后24h，COX-2含量顯著增加(圖4B，P<0.001)。

2.4.2 BK對iNOS及eNOS的影響正常條件培養(yǎng)的ARPE-19細胞內(nèi)可檢測到eNOS蛋白的表達，100nmol/L BK刺激24h后，eNOS含量無明顯改變(圖5A)；ARPE-19細胞iNOS表達量很少，給予100nmol/L BK刺激后24h檢測，iNOS含量顯著增加(圖5B，P<0.001)。

3討論

近年來大量研究認為，慢性亞臨床的低度炎癥與PVR、PDR的發(fā)生、發(fā)展密切相關[6]。我們前期研究結果顯示，補體及凝血級聯(lián)是不同增生性視網(wǎng)膜疾病的共同病理過程。其中BK是KKS的最終效應分子，可能在其發(fā)生發(fā)展中起重要作用，然而其具體的作用途徑及效應尚不清楚。本文通過體外培養(yǎng)ARPE，探討B(tài)K及其受體的作用途徑。

圖2細胞免疫熒光檢測BK受體在ARPE細胞的分布A：B1R在ARPE-19細胞上定位；B：DAPI細胞核染色；C：A與B融合；D：B2R在ARPE-19細胞上定位；E：DAPI細胞核染色；F：D與E融合。

圖3不同條件下細胞內(nèi)Ca2+濃度變化A：無BK刺激；B：100nmol/L BK刺激；C：BK刺激前預敷10μmol/L B1R拮抗劑Leu-8；D：BK刺激前預敷10μmol/L B2R拮抗劑HOE-140；E：BK刺激前預敷10μmol/L Leu-8及HOE-140。

以往有報道稱BK觸發(fā)了Ca2+誘導的Ca2+釋放[7-8]。在某些類型的細胞中，BK觸發(fā)了Ca2+濃度的驟然上升，達到峰值，隨著Ca2+的回收，濃度下降直至穩(wěn)定。剛開始Ca2+的驟然上升，可能是由于BK激活了受體或第二信使介導的Ca2+。在我們這次研究中，在BK刺激前給予BK受體拮抗劑孵育后，峰值下降，這與以往的研究結果保持一致。

COX及NOS是重要的炎癥相關蛋白，其在增生性視網(wǎng)膜疾病中的作用已有研究。有報道稱，PVR及PDR中COX的表達均顯著增加[9]，COX含量升高導致局部炎癥反應增加，促進了疾病進展。此外，COX抑制劑在PDR的全身治療中有一定作用[10]。以往的研究表明，iNOS在糖尿病患者及動物模型的視網(wǎng)膜中顯著增加，其能通過產(chǎn)生NO來發(fā)揮潛在的視網(wǎng)膜毒害作用[11]，且iNOS抑制劑能顯著抑制PDR中視網(wǎng)膜微血管的形成[12]。本研究通過對BK刺激前后炎癥相關蛋白COX-1，COX-2，iNOS及eNOS含量的分析顯示，BK刺激后COX-2及iNOS含量顯著增加，提示二者可能是BK下游的效應分子。Inoue等[13]發(fā)現(xiàn)BK刺激大鼠背根神經(jīng)節(jié)細胞后，COX-1含量不變，COX-2含量增多，前列腺素E2含量也隨之增加，說明BK通過促進COX-2表達從而促進前列腺素E2合成。然而，對腎小葉間動脈的研究顯示，BK對前列腺素的調(diào)節(jié)作用是通過COX-1而非COX-2產(chǎn)生的[14]。Lim等[15]對RPE細胞的研究顯示，BK可以顯著增加COX-2含量，而不影響COX-1含量，這與本研究結果是一致的。各研究中BK對COX-1及COX-2影響的不一致性說明BK的作用存在組織或細胞類型的差異性。BK作用于RPE細胞時，eNOS含量無明顯變化，iNOS含量顯著增加，提示iNOS是BK作用的效應分子之一。本研究發(fā)現(xiàn)，BK通過調(diào)節(jié)炎性介質(zhì)的表達，刺激體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜色素上皮細胞發(fā)生炎癥反應。

圖4BK對COX-1及COX-2的影響A：BK對COX-1蛋白水平的影響；B：BK對COX-2蛋白水平的影響；C：COX-1蛋白表達灰度掃描經(jīng)內(nèi)參校正后結果；D：COX-2蛋白表達灰度掃描經(jīng)內(nèi)參校正后結果(對照組為無處理組，實驗組為100nmol/L BK處理24h組；bP<0.01vs對照組)。

圖5BK對eNOS及iNOS的影響A：BK對eNOS蛋白水平的影響；B：BK對iNOS蛋白水平的影響；C：eNOS蛋白表達灰度掃描經(jīng)內(nèi)參校正后結果；D：iNOS蛋白表達灰度掃描經(jīng)內(nèi)參校正后結果(對照組為無處理組，實驗組為100nmol/L BK處理24h組；bP<0.01vs對照組)。

本研究顯示，BK可以促進COX-2及iNOS表達，二者均是重要的炎性介質(zhì)。BK是體內(nèi)重要的血管活性物質(zhì)，而PDR主要為微血管病變，因此二者之間可能存在一定關聯(lián)。BK一方面可以激活iNOS表達，促進NO合成，擴張血管，改善缺血缺氧狀況；另一方面，BK可以使視網(wǎng)膜微血管通透性增大，外滲的生長因子等將促進PDR進展[16]。因此，BK對炎癥反應的影響能夠指導臨床上PDR疾病的治療，BK與PDR的關系尚需進一步的實驗研究。

盡管我們在BK對體外培養(yǎng)RPE細胞的作用上有所發(fā)現(xiàn)，但本研究仍存在一些不足之處。首先，KKS成分復雜，盡管BK是KKS最主要的效應分子，但系統(tǒng)內(nèi)其他物質(zhì)可能對RPE細胞的炎癥反應有影響，這需要進一步研究。其次，本研究是基于體外正常培養(yǎng)的RPE細胞，未能在動物疾病模型上驗證,以上我們將在后續(xù)研究中繼續(xù)完善。

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基金項目：國家自然基金面上項目(No.81470648)

作者單位：(200072)中國上海市，同濟大學附屬第十人民醫(yī)院眼科

作者簡介：蔡雯婷，同濟大學在讀碩士研究生，研究方向：視網(wǎng)膜病。

通訊作者：于靖，畢業(yè)于上海交通大學，博士，副教授，副主任醫(yī)師，博士研究生導師，上海市醫(yī)學分會視光學分會委員，主持國家自然科學基金2項，獲得上海市科技啟明星培養(yǎng)計劃、上海市衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀青年人才培養(yǎng)計劃資助，研究方向：視網(wǎng)膜病.dryujing@aliyun.com

收稿日期：2016-03-01 修回日期： 2016-07-05

Foundation item:National Natural Science Foundation of China (No. 81470648)

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.8.07

?KEYWORDS:bradykinin; proliferative vitreoretinopathy; cyclooxygenase; nitric oxide synthase

Mechanism of bradykinin on inflammations of retinal pigment epithelium cells

Wen-Ting Cai, Cheng-Da Ren, Qing-Yu Liu, Qing-Quan Wei, Ya-Ru Du, Qian-Yi Wang, Jun-Ling Liu, Meng-Mei He, Jing Yu

Abstract