伍昌華，陳紹品，溫貴蘭，李　晨，李天珍，林漢卿，管?chē)?guó)丹，王開(kāi)功，文　明，龔新勇

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025)

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基于倒毛雞LSm14A分子序列分析的原核表達(dá)與免疫原性分析

伍昌華，陳紹品，溫貴蘭*，李晨，李天珍，林漢卿，管?chē)?guó)丹，王開(kāi)功，文明，龔新勇

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025)

摘要：旨在探明倒毛雞LSm14A分子序列特征與免疫原性。通過(guò)提取倒毛雞肝總RNA，經(jīng)RT-PCR分別擴(kuò)增倒毛雞LSm14A全長(zhǎng)CDS區(qū)與原核表達(dá)片段；采用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建攜帶倒毛雞LSm14分子的原核表達(dá)質(zhì)粒；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、His-tag鎳柱純化表達(dá)的重組蛋白質(zhì)；純化重組蛋白質(zhì)rHis-cLSm14A分別免疫小鼠與兔制備相應(yīng)的多克隆抗體；采用間接ELISA與Western blotting方法分析表達(dá)蛋白質(zhì)的免疫原性。結(jié)果顯示：倒毛雞LSm14A全長(zhǎng)CDS為1 386 bp，與原雞源LSm14A相似性達(dá)100%，與鴨源的LSm14A相似性為95.1%；與鼠、爪蟾、猴、人、豬、鵝源的LSm14A相似性相對(duì)較低；鼠源、兔源抗cLSm14A多克隆抗體ELISA效價(jià)均高于1∶3 200；Western blotting結(jié)果顯示，重組表達(dá)蛋白質(zhì)分別被His抗體、鼠源與兔源抗cLSm14A多克隆抗體所識(shí)別，蛋白質(zhì)條帶大小約為19.6 ku。以上結(jié)果說(shuō)明倒毛雞源LSm14A分子具有較高的保守性與良好的免疫原性，研究結(jié)果為研究倒毛雞的生物學(xué)特性與宿主的抗病毒天然免疫機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：倒毛雞；cLSm14A；免疫原性

Sm(Smith)蛋白家族最早在研究人類(lèi)前體RNA的加工過(guò)程中被發(fā)現(xiàn)，參與前體RNA的加工[1]。從原核生物到真核生物的多種生物體內(nèi)還發(fā)現(xiàn)多種含Sm基序的高度保守的同源蛋白質(zhì)家族，稱(chēng)之為Sm樣蛋白(Sm-Like，LSm)[2-3]。LSm蛋白是RNA結(jié)合蛋白，不同的LSm蛋白在生物中分布廣泛，參與多種RNA代謝過(guò)程[4-5]。LSm14A也稱(chēng)為RAP55A/Tral/Scd6，屬于Sm樣蛋白家族，最先在伊比利亞肋突螈與非洲爪蟾中發(fā)現(xiàn)，主要結(jié)合在卵母細(xì)胞質(zhì)處理小體上，在進(jìn)化上具有保守性[6]。近期研究表明LSm14A是一種新型病毒核酸受體，參與宿主細(xì)胞的天然免疫反應(yīng)[7]。倒毛雞是貴州省重點(diǎn)保護(hù)與開(kāi)發(fā)的品種之一，但其易患新城疫、傳染性支氣管炎、雞痘等病毒性疾病，發(fā)病率為20%～30%，死亡率為70%～80%。為進(jìn)一步探明倒毛雞的品種特性、有效降低疫病對(duì)倒毛雞養(yǎng)殖業(yè)的威脅，作者以倒毛雞LSm14A作為研究對(duì)象，系統(tǒng)地對(duì)倒毛雞LSm14A分子進(jìn)行了核苷酸與氨基酸序列分析，同時(shí)構(gòu)建了相應(yīng)的原核表達(dá)載體、制備了相應(yīng)的抗倒毛雞LSm14A的兔源與鼠源多克隆抗體。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、質(zhì)粒、菌株10周齡健康倒毛雞5只，由貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院歐德淵教授惠贈(zèng)；體重3 kg左右的健康雄性新西蘭大白兔3只、4～6周的雄性小鼠購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于本實(shí)驗(yàn)室；pColdⅠ質(zhì)粒由上海獸醫(yī)研究所馬永志教授惠贈(zèng)；BL21購(gòu)自碧云天公司。

1.1.2試劑反轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自普洛麥格公司；PCR相關(guān)試劑購(gòu)自寶生物公司；His-tag抗體、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒等購(gòu)自碧云天公司；Ni NTA瓊脂糖凝膠購(gòu)自北京韋氏博慧色譜科技有限公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)參照NCBI GallusLSm14A(基因登錄號(hào)：NM_001012778.1)序列，用DNAStar軟件分析LSm14A基因，采用Primer Premier5.0軟件分別設(shè)計(jì)克隆cLSm14A基因和構(gòu)建攜帶LSm14A原核表達(dá)載體用的特異性引物(表1)。

表1　cLSm14A克隆所需引物

下劃線為酶切位點(diǎn)

The enzyme digestion sites are underlined

1.2.2組織RNA的提取與RT-PCR采用RNA提取試劑盒提取倒毛雞肝總RNA作為模板、Oligo(dT)15為引物、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA為模板、分別采用“1.2.1”的引物擴(kuò)增倒毛雞LSm14A全長(zhǎng)編碼區(qū)與原核表達(dá)截短區(qū)域。

1.2.3cLSm14A序列分析將倒毛雞源cLSm14A核苷酸序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)分析，采用DNAStar軟件MegAlign方法繪制倒毛雞源cLSm14A進(jìn)化樹(shù)，比較倒毛雞源與其他物種源LSm14A核苷酸序列相似性。利用在線網(wǎng)站(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred-sopma.pl)對(duì)LSm14A蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。1.2.4原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建分別采用EcoRⅠ、XbaⅠ酶切PCR產(chǎn)物和pColdⅠ質(zhì)粒、純化酶切產(chǎn)物、于16 ℃反應(yīng)條件下連接過(guò)夜、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞中、菌液PCR鑒定、雙酶切鑒定，初步鑒定陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送廣州立菲生物公司測(cè)序。測(cè)序正確后，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pCold Ⅰ-cLSm14A。1.2.5重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)、純化與鑒定取含有陽(yáng)性重組質(zhì)粒pColdⅠ-cLSm14A的BL21表達(dá)宿主菌，按1∶100的比例接種于含氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)液中、IPTG(終濃度為1.0 mmol·L-1)誘導(dǎo)4 h、8 mol·L-1脲素PBS重懸、超聲破碎處理、Ni NTA瓊脂糖(400 mmol·L-1咪唑洗脫)純化表達(dá)蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)樣品采用15% SDS-PAGE進(jìn)行鑒定，純化的重組蛋白質(zhì)命名為rHis-cLSm14A。

1.2.6抗cLSm14A多克隆抗體的制備將純化的重組蛋白質(zhì)rHis-cLSm14A與弗氏完全佐劑等體積充分乳化后，分別頸部皮下多點(diǎn)注射新西蘭大白兔(500 μg·只-1)、小鼠(50 μg·只-1)，14 d后改用弗氏不完全佐劑乳化重組蛋白質(zhì)，依次間隔14 d后，分別進(jìn)行三、四次免疫。無(wú)菌心臟采血、分離血清、分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7抗cLSm14A多克隆抗體效價(jià)鑒定取“1.2.6”制備的抗cLSm14A兔源、鼠源多克隆抗體分別進(jìn)行1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200倍的稀釋?zhuān)捎眉兓闹亟M蛋白質(zhì)包被酶標(biāo)板，按間接ELISA方法分別測(cè)定多克隆抗體的ELISA效價(jià)。

1.2.8Western blotting檢測(cè)蛋白質(zhì)樣品采用15%SDS-PAGE進(jìn)行電泳，采用濕轉(zhuǎn)方法將樣品蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，0.5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，洗膜，分別加入His-tag抗體(1∶1 000)、抗cLSm14A兔源多克隆抗體(1∶1 000)、抗cLSm14A鼠源多克隆抗體(1∶500) 4 ℃孵育過(guò)夜，洗滌，分別加入HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1∶1 000)、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶1 000) 37 ℃孵育1 h，洗膜，顯色、壓片、曝光、拍照，記錄結(jié)果。

2結(jié)果

2.1cLSm14A序列分析

RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，倒毛雞源cLSm14A 編碼區(qū)約為1 400 bp，測(cè)序結(jié)果顯示擴(kuò)增條帶為1 386 bp，與預(yù)期長(zhǎng)度一致(圖1)。

M.DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2.cLSm14A基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M.DL2000 DNA marker；1，2.PCR product of cLSm14A gene圖1　cLSm14A基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1　Amplification of cLSm14A gene

NCBI Blast分析發(fā)現(xiàn)，倒毛雞cLSm14A與基因登錄號(hào)為NM_001012778的原雞源序列相似度達(dá)100%；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，倒毛雞源cLSm14A與鴨源在同一分支，相似度為95.1%；與鼠、爪蟾、猴、人、豬、鵝的LSm14A較遠(yuǎn)，相似度分別為61.3%、46.2%、43.2%、43.0%、43.0%、26.7%(圖2)。

通過(guò)DNAStar、NCBI網(wǎng)站提供的軟件分析發(fā)現(xiàn)cLSm14A含有Sm2與FDF基序；cLSm14A基因編碼的蛋白質(zhì)中無(wú)規(guī)卷曲的含量最高(約占整個(gè)肽鏈的52.49%)，其次是α-螺旋(占25.81%)，延伸鏈占16.70%，β-轉(zhuǎn)角占4.99%。

2.2原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

陽(yáng)性菌株質(zhì)粒雙酶切結(jié)果顯示，酶切產(chǎn)物約為4 407與474 bp的兩條特異性條帶，與預(yù)期大小一致(圖3)。測(cè)序結(jié)果表明，目的序列正確插入原核表達(dá)載體中，重組質(zhì)粒命名為pColdⅠ-cLSm14A。

圖2　cLSm14A與其他物種LSm14A分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2　Phylogenetic analysis of LSm14A molecules from chicken and other species

M1.DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2.重組質(zhì)粒pColdⅠ-cLSm14A PCR產(chǎn)物；M2.DL5000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；3、4.重組質(zhì)粒pColdⅠ-cLSm14A EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切鑒定M1.DL2000 DNA marker；1，2.PCR product of recombinant plasmid pColdⅠ-cLSm14A；M2.DL5000 DNA marker；3，4.The product digested by EcoRⅠ and XbaⅠ from pColdⅠ-cLSm14A圖3　原核表達(dá)質(zhì)粒pColdⅠ-cLSm14A PCR(A)鑒定與酶切鑒定(B)Fig.3　Identification of the recombinant plasmid pColdⅠ-cLSm14A by PCR (A) and enzyme digestion (B)

2.3重組蛋白質(zhì)表達(dá)、純化與鑒定

15%的SDS-PAGE電泳鑒定結(jié)果顯示，重組表達(dá)蛋白質(zhì)rHis-cLSm14A主要以包涵體形式存在，rHis-cLSm14A相對(duì)分子質(zhì)量約為19.6 ku(圖4)，與預(yù)期相一致。

2.4抗cLSm14A多克隆抗體的制備

間接ELISA結(jié)果顯示，本次制備的抗cLSm14A兔源、鼠源多克隆抗體效價(jià)均高于1∶3 200。

2.5Western blotting

Western blotting結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組表達(dá)蛋白質(zhì)能與His單抗、兔源多克隆抗體、鼠源多克隆抗體產(chǎn)生特異性反應(yīng)，條帶均為19.6 ku左右(圖5)。

M.預(yù)染的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pColdⅠ-cLSm14A轉(zhuǎn)入BL21菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后超聲菌液；2.pColdⅠ-cLSm14A轉(zhuǎn)入BL21菌IPTG誘導(dǎo)未超聲菌液；3.pColdⅠ-cLSm14A轉(zhuǎn)入BL21菌未誘導(dǎo)菌液；4～7.雜蛋白質(zhì)；8、9.純化的rHis-cLSm14A蛋白M.Protein marker；1.Supernatant of BL21 (pColdI-cLSm14A) induced with IPTG after ultrasound；2.Solution of BL21 (pColdⅠ-cLSm14A) induced with IPTG before ultrasound；3.Solution of BL21 uninduced；4-7.Without rHis-cLSm14A recombinant protein；8，9.Purified rHis-cLSm14A recombinant protein圖4　重組pColdⅠ-cLSm14A蛋白表達(dá)產(chǎn)物的鑒定Fig.4　Analysis of expression of recombinant protein pColdⅠ-cLSm14A

A.一抗為His單抗體；B.一抗為鼠源抗cLSm14A多克隆抗體；C.一抗為兔源cLSm14A多克隆抗體；M.預(yù)染的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.空載體pColdⅠ；2：誘導(dǎo)的pColdⅠ-cLSm14A重組菌A.First antibody is His monoclonal antibody；B.First antibody is ployclonal mouse-anti-cLSm14A antibody；C.First antibody is ployclonal rabbit-anti-cLSm14A antibody；M.Protein marker；1.Empty vector pColdⅠ；2.Purified pColdⅠ-cLSm14A recombinant protein圖5　重組蛋白rHis-cLSm14A的Western blotting鑒定Fig.5　Identification of recombinant protein rHis-cLSm14A by Western blotting

3討論

通過(guò)RT-PCR獲得了倒毛雞源cLSm14A全長(zhǎng)CDS，大小為1 386 bp；進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明cLSm14A分子在本物種中是高度保守的；Western blotting結(jié)果顯示cLSm14A具有良好的免疫原性。LSm14A作為新型的核酸受體，可直接識(shí)別并結(jié)合病毒核酸，有效激活宿主的天然免疫，介導(dǎo)Ⅰ型干擾素的表達(dá)，抑制水皰病毒、新城疫病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的復(fù)制[8-9]，說(shuō)明LSm14A蛋白是重要的天然抗病毒免疫分子，本研究為下一步更深層次地探索LSm14A在天然免疫中的作用奠定了基礎(chǔ)。

LSm14A也稱(chēng)為hRAP55A，不同物種的LSm14A氨基酸比對(duì)結(jié)果顯示LSm14A的N端高度保守，人源與豬源LSm14A的N端包含一個(gè)Sm樣結(jié)構(gòu)域，C端有一個(gè)FFD-TFG box結(jié)構(gòu)域，還具有α螺旋形成多個(gè)親水的環(huán)狀結(jié)構(gòu)FDF結(jié)構(gòu)域[10]；倒毛雞源LSm14A序列分析顯示cLSm14A也含有Sm2與FDF基序，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)卷曲的含量最高，約占整個(gè)肽鏈的52.49%。LSm蛋白家族含有十多個(gè)成員，參與各種與RNA代謝有關(guān)的信號(hào)通路，施一公課題組首次報(bào)道了LSm2～8蛋白質(zhì)復(fù)合物自組裝的晶體結(jié)構(gòu)及其特異識(shí)別U6小核RNA 3′末端序列的分子機(jī)制[11]。倒毛雞cLSm14A的Sm2與FDF基序、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)在病毒感染中發(fā)揮何種作用，還有待于進(jìn)一步探索研究。

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(編輯白永平)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.027

收稿日期：2015-12-28

基金項(xiàng)目：貴州大學(xué)博士基金項(xiàng)目[貴大人基合字(2013)12]；國(guó)家自然科學(xué)基金(31460668)；貴州大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目(研農(nóng)2015024)；貴州大學(xué)“本科教學(xué)工程”項(xiàng)目(JKSP2013004)；貴州省科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目[黔科合人才團(tuán)隊(duì)(2015)4016]

作者簡(jiǎn)介：伍昌華(1989-)，男，仡佬族，貴州石阡人，碩士生，主要從事獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)研究，E-mail：1006492290@qq.com *通信作者：溫貴蘭，E-mail：glwen@gzu.edu.cn

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):0366-6964(2016)07-1511-06

Prokaryotic Expression of theLSm14A Gene in the Frizzle Chicken Based on the Sequence and Immunogenicity Analyses of the Expressed LSm14A

WU Chang-hua，CHEN Shao-pin，WEN Gui-lan*，LI Chen，LI Tian-zhen，LIN Han-qing，GUAN Guo-dan，WANG Kai-gong，WEN Ming，GONG Xin-yong

(PreventiveVeterinaryLaboratory，CollegeofAnimalScienceGuizhouUniversity，Guiyang550025，China)

Abstract:The aim of this study was to explore the sequence and the immunogenicity of LSm14A gene of the Frizzle chicken.Total cellular RNA was isolated from the livers of frizzle chickens hepatic tissue，and full length CDS region and prokaryotic expression fragment of LSm14A gene were amplified by reverse transcription polymerase chain reaction RT-PCR.The recombinant plasimd was transfected into BL21 competent cells，then His-tag Ni-NTA spin columns were applied to purify the recombinant protein which were produced by IPTG induced BL21.To generate the corresponding hyperimmune serum，rabbits and mice were immunized with the purified recombinant protein rHis-cLSm14A.Sequence analysis revealed that the full length of LSm14A CDS region transcripts from the frizzle chicken was amplified by RT-PCR.The amplified LSm14A CDS region had 1 368 bp and was 100% identical at the base sequence level to the sequence in GenBank.It has a close similarity to the duck source which reaches to 95.1%，on the contrary，the similarity to LSm14A from the mouse source，Xenopus，monkey source，human source，pig source，anser source were distant.The titers of serum mouse-anti-cLSm14A and rabbit-anti-cLSm14A antibodies were both higher than 1∶3 200.Western blotting assay showed that the recombinant protein displayed an immune response with the His-antibody，mouse-anti-cLSm14A hyperimmune serum and rabbit-anti-cLSm14A hyperimmune serum，The band weighted about 19.6 kDa in the western blotting.All the results indicated that the LSm14A molecule of frizzle chicken had a high conservative property and good immunogenicity，which laid a solid foundation for the further study of biological characteristics of frizzle chickens and antiviral natural immune mechanism of poultry.

Key words:the frizzle chicken；cLSm14A；immunogenicity