唐耀華　萬品俊　郝培應(yīng)　傅強(qiáng),*　俞曉平,*

(1中國計量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 浙江省生物計量與檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室， 杭州 310018；2中國水稻研究所 水稻生物學(xué)國家重點實驗室， 杭州 310006； *通訊聯(lián)系人， E-mail: fuqiang@caas.cn; yxp@cjlu.edu.cn)

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類酵母共生菌中兩個組氨酸合成基因在褐飛虱發(fā)育中的作用

唐耀華1,2萬品俊2郝培應(yīng)1傅強(qiáng)2,*俞曉平1,*

(1中國計量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 浙江省生物計量與檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室， 杭州 310018；2中國水稻研究所 水稻生物學(xué)國家重點實驗室， 杭州 310006；*通訊聯(lián)系人，E-mail:fuqiang@caas.cn;yxp@cjlu.edu.cn)

TANGYaohua,WANPinjun,HAOPeiying,etal.Rolesoftwogenesinvolvedinhistidinebiosyntheticpathwayinyeast-likesymbiontindevelopmentofNilaparvata lugens (St?l).ChinJRiceSci, 2016, 30(4): 406-416.

唐耀華, 萬品俊, 郝培應(yīng), 等. 類酵母共生菌中兩個組氨酸合成基因在褐飛虱發(fā)育中的作用. 中國水稻科學(xué)， 2016， 30(4)： 406-416.

摘要:褐飛虱[Nilaparvata lugens (St?l)]是我國水稻上的主要害蟲，專一性吸食必需氨基酸缺乏的水稻篩管液。利用基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，人們構(gòu)建了褐飛虱及其體內(nèi)類酵母共生菌(YLS)參與組氨酸等必需氨基酸的合成途徑。在此基礎(chǔ)上，本研究旨在通過基因克隆和RNA干擾研究YLS的His2和His6(分別命名為EdeHis2和EdeHis6)在褐飛虱生長、發(fā)育和存活中的作用。同源搜索和系統(tǒng)發(fā)育分析表明EdeHis2和EdeHis6均源于YLS基因組，與綠僵菌His2和His6高度同源并在系統(tǒng)發(fā)育樹中形成一個簇，但在褐飛虱基因組中無同源基因?；虻臅r空表達(dá)分析表明，His2和His6在褐飛虱的各個齡期均表達(dá)且呈現(xiàn)一定的波動性，在褐飛虱脂肪體中的表達(dá)量均顯著高于頭、足、體壁和中腸。此外，在褐飛虱頭和翅的基因組中未能擴(kuò)增到目的片段，而在腹部能擴(kuò)增出目的片段。分別注射外源雙鏈RNA(dsEdeHis2或dsEdeHis6)后的第2、4、6天，EdeHis2的表達(dá)量分別顯著下調(diào)45%～60%，EdeHis6下調(diào)27%～55%。dsEdeHis2和dsEdeHis6分別使褐飛虱的死亡率提高了8.3%和9.2%，雌、雄蟲的若蟲期歷期延長了0.43 d、0.33 d和0.65 d、0.36 d，但均未達(dá)到顯著水平。另外，注射dsEdeHis6的褐飛虱雌雄成蟲翅畸形率分別為11%和13%，顯著高于對照組。綜上所述，源于YLS的EdeHis2和EdeHis6參與褐飛虱組氨酸的合成，與褐飛虱的存活、發(fā)育和翅發(fā)育相關(guān)。

關(guān)鍵詞:褐飛虱； 組氨酸； 類酵母共生菌； His2； His6； RNA干擾

褐飛虱[Nilaparvatalugens (St?l)]是主要的水稻害蟲，專一性吸食水稻篩管液，嚴(yán)重威脅我國乃至許多亞洲國家的水稻生產(chǎn)[1, 2]。褐飛虱能夠利用氨基酸不平衡的水稻汁液，一般認(rèn)為其體內(nèi)的共生菌具有營養(yǎng)補(bǔ)償作用[3, 4]。人為減除褐飛虱類酵母共生菌(YLS)之后，褐飛虱表現(xiàn)出發(fā)育遲緩，存活率降低；對組氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸等必需氨基酸的需求量增加[3-5]。

組氨酸對多數(shù)昆蟲來說是必需氨基酸，一般需要從食物中攝取，而褐飛虱等半翅目昆蟲，其所吸食水稻汁液中的組氨酸等必需氨基酸卻相對匱乏[6]。利用褐飛虱、YLS的基因組[7]和轉(zhuǎn)錄組[8]的研究結(jié)果表明，YLS基因組中含有參與編碼組氨酸合成相關(guān)酶的所有基因，而在褐飛虱基因組中未發(fā)現(xiàn)。此外，也有研究表明，缺失組氨酸的人工飼料持續(xù)飼養(yǎng)褐飛虱后，能顯著影響褐飛虱的羽化率[9]。由此推測，YLS合成的組氨酸對褐飛虱的生長發(fā)育具有重要的作用。然而，截至目前，尚未見關(guān)于褐飛虱中編碼組氨酸合成相關(guān)酶的基因克隆和功能分析，特別是缺乏這些基因?qū)诛w虱發(fā)育作用的生物學(xué)證據(jù)。

為研究褐飛虱中YLS合成的組氨酸對褐飛虱生長的作用，本研究利用在YLS基因組中檢索到的兩個組氨酸合成關(guān)鍵基因分別能編碼組氨醇磷酸磷酸化酶(His2)和磷酸核糖亞氨甲基-5-氨基咪唑-甲酰胺核糖核苷酸異構(gòu)酶(His6)。對其進(jìn)行基因克隆、序列特征鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測其在褐飛虱中的時空表達(dá)，進(jìn)一步通過RNA干擾技術(shù)研究該基因?qū)诛w虱生長發(fā)育及存活的影響，以期揭示YLS參與組氨酸合成及其對褐飛虱的重要性。

1材料與方法

1.1供試?yán)ハx

實驗所用蟲源為中國水稻研究所培育的褐飛虱TN1種群，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(27±1)℃，相對濕度為(80±10)%，光周期16h光照/8h黑暗。

1.2總RNA的提取和cDNA第一鏈合成

1.2.1樣品準(zhǔn)備

取20頭產(chǎn)卵盛期的褐飛虱雌成蟲接到TN1水稻苗上，待產(chǎn)卵1d后剪下莖稈并在解剖鏡下剝離卵塊(50粒)，放入1.5mL的eppendorf管中。采用類似的方法收集1～5齡若蟲及初羽化雌雄成蟲(1日齡)各40頭。另外，選取80頭初羽化雌成蟲并在解剖鏡下分離頭(Head)、足(Leg)、體壁(Integument)、中腸(Midgut)、卵巢(Ovary)和脂肪體(Fatbody)置于1.5mLeppendorf管中。以上每處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。所有樣品用液氮速凍后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2總RNA提取

褐飛虱總RNA的提取采用Qiagen公司生產(chǎn)的總RNA提取試劑盒(RNeasyMiniKit，Qiagen,Valencia,CA)，提取方法參照試劑盒說明書。利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(Nano-Drop1000spectrophotometer,ThermoFisherScientific,Rockford,USA)檢測RNA的完整性和濃度，用于cDNA第一鏈的合成。

1.2.3cDNA第一鏈合成

cDNA第一鏈的合成采用Toyobo公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ReverTraAceqPCRRTkit,ToyoboCo.LTD,Osaka,Japan)，操作參照試劑盒說明書進(jìn)行，模板濃度為1μg，以O(shè)ligdT為引物，合成cDNA第一鏈。

1.3基因檢索、克隆與序列分析

分別檢索褐飛虱、YLS(Fan等[10]將其命名為Entomomyces delphacidicolastr.NLU)和殺雄菌(Arsenophonus nilaparvatae)的基因組[7]，僅在YLS基因組中找到兩條單拷貝基因，分別能編碼組氨醇磷酸磷酸化酶(His2)和磷酸核糖亞氨甲基-5-氨基咪唑-甲酰胺核糖核苷酸異構(gòu)酶(His6)。利用PrimerPremier5.0設(shè)計引物(表1)對其進(jìn)行RT-PCR克隆。以混合褐飛虱各齡期cDNA的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下： 10×ExTaq 緩沖液 2.500μL，dNTPs(2.5mmol/L)2.000μL，正、反向引物(10mmol/L)各1.000μL，ExTaq酶0.125μL，cDNA模板1.000μL，雙蒸水17.375μL。反應(yīng)條件如下：94℃下預(yù)變性5min，94℃下變性30s，58℃下退火45s，72℃下延伸1min，38個循環(huán)，72℃下延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收后連于TOPO2.1載體(Invitrogen,Carlsbad,CA)上，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞(Novagen,Darmstadt,Germany)中，隨機(jī)挑選10個單克隆在ABI3730測序儀上進(jìn)行雙端測序。

通過EXPASY的ComputepI/Mw工具(http://web.expasy.org/compute_pi/)預(yù)測蛋白的分子量和等電點。利用ClustalW軟件[11]進(jìn)行多序列比對，MEGA6軟件[12]繪制進(jìn)化樹，均采用默認(rèn)參數(shù)。

1.4基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增

在解剖鏡下分離出褐飛虱(羽化后1d)雌成蟲的頭(Head)、翅(Wing)和腹(Abdomen)，置于1.5mL的eppendorf管中，參照王渭霞[13]等的方法提取基因組DNA。用分光光度計測量DNA濃度，設(shè)計PCR引物(跨內(nèi)含子)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件同1.3。每個處理分別設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)和3個生物學(xué)重復(fù)。

1.5dsRNA的合成與生物測定

采用Ambion試劑盒(MEGAscriptT7HighYieldTranscriptionkit,Austin,USA)進(jìn)行dsRNA體外轉(zhuǎn)錄。按照試劑盒說明書，取8μL純化后的DNA模板，加入10×T7 緩沖液2μL，T7酶預(yù)混液2μL，ATP、GTP、CTP、UTP各2μL，37℃下溫浴5h，隨后置于72℃下處理5min。冷卻至常溫后加入21μL無核酸酶的水，5μL10×消化緩沖液，2μL脫氧核糖核酸酶和2μL核糖核酸酶,在37℃下溫浴45min以去除剩余DNA模板及單鏈RNA，用醋酸鈉和乙醇純化dsRNA。在分光光度計下測量dsRNA的濃度，根據(jù)濃度加入不同體積的無核糖核酸酶的水，使dsRNA濃度為1.5μg/μL。

注射dsRNA參照本實驗室的方法[14, 15]。選取褐飛虱3齡1日若蟲(150頭)，通過顯微注射儀將目的基因dsRNA或dsGFP注射至試蟲體內(nèi)(每頭50nLdsRNA)。注射1d后，移除死亡的褐飛虱，隨后逐日觀察試蟲的存活數(shù)、若蟲發(fā)育情況及表型。此外，以150頭不做任何注射的試蟲為空白對照組(CK)。在處理后的第2、4、6天分別取10頭試蟲用于總RNA提取，用于實時熒光定量PCR(RT-qPCR)。每處理分別設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)和生物學(xué)重復(fù)。

1.6RT-qPCR

RT-qPCR分析采用Toyobo公司生產(chǎn)的SYBRGreenMix試劑盒，參考操作說明，反應(yīng)體系共20.0μL，包括6.4μLddH2O，10μLTaq酶預(yù)混液，10.0μmol/L上下游引物各0.8μL，2.0μL模板?；虻南鄬Ρ磉_(dá)量采用2-△△CT法[16]計算，內(nèi)參選用NlRPS11、NlRPS15[16，17]。

1.7數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[18]，采用單因素方差分析(One-wayANOVA)或雙因素方差分析(Two-wayANOVA)，并采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較；百分?jǐn)?shù)用反正弦平方根轉(zhuǎn)換。文中所用數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)。

2 結(jié)果與分析

2.1EdeHis2和EdeHis6基因的克隆與序列分析

本研究克隆得到了YLS基因組中兩個參與組氨酸合成的基因，分別命名為EdeHis2和EdeHis6

表1RT-PCR、dsRNA合成和qPCR引物

Table1.PrimersusedforRT-PCR,dsRNAsynthesisandqPCR.

引物名稱Primername正向引物(5'-3')Forwardsequence(5'-3')反向引物(5'-3')Reversesequence(5'-3')擴(kuò)增長度Ampliconsize/bp基因克隆Geneclone EdeHis2CAAAAGCTTGACCCTCCCCTCTACAGGTCGCGCTCCTCATA378 EdeHis6GCTCTCCCTCGGAATGACGTGACCTAGGAGCTGCTTTTCC830基因組PCRGenomicPCR gEdeHis2GAGCCTTTAGAAACGCCAGTCCGAGTGAGAGTGCATAGTGA125 gEdeHis6AGACAGTGACGGACATGGAGACCAAGTCCTCGTCGATACC124 gNlRPS11CCGATCGTGTGGCGTTGAAGGGATGGCCGACATTCTTCCAGGTCC159雙鏈RNA合成dsRNAsynthesis dsGFPT7-CCTGAAGTTCATCTGCACCACT7-TGATGCCGTTCTTCTGCTTGT355 dsEdeHis2T7-TTCGGTGTCCTCGTTCCTTCT7-CAGGTCGCGCTCCTCATATC272 dsEdeHis6T7-TCAGACCAACTACGTGTCGCT7-CGGAACAGTACGGCTCAAGT440定量PCRReal-timequantitativePCR qEdeHis2GAGCCTTTAGAAACGCCAGTCCGAGTGAGAGTGCATAGTGA125 qEdeHis6AGACAGTGACGGACATGGAGACCAAGTCCTCGTCGATACC124 qNlRPS11CCGATCGTGTGGCGTTGAAGGGATGGCCGACATTCTTCCAGGTCC159 qNlRPS15TAAAAATGGCAGACGAAGAGCCCAATTCCACGGTTGAAACGTCTGCG150

(GenBank登錄號分別為：KU664333和KU664334)。EdeHis2開放閱讀框(openreadingframe，ORF)全長858bp，編碼285個氨基酸，預(yù)測蛋白分子量為32.1kD，等電點為5.91。EdeHis6的ORF全長813bp，編碼270個氨基酸，預(yù)測蛋白分子量為29.6kD，等電點為6.09。

EdeHis2編碼的推導(dǎo)蛋白質(zhì)包含14個α螺旋和11個β折疊(圖1-A)，其中α1～α14和β1～β10組成組氨醇磷酸聚合酶結(jié)構(gòu)域(Polymeraseandhistidinolphosphatase，PHP)，這一結(jié)構(gòu)是典型的組氨酸合成酶PHP的結(jié)構(gòu)域。多序列比對表明EdeHis2與其同源基因的相似性達(dá)到48%～75%，其中與綠僵菌(Metarhizium guizhouense)His2的相似性最高(75%)，其次是明尼蘇達(dá)被毛孢(Hirsutella minnesotensis)、偏側(cè)蛇蟲草菌(Ophiocordyceps unilateralis)和葡萄穗霉菌(Stachybotrys chlorohalonata)(均為72%)。此外，基于鄰接法(neighbor-joining，NJ)對10種真菌His2和EdeHis2系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)EdeHis2與綠僵菌His2聚為一支，并與尖孢鐮刀菌、白僵菌His2構(gòu)成肉座菌目(圖2-A)。

在EdeHis6方面，其推導(dǎo)的編碼產(chǎn)物包含11個α螺旋和15個β折疊(圖1-B)，其中α1～α10和β1～β14組成His_biosynth結(jié)構(gòu)域。多序列比對表明，EdeHis6與綠僵菌His6等序列相似性達(dá)57～87%，其中與綠僵菌、明尼蘇達(dá)被毛孢(Hirsutellan minnesotensis)His6的相似性最高(均為87%)。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，整個系統(tǒng)進(jìn)化樹被分成了兩個簇，一個由真菌His6組成，另一個由細(xì)菌His6組成，其中EdeHis6與綠僵菌His6在進(jìn)化關(guān)系上最為接近(圖2-B)。

2.2EdeHis2和EdeHis6的表達(dá)分析

單因素方差分析結(jié)果表明，EdeHis2在褐飛虱不同器官或組織中的表達(dá)差異顯著(P=0.014)，其中，脂肪體中表達(dá)量最高，顯著高于中腸、頭、足和表皮，與卵巢中的表達(dá)量無顯著差異(圖3-A)。EdeHis6的表達(dá)量在褐飛虱卵巢中最高，其次是脂肪體，均顯著高于其在中腸、頭、足和表皮的表達(dá)量(P=0)(圖3-B)。EdeHis2和EdeHis6在褐飛虱的各個齡期均表達(dá)，EdeHis2的表達(dá)量在卵期最高，隨著齡期逐漸降低，至成蟲期最低(P=0)(圖3-C)；EdeHis6在一齡期表達(dá)最高，三齡和五齡次之，在卵和成蟲中表達(dá)量最低(P=0)(圖3-D)?；蚪MPCR結(jié)果表明，EdeHis2和EdeHis6分別能在腹部基因組DNA中擴(kuò)增出目的條帶，而在頭基因組DNA和翅基因組DNA不能擴(kuò)增出目的條帶(圖3-E)。

2.3dsRNA對EdeHis2和EdeHis6表達(dá)的影響

二因素方差分析結(jié)果表明，注射dsEdeHis2與對照相比，EdeHis2的表達(dá)量有顯著差異(P=0)，注射后2、4、6d之間沒有顯著差異(P=0.16)。熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，與空白對照組相比，注射dsEdeHis2后的第2、4、6天，EdeHis2表達(dá)量分別顯著下調(diào)45%、60%和49%，而注射dsGFP的試蟲與空白對照組無差異(圖4-A)。與之類似，二因素方差分析結(jié)果表明注射dsEdeHis6后EdeHis6的mRNA水平較CK相比存在顯著差異(P=0)，但注射后的第2、4、6天對EdeHis6無顯著影響(P=0.90)。注射dsEdeHis6后的第4、6天，EdeHis6的mRNA水平較CK相比顯著下調(diào)47%、55%(圖4-B)，而EdeHis6表達(dá)量在注射后的第2天僅下調(diào)27%，與CK沒有顯著差異。與CK相比，注射dsGFP后第2、4、6天試蟲的EdeHis6表達(dá)量均沒有顯著差異。

2.4dsRNA對褐飛虱生長、發(fā)育的影響

單因素方差分析結(jié)果表明，注射dsEdeHis2或dsEdeHis6對褐飛虱的死亡率無顯著影響(P=0.065)，對雌雄蟲的若蟲發(fā)育歷期均無顯著影響(P=0.76，P=0.18)。分別注射dsEdeHis2或dsEdeHis6之后，褐飛虱的死亡率分別為(10.00±2.00)%和(10.89±2.89)%，與空白對照(1.67±1.67)%相比顯著高了8.3%(圖5-A)和9.2%(圖5-B)。另外，注射dsGFP褐飛虱的死亡率(4.57±2.52)%與CK相比無顯著差異。分別注射dsEdeHis2或dsEdeHis6之后，褐飛虱雄蟲的若蟲發(fā)育歷期分別為(7.98±0.10)d和(8.21±0.32)d，與空白對照組(7.56±0.15)d相比，延長0.43d和0.65d；雌蟲的若蟲發(fā)育歷期分別為(8.66±0.05)d和(8.69±0.56)d，與對照(8.33±0.24)d相比，延長0.33d和0.36d，但均未達(dá)到顯著差異水平(圖5-C～D)。

注射dsEdeHis6的褐飛虱羽化至成蟲時，雌蟲的翅發(fā)育不完全(11%)，雄蟲的翅呈現(xiàn)彎折(13%)，雌雄蟲的舊表皮均不能完全褪下(圖6-A～B)。注射dsGFP褐飛虱雌雄蟲的翅發(fā)育正常(圖6-C～D)。此外，注射EdeHis2褐飛虱成蟲未發(fā)現(xiàn)明顯異常表型。

His2同源物種的簡寫及orthoDB登錄號：Ede， 褐飛虱類酵母共生菌；Mac， 綠僵菌，E9DRU4；Fox， 尖孢鐮刀菌，J9N254；Dha， 德巴利氏酵母，B5RTB4。His6同源物種的簡寫及登錄號：Ede， 褐飛虱類酵母共生菌；Mac， 綠僵菌，E9DSK3；Fox， 尖孢鐮刀菌，F(xiàn)9G3J5；Sce， 釀酒酵母，A6ZVP7。

OriginspeciesofHis2andtheirorthoDBaccessionnumbers:Ede, Entomomyces delphacidicola;Mac, Metarhizium acridumCQMa102,E9DRU4;Fox, Fusarium oxysporum,J9N254;Dha, Debaryomyce shansenii,B5RTB4.OriginspeciesofHis6andtheirorthoDBaccessionnumbers:Ede,Entomomyces delphacidicola;Mac, Metarhizium acridum,E9DSK3;Fox, Fusarium oxysporum,F9G3J5;Sce, Saccharomyces cerevisiae,A6ZVP7.

圖1His2(A)和His6(B)氨基酸序列的多序列比對

Fig. 1.AminoacidsequencealignmentsofHis2 (A)andHis6(B)withtheirhomologues.

His2來源及orthoDB登錄號： 綠僵菌，E9DRU4； 尖孢鐮刀菌，J9N254； 德巴利氏酵母，B5RTB4； 熱帶假絲酵母，C5MGD3； 木糖發(fā)酵酵母，G3AV99； 黃萎病菌，G2XJV7； 炭疽菌，H1W439； 白僵菌，J4VYI6； 黑斑病菌，K1WGV8； 灰霉病菌，M7U2Q0。His6來源及登錄號： 綠僵菌，E9DSK3； 蛹蟲草，G3J516； 釀酒酵母，A6ZVP7； 熱帶假絲酵母，C5MDV0； 德巴利氏酵母，Q6BUV9； 木糖發(fā)酵酵母，G3AV99； 黃萎病菌，G2X7U1； 炭疽菌，H1V6J4； 白僵菌，J4VYI6； 黑斑病菌，K1WJH6； 灰霉病菌，M7U4B5； 雙胞蘑菇，K5XY72； 灰蓋鬼傘，A8NXH0； 伯克氏菌，CBW74635.1； 大腸桿菌，CCQ29416.2。

OriginofHis2andtheiraccessionnumbers: Metarhizium acridumCQMa,E9DRU4; Fusarium oxysporum,J9N254; Debaryomyces hansenii,B5RTB4; Candida tropicalisMYA-3404,C5MGD3; Spathaspora passalidarum,G3AV99; Verticillium dahlia,G2XJV7; Colletotrichum higginsianum,H1W439;Beauveria bassianaARSEF2860,J4VYI6; Marssonina brunneaf.sp. ,K1WGV8; Botryotinia fuckeliana,M7U2Q0.OriginofHis6andtheiraccessionnumbers: Metarhizium acridumCQMa,E9DSK3;Cordyceps militarisCM01,G3J516; Saccharomyces cerevisiaeYJM789,A6ZVP7; Candida tropicalisMYA-3404,C5MDV0; Debaryomyces hansenii,Q6BUV9; Spathaspora passalidarum,G3AV99;Verticillium dahlia,G2X7U1; Colletotrichum higginsianum,H1V6J4; Beauveria bassianaARSEF2860,J4VYI6; Marssonina brunneaf.sp.,K1WJH6; Botryotinia fuckeliana,M7U4B5; Agaricus bisporus,K5XY72; Coprinopsis cinerea,A8NXH0; Burkholderiar hizoxinica,CBW74635.1; Escherichia coli,CCQ29416.2.

圖2His2(A)和His6(B)氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析(鄰接法)

Fig. 2.PhylogeneticanalysisofEdeHis2(A)andEdeHis6 (B)bytheneighbor-joiningmethod.

Mg-中腸；He-頭；Le-足；In-體壁；Ov-卵巢；Fb-脂肪體;Egg-卵；1st、2nd、3rd、4th、5th：1-5齡褐飛虱；F-雌成蟲；M-雄成蟲. 圖中數(shù)據(jù)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；n=2)上不同小寫字母者表示差異達(dá)5%顯著水平(Duncan新復(fù)極差法)。下同。

Mg,Midgut;He,Head；Le,Leg；In,Integument；Ov,Ovary；Fb,Fatbody. 1stto5thindicate1st- 5thinstarnymph,respectively；F,Femaleadult；M,Maleadult.Values(mean±SE, n=2)markedbydifferentlowercaselettersaresignificantlydifferentatthe5%levelbytheDuncan’stest.Thesameasinfiguresbelow.

圖3EdeHis2和EdeHis6的組織(A、B、E)和齡期(C、D)表達(dá)

Fig.3.Tissuespecific(A,BandE)andtemporal(CandD)expressionpatternsofEdeHis2andEdeHis6.

3討論

2014年公布的褐飛虱基因組、YLS基因組和殺雄菌(Ars)基因組[7]揭示了褐飛虱體內(nèi)氨基酸合成的代謝途徑及其基因的來源。本研究克隆的EdeHis2、EdeHis6均源于YLS基因組，而在褐飛虱基因組、Ars基因組中均未檢索到編碼His2和His6的基因或同源序列。組氨酸是褐飛虱的必需氨基酸，其參與合成的基因在褐飛虱基因組及Ars基因組中均缺失。然而，YLS中EdeHis2、EdeHis6分別與真菌的His2或His6高度同源，且具有典型α螺旋、β折疊和結(jié)構(gòu)域，這表明EdeHis2和EdeHis6可能作為功能蛋白參與YLS合成組氨酸的過程，而褐飛虱則不參與這一過程。此外，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，EdeHis2、EdeHis6均與肉座菌目中綠僵菌同源基因在進(jìn)化關(guān)系上接近，這和Xue等基于基因組的研究結(jié)果一致[7]。與此同時，不同組織或器官表達(dá)譜結(jié)果表明EdeHis2、EdeHis6在褐飛虱脂肪體中的表達(dá)量顯著高于中腸、頭、足和表皮的表達(dá)量。前人研究表明YLS主要存在于褐飛虱腹部脂肪體中，不存在于頭、足、表皮等組織[19, 20]，本研究結(jié)果與之較為類似。另外，基因組PCR結(jié)果表明，EdeHis2和EdeHis6能夠在腹部基因組中擴(kuò)增出目的條帶，而在不存在YLS的頭和翅中未擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶。由此可見，本研究克隆的EdeHis2、EdeHis6源于YLS。

圖4注射dsRNA后第2、4、6天EdeHis2(A)和EdeHis6(B)的表達(dá)量

Fig. 4.EffectsofinjectionofdsRNAonthemRNAlevelofEdeHis2 (A)andEdeHis6 (B).

圖5注射dsRNA對褐飛虱死亡率(A、B)和若蟲發(fā)育歷期(C、D)的影響

Fig. 5.Mortality(A，B)andnymphduration(C，D)ofN. lugensasaffectedbydsRNAinjection.

YLS向褐飛虱提供氨基酸營養(yǎng)，當(dāng)人為移除褐飛虱體內(nèi)的YLS后，褐飛虱表現(xiàn)為生長緩慢[4, 21, 22]。分別注射dsEdeHis2或dsEdeHis6后，褐飛虱的死亡率顯著升高、若蟲發(fā)育歷期略微延長，這表明干擾EdeHis2或EdeHis6對褐飛虱生長、發(fā)育、存活有一定的負(fù)面作用。這與Wan等[6]的研究結(jié)果類似，干擾源于YLS的Lys合成基因SDH，試蟲的死亡率和發(fā)育歷期均顯著升高。此外，本研究干擾EdeHis6后的褐飛虱翅表現(xiàn)為畸形，這一表型變化與干擾Lys代謝相關(guān)基因引發(fā)的畸形較為相似[6, 23]。由此可見，EdeHis6在褐飛虱的發(fā)育和翅型發(fā)育中具有重要的作用。這一調(diào)節(jié)過程可能是氨基酸不同代謝途徑交叉調(diào)節(jié)的現(xiàn)象導(dǎo)致[24]。組氨酸代謝與嘌呤、葉酸、色氨酸和甲硫氨酸等有著重要的關(guān)系[25-27]。EdeHis6基因編碼的酶ProFAR-I催化合成的PRFAR可以用于合成嘌呤、硫胺素焦磷酸和甲硫氨酸[28]。EdeHis6基因的沉默會導(dǎo)致PRFAR不能合成，而干擾EdeHis2不會影響PRFAR的合成，但會導(dǎo)致PRFAR的積累。注射EdeHis6的褐飛虱出現(xiàn)了翅畸形，而注射EdeHis2的褐飛虱未出現(xiàn)，表明PRFAR合成的缺失可能導(dǎo)致嘌呤、硫胺素焦磷酸和甲硫氨酸等的合成減少，進(jìn)而影響翅的發(fā)育。

圖6注射dsEdeHis6后羽化的雄雌蟲(A、B)和注射dsGFP后羽化的雌雄蟲(C、D)

Fig. 6.EffectsofdsEdeHis6 (A,B)anddsGFP(C,D)onthewingsdevelopmentofN.lugens.

綜上所述，來源于YLS的EdeHis2和EdeHis6參與褐飛虱組氨酸的合成，與褐飛虱的死亡率、發(fā)育歷期和翅型的發(fā)育相關(guān)。

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收稿日期:2016-02-22； 修改稿收到日期: 2016-03-24。

基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(31371939)； 國家科技支撐計劃資助項目(2012BAD19B03)。

中圖分類號:S435.112+.3; S476.12

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

文章編號:1001-7216(2016)04-0406-11

RolesofTwoGenesInvolvedinHistidineBiosyntheticPathwayinYeast-LikeSymbiontinDevelopmentofNilaparvata lugens (St?l)

TANGYao-hua1,2,WANPin-jun2,HAOPei-ying1,FUQiang2, *,YUXiao-ping1, *

(1ZhejiangProvincalKeyLaboratoryofBiometrologyandInspectionandQuarantine,CollegeofLifeScience,ChinaJiliangUniversity,Hangzhou310018,China;2StateKeyLaboratoryofRiceBiology,ChinaRiceResearchInstitute,Hangzhou310006,China;*Correspondingauthor,E-mail:fuqiang@caas.cn;yxp@cjlu.edu.cn)

Abstract:Nilaparvata lugens is a serious phloem-feeding pest of rice in China. Based on genome and transcriptome data of N.lugens and yeast-like symbiont (YLS, also named Entomomyces delphacidicola str. NLU), the major biosynthesis pathways for amino acids in N.lugens were constructed. In this study, we cloned two genes, EdeHis2 and EdeHis6, which catalyze critical steps in histidine biosynthesis pathway, and revealed the negative effects of double-stranded RNA (dsRNA) on the growth, development and survival rate of N.lugens. Homology searches and phylogenetic analysis showed that EdeHis2 and EdeHis6 origin from YLS genome, share high similarities with that of Metarhizium acridum and formed a clad in the phylogenetic tree, whereas no His2- or His6-like genes was found in N.lugens genome. Temporal expression profiles of EdeHis2 and EdeHis6 showed that both genes were ubiquitously but unevenly expressed among the different life stages, and the spatial expression pattern showed they have higher expression levels in the fat body rather than head, leg, integument and midgut. Furthermore, no target products were amplified in head and wing genomic DNA of N. lugens, rather than that in abdomen genomic DNA. At two, four and six days after dsEdeHis2 or dsEdeHis6 injection, the mRNA abundance of target genes was decreased by 45%-60% (EdeHis2)or 27%-55% (EdeHis6), comparing with blank control.Down-regulation of EdeHis2 or dsEdeHis6 slightly increased the mortality by 8.3% or 9.2%, and delayed the nymphal duration of male and female by 0.43 and 0.65 day and 0.33 and 0.36 day, respectively. Moreover, both male (11%) and female adult (13%) showed wing deformation after injection of dsEdeHis6, higher than that in the blank control. In conclusion, EdeHis2 and EdeHis6 that origin from YLS were involved in histidine biosynthesis pathway, contributed to the survivor, development and wing formation of N. lugens.

Key words:Nilaparvata lugens; yeast-like symbiont; histidine; His2; His6; RNAi